實(shí)驗(yàn)十二 土壤中微生物的分離純化

實(shí)驗(yàn)十二土壤中微生物的分離及純化

（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）

2021/5/91一、目的要求

1、掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)；2、初步觀察來自土壤中的三大類群微生物的菌落形態(tài)特征；3、學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法，并掌握其基本技能。

2021/5/92二、基本原理（一）土壤是微生物生存的大本營，所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的，原因是什么？

由于土壤具備了各種微生物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的營養(yǎng)、水分、空氣、酸堿度、滲透壓和溫度等條件，所以成了微生物生活的良好環(huán)境?？梢哉f，土壤是微生物的“天然培養(yǎng)基”，也是它們的“大本營”因此，土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，人們可與從中分離、純化獲得許多有價(jià)值的菌株。

2021/5/93（二）如何分離？在土壤、水、空氣或人及動(dòng)、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長(zhǎng)，而抑制其他菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。從微生物群體中經(jīng)分離、生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征等綜合考慮。有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列的分離與純化過程和多種特征（產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況、染色情況、營養(yǎng)要求、氧氣需求、酸堿度、滲透壓和溫度等）鑒定方能得到。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。

2021/5/94（三）平板菌落計(jì)數(shù)法的原理

將待測(cè)菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋，涂布在平板上，經(jīng)過培養(yǎng)后在平板上形成肉眼可見的菌落。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量計(jì)算出樣品中細(xì)胞密度（一般選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有50-200個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的含菌量較為合適）。由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，平板上形成的每個(gè)菌落不一定是單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而成，有的可能來自兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。因此，平板菌落記數(shù)的結(jié)果往往比樣品中實(shí)際細(xì)胞數(shù)低，這就是現(xiàn)在使用菌落形成單位取代以前用絕對(duì)菌落數(shù)來表示樣品活菌含量的原因。該法雖然操作較繁瑣，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能獲得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該方法能直接反映樣品中活細(xì)胞數(shù)量，所以被廣泛用于生物制品（如活菌制劑）、食品、飲料、水（包括水源水）以及多類產(chǎn)品等質(zhì)量檢測(cè)與控制的標(biāo)準(zhǔn)方法?？焖偌?xì)菌自動(dòng)稀釋儀和自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀則提供快速準(zhǔn)確的結(jié)果。

2021/5/95培養(yǎng)基的類型？2021/5/96三、實(shí)驗(yàn)器材1、土壤樣品（自帶）2、培養(yǎng)基：淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基），牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基。3、溶液和試劑：10％酚，鏈霉素，盛9ml無菌水的試管，盛99ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶。4、儀器和其他用品：無菌玻璃涂棒，無菌吸管，無菌培養(yǎng)皿等。

2021/5/97四、操作步驟

1、倒平板①標(biāo)記，最好寫在皿底邊上，以防蓋子蓋錯(cuò)；②加熱熔化三種培養(yǎng)基，冷至55～60℃時(shí)，在高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基中加入10％酚數(shù)滴，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基中加入鏈霉素溶液（終質(zhì)量濃度為30ul/mg），混勻后看清標(biāo)記分別倒平板，在火焰附近，每皿倒15～20ml，靜置凝固后備用；(若皿蓋上冷凝水過多，最好用滅菌棉花或滅菌紙擦后再涂布)2021/5/982、稀釋土樣

制備土壤稀釋液稱取土樣10g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20分鐘，使土樣與水充分混合，將菌分散。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液注入盛有9ml無菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。然后再用一支1ml無菌吸管從此試管中吸取1ml注入另一盛有9ml無菌水的試管中，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各種稀釋度的土壤溶液。

減小誤差應(yīng)注意的方面：①稱量準(zhǔn)確；②土樣與水混合，一定要搖勻；③每次稀釋取液應(yīng)換一支新的吸管；④每次取液時(shí)應(yīng)先混勻試管中的溶液；

2021/5/99各培養(yǎng)基涂布菌液時(shí)對(duì)稀釋度的選擇：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基10-4、10-5、10-6；高氏一號(hào)培養(yǎng)基：10-3、10-4、10-5；馬鈴薯培養(yǎng)基：10-2、10-3、10-4；

平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個(gè)連續(xù)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。2021/5/910平板分離2021/5/9113、涂布：①標(biāo)記：選擇3個(gè)稀釋度寫在平板底部；②取樣：每皿準(zhǔn)確取懸液0.2ml，放于平板中央；（注意每次取液時(shí)應(yīng)先混勻試管中的溶液）③涂布：在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，其方法是將菌液先沿一條直線輕輕地來回推動(dòng)，使之分布均勻，然后改變方向90°沿另一垂直線來回推動(dòng)，平板內(nèi)緣處可改變方向用涂棒再涂布幾次，室溫下靜置5～10分鐘；

注意涂棒的正確使用。2021/5/9124、培養(yǎng)：將含高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基和馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基的平板倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3～5天，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)1～2天。5、記數(shù)：

培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，

每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

6、鏡檢純培養(yǎng)：挑菌落將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28℃和37℃溫室中培養(yǎng)，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。2021/5/913五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告１、將培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果填入表格（實(shí)驗(yàn)教材P34表II-5）２、你所做的涂布平板法是否較好地得到了單菌落？如果不是，請(qǐng)分析其原因。３、在３種不同的平板上你分離得到那些類群的微生物？簡(jiǎn)述它們的菌落形態(tài)特征。

2021/5/914六、思考題

1、如何確定平板上單個(gè)菌落是否為純培養(yǎng)？請(qǐng)寫出實(shí)驗(yàn)的主要步驟。2、如果要分離得到極端嗜鹽細(xì)菌，在什么地方取樣，分離培養(yǎng)基有何特點(diǎn)？說明理由。3、怎樣判斷稀釋涂布平板計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)是否可靠？需要掌握哪