動(dòng)物酶工程與蛋白質(zhì)工程

酶的發(fā)酵生產(chǎn)DNA重組含義BA酶的發(fā)酵生產(chǎn)概念微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)酶的發(fā)酵生產(chǎn)1、概念1.1.1、產(chǎn)酶細(xì)胞1.1.2優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞應(yīng)具備的條件1.1.3微生物作為酶生產(chǎn)來源的主要原因1.1.4酶發(fā)酵生產(chǎn)的流程

1.1概念

指利用產(chǎn)酶細(xì)胞在適宜的發(fā)酵工藝條件下生產(chǎn)酶制劑的過程。酶的發(fā)酵生產(chǎn)1.1.1產(chǎn)酶細(xì)胞

微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞。條件1.1.2優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞應(yīng)具備的條件05安全可靠04利于酶的分離純化03產(chǎn)酶穩(wěn)定性好01酶的產(chǎn)量高02容易培養(yǎng)和管理主要原因011.1.3微生物作為酶生產(chǎn)來源的主要原因1.1.3微生物作為酶生產(chǎn)來源的主要原因（一）微生物生長(zhǎng)繁殖快，產(chǎn)量高（二）微生物培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單（三）微生物菌株種類繁多。（四）有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力。1.1.4酶發(fā)酵生產(chǎn)的流程選擇合適的產(chǎn)酶菌株微生物生長(zhǎng)、繁殖微生物合成所需酶

酶的分離、純化酶制劑微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)2.1概念2.2發(fā)酵工藝條件及控制

2.2.1產(chǎn)酶細(xì)胞的保藏（低溫）2.2.2細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)2.2.3培養(yǎng)基的配制微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)2.1概念

微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)是指在人工控制的條件下，有目的地利用微生物培養(yǎng)來生產(chǎn)所需的酶。所需技術(shù)包括培養(yǎng)基和發(fā)酵方式的選擇及發(fā)酵條件的控制。2.2.1產(chǎn)酶細(xì)胞的保藏（低溫）:0~4℃2.2發(fā)酵工藝條件及控制2.2.2細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)2.2.3培養(yǎng)基的配制（一）碳源：2、酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的碳源甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料。

1、選擇原則：①營養(yǎng)②對(duì)酶生物合成具有調(diào)節(jié)作用③原料的供求和價(jià)格氮源01選擇原則（二）氮源

①根據(jù)不同的細(xì)胞要求選擇；②注意C/N比。02常用的氮源

豆餅、花生餅、菜籽餅等；（三）無機(jī)鹽

產(chǎn)酶培養(yǎng)基常需添加一定量的無機(jī)鹽，主要有：P、S、K、Mg、Ca、Na鹽等。在微生物發(fā)酵中，應(yīng)特別注意有些金屬離子是酶的組成成分，如鈣離子是淀粉酶的成分之一，也是芽孢形成所必須的。2.2.3培養(yǎng)基的配制（四）生長(zhǎng)因子

一般來源于玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏等。（五）pH值的調(diào)節(jié)

pH的變化常引起細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶環(huán)境的變化，對(duì)產(chǎn)酶帶來不利的影響。在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)根據(jù)微生物的需要調(diào)節(jié)pH。一般情況下，多數(shù)細(xì)菌和放線菌生長(zhǎng)的最適pH為中性至微堿性，而霉菌和酵母則偏好微酸性。2.2.3培養(yǎng)基的配制生產(chǎn)中常采取調(diào)控pH的方法：01

添加緩沖液維持一定的pH；02

調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位在一定范圍；03

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的原始pH，保持一定C/比；04

當(dāng)發(fā)酵液pH過高時(shí)，用糖或淀粉來調(diào)節(jié)，pH過低時(shí)，通過調(diào)節(jié)。學(xué)習(xí)總結(jié)：1、酶的發(fā)酵生產(chǎn)概念2、微生物作為酶生產(chǎn)主要來源的原因3、微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)中培養(yǎng)基配制的要求。蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)工程的含義蛋白質(zhì)工程的含義1、基本概念及實(shí)質(zhì)

蛋白質(zhì)工程就是在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)是對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行改造。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的層次結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)肽鏈的三維構(gòu)象四級(jí)結(jié)構(gòu)多亞基復(fù)合物β螺旋蛋白質(zhì)工程的原理蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)中心法則ReversetranscriptionSingle-strandedDNADNARNATranscriptionandreplcationNCproteinTranscriptionTranslactionDNAreplcation蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)分子設(shè)計(jì)的層次｛基因水平的改造：改造蛋白質(zhì)的編碼基因蛋白質(zhì)水平的改造：蛋白質(zhì)的加工與修飾總結(jié)總結(jié)蛋白質(zhì)工程的含義蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)蛋白質(zhì)工程的原理思考題生物體內(nèi)蛋白質(zhì)執(zhí)行哪些生理功能？蛋白質(zhì)工程的研究方法蛋白質(zhì)工程的基本途徑蛋白質(zhì)工程的研究策略1.蛋白質(zhì)工程的基本途徑

從預(yù)期功能出發(fā)，設(shè)計(jì)期望的結(jié)構(gòu)，合成目的基因且有效克隆表達(dá)或通過誘變、定向修飾和改造等一系列工序，合成新型優(yōu)良蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程的主要研究手段

蛋白質(zhì)工程的主要研究手段

蛋白質(zhì)工程的研究策略策略1：對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造。研究策略策略2：完全重建一個(gè)新的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)（1）設(shè)計(jì)目標(biāo)的選擇研究重點(diǎn)和難點(diǎn)從結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出發(fā)，從蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)開始，以摸索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)功能設(shè)計(jì)、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。（2）蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)思路

是否存在蛋白質(zhì)多聚體狀態(tài)；二級(jí)結(jié)構(gòu)與預(yù)期目標(biāo)是否吻合。是否具有預(yù)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)。圓二色譜和核磁共振技術(shù)可用于研究蛋白質(zhì)。是否以單分子或多聚體形式存在。三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定目前主要依靠熒光和核磁共振技術(shù)。蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)

天然的鋅指多肽FSD-1多肽(從頭設(shè)計(jì))蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)改變現(xiàn)有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)；分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。根據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物，克隆目的基因。根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及蛋白質(zhì)改造的目的設(shè)計(jì)改造方案。對(duì)目的基因進(jìn)行人工定點(diǎn)突變。改造后的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。分離純化表達(dá)的蛋白質(zhì)并分析其功能，評(píng)價(jià)是否達(dá)到設(shè)計(jì)目的。維生素發(fā)酵生產(chǎn)我國用兩步法發(fā)酵工藝生產(chǎn)維生素C。定點(diǎn)突變是目前蛋白質(zhì)工程研究的主要技術(shù)手段。

基因人工定點(diǎn)突變改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

M13載體法PCR擴(kuò)增法蛋白質(zhì)工程的研究策略(1）M13載體法

該法的原理是利用人工合成帶突變位點(diǎn)的寡聚核苷酸作為引物，利用M13噬菌體載體系統(tǒng)合成突變基因。蛋白質(zhì)工程的研究策略M13載體蛋白質(zhì)工程的研究策略

M13載體法基因人工定點(diǎn)突變示意圖（引自吳乃虎，1998）(2）ＰＣＲ擴(kuò)增法

該法的原理也是利用人工合成帶突變位點(diǎn)的誘變引物，通過ＰＣＲ擴(kuò)增而獲得定點(diǎn)突變的基因。PCR定點(diǎn)誘變法可分為重組PCR定點(diǎn)誘變法和大引物誘變法兩種。一、深層發(fā)酵的操作方式蛋白質(zhì)工程的研究策略

重組PCR定點(diǎn)突變法示意圖（引自吳乃虎，1998）蛋白質(zhì)工程的研究策略

重組PCR定點(diǎn)突變法示意圖（引自吳乃虎，1998）蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例概念

胰蛋白酶(EC3.4.21.4)是絲氨酸蛋白酶類，它是一條單鏈肽，由223個(gè)氨基酸殘基組成，N末端為異亮氨酸。主要作用于精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。胰蛋白酶極易自溶，自溶產(chǎn)物經(jīng)層析分離后，會(huì)得到4個(gè)具有胰蛋白酶活性的片段。通過對(duì)N末端殘基的分析，表明這些活性產(chǎn)物是由于Arg117-Val118、Lys145-Ser146及Lys159-Ala160處發(fā)生了斷裂而出現(xiàn)的。人們運(yùn)用字蛋白質(zhì)工程手段,對(duì)Arg117位自溶點(diǎn)進(jìn)行了缺失突變，最終得到了穩(wěn)定性明顯提高的突變株。一、胰蛋白酶二、金屬硫蛋白

金屬硫蛋白(metallotlnonein,MT)是由微生物和植物產(chǎn)生的金屬結(jié)合蛋白，是一類富含半胱氨酸的短肽，是半胱氨酸殘基和金屬含量極高的蛋白質(zhì)，可以通過半胱氨酸的巰基結(jié)合大量的金屬素，對(duì)多種重金屬有高度的親和性。一般由兩個(gè)大小相近，結(jié)構(gòu)與功能類似的結(jié)構(gòu)域組成,即a-結(jié)構(gòu)域和β-結(jié)構(gòu)域。人們?yōu)閷⒑衋-結(jié)構(gòu)域的基因轉(zhuǎn)移到煙草中，成功的獲得了對(duì)鎘，銅,鉛等重金屬具有較高抗性的工程株。三、人白細(xì)胞介素-2

IL-2是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素。天然人白細(xì)胞介素-2是一個(gè)由133個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，133個(gè)氨基酸中共有3個(gè)半胱氨酸，其中有一個(gè)半胱氨酸（Cys125）以游離方式存在，而另兩個(gè)半胱氨酸（Cys58和Cys105）縮合成活性所必需的二硫鍵。

人們用蛋白質(zhì)工程中的定位誘變技術(shù)將Cys125的密碼TGT轉(zhuǎn)換成TCT或GCA,使Cys125轉(zhuǎn)換成絲氨酸或丙氨酸，避免了錯(cuò)誤配對(duì)的產(chǎn)生。結(jié)果不但使IL-2的生物活性不受影響，而且其熱穩(wěn)定性等方面也得到了較明顯的改善。工程IL-2目前已被美國FDA批準(zhǔn)上市，用于治療腎細(xì)胞瘤。我國衛(wèi)生部也已經(jīng)批準(zhǔn)了在國內(nèi)試生產(chǎn)基因工程白細(xì)胞介素-2?；虻母拍罴捌浣Y(jié)構(gòu)

tPA能夠切割纖溶酶原形成纖溶酶，從而激活纖溶作用(fibrinolysis)，使血栓溶解。作為一種高效特異性溶血栓藥物。優(yōu)點(diǎn):（1）血栓選擇性高但幾乎不激活循環(huán)血液中的纖溶系統(tǒng)，可直接靜脈注射；

（2）對(duì)中毒性休克引起的彌散性血管內(nèi)凝血療效顯著等。利用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)，改變tPA分子中的某些糖基化氨基酸而減少或避免了糖基化，有效地減緩了它在血漿中被清除的速率，達(dá)到了延長(zhǎng)其半壽期的目的，臨床應(yīng)用價(jià)值得到有效提高。思考：蛋白質(zhì)工程在枯草桿菌蛋白酶的應(yīng)用實(shí)例？蛋白質(zhì)組學(xué)簡(jiǎn)介目錄蛋白質(zhì)組研究的含義；蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容；蛋白質(zhì)組學(xué)研究工具；蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用范圍及前景蛋白質(zhì)組學(xué)簡(jiǎn)介中心法則示意圖一、蛋白質(zhì)組研究的開端開端：

1.人類基因組序列草圖的完成，宣告了“后基因組時(shí)代”的到來。2.人類基因組的所有基因及間隔序列已完全確定？3.基因組計(jì)劃不能確定哪些基因在何時(shí)、何地、以何種程度表達(dá)；4.生物的基因組只表達(dá)部分基因(30~80%)；5.蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行體；6.以往的蛋白質(zhì)研究難以系統(tǒng)透徹地闡釋生命活動(dòng)的基本機(jī)制；因此，無論是從基因組計(jì)劃的局限、還是蛋白質(zhì)研究的自身發(fā)展而言，大規(guī)模、全方位的蛋白質(zhì)研究均是勢(shì)在必行。蛋白質(zhì)組：

一種細(xì)胞/組織/生物體某個(gè)時(shí)間段所包含的所有蛋白質(zhì)的存在形式及其活動(dòng)方式。二、蛋白質(zhì)組及蛋白質(zhì)組學(xué)的含義蛋白質(zhì)組學(xué)：

研究蛋白質(zhì)組的科學(xué)，闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式。研究?jī)?nèi)容01結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容

主要研究蛋白質(zhì)的氨基酸序列、三維結(jié)構(gòu)的解析、種類分析、數(shù)量確定等。02功能蛋白質(zhì)組學(xué)

研究蛋白質(zhì)的功能，確定蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的定位，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用等。四、蛋白質(zhì)組學(xué)的工具工具：

1.數(shù)據(jù)庫：蛋白質(zhì)、EST（expressedsequencetags)、和基因組序列數(shù)據(jù)庫2.質(zhì)譜（MS）：質(zhì)譜數(shù)據(jù)為蛋白質(zhì)鑒定提供了最有力和最精確的方法。3.對(duì)數(shù)據(jù)庫中特定蛋白質(zhì)序列與質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)的各種軟件。4.蛋白質(zhì)的分析分離技術(shù)，聚丙烯酰胺凝膠電泳（2D-SDS）是最廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)。

EST(ExpressedSequenceTag)表達(dá)序列標(biāo)簽，表達(dá)序列標(biāo)簽是cDNA克隆的末端序列,平均長(zhǎng)度為300～500bp,稱為表達(dá)序列標(biāo)簽,通常是從已有的cDNA文庫中隨機(jī)取出幾百到幾千個(gè)克隆一次測(cè)序產(chǎn)生,一般使用載體多克隆位點(diǎn)互補(bǔ)序列作為通用引物。一個(gè)EST代表生物體某種組織在某一時(shí)期的一個(gè)表達(dá)基因。采用生物信息學(xué)方法延伸表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）