實驗細胞化學(xué)染色POX省公開課一等獎全國示范課微課金獎?wù)n件

細胞化學(xué)染色滄州醫(yī)專醫(yī)學(xué)技術(shù)系侯振江1/73細胞化學(xué)染色，是一個以形態(tài)為基礎(chǔ)，結(jié)合利用化學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)對血細胞內(nèi)各種化學(xué)成份作定位、定性及半定量分析方法。用于研究血細胞生理、病理和化學(xué)結(jié)構(gòu)；臨床上為一些血液病診療、判別診療、療效觀察、預(yù)后監(jiān)測和發(fā)病機制探討，提供主要依據(jù)。2/73血細胞化學(xué)染色基本要求是在原位顯示細胞成份和結(jié)構(gòu)，反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)是有色沉淀物，含有一定穩(wěn)定性。血細胞化學(xué)染色可顯示糖原、脂類、酶、蛋白質(zhì)等。3/73（一）固定固定有物理法與化學(xué)法，物理法為干燥和火焰固定，化學(xué)法最慣用是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。血細胞化學(xué)染色流程4/73（二）顯示

1、偶氮偶聯(lián)法：利用人工合成酶底物，在酶作用下，產(chǎn)生分解產(chǎn)物，再與重氮鹽結(jié)合引發(fā)偶氮偶聯(lián)，使其形成不溶性偶氮色素，以此證實酶存在。

2、聯(lián)苯胺法：粒細胞和單核細胞中過氧化物酶作用于過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色聯(lián)苯胺形成藍色沉淀。5/733、普魯士藍法：細胞內(nèi)、外鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成藍色亞鐵氰化鐵沉淀。4、雪夫反應(yīng)：過碘酸氧化細胞內(nèi)糖類中乙二醇基形成乙醛基，醛基與雪夫試劑作用，使無色品紅形成紅色沉淀。5、金屬從容法其它還有物理學(xué)方法，如脂溶性染料染色（顯示脂質(zhì)）、熒光顯示、放射自顯影以及體外活體染色亦慣用于臨床血液細胞學(xué)診療。6/73（三）細胞化學(xué)定量粗略估量，以染色反應(yīng)強弱，受色深淺，人為地域別為陰性和各種程度陽性。百分法，只能反應(yīng)細胞陽性率，不能反應(yīng)受色強弱。積分法，是慣用半定量法，將等級估量與百分率相結(jié)合它既反應(yīng)了細胞陽性率高低，又反應(yīng)了細胞受色強弱。7/73下面介紹幾個慣用細胞化學(xué)染色方法這些方法學(xué)在白血病判別診療上含有主要意義。8/73一、過氧化物酶染色（POX）（一）四甲基聯(lián)苯胺法(TMB)【原理】

粒細胞和單核細胞胞漿內(nèi)髓過氧化物酶（POXorMPO）分解過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色聯(lián)苯胺氧化成藍色聯(lián)苯胺，后者深入變成棕色化合物從容于細胞質(zhì)內(nèi)。9/73POX

新生態(tài)氧

[O]↑過氧化氫（基質(zhì)中）四甲基聯(lián)苯胺TMB（無色）聯(lián)苯胺藍（藍色）亞硝基鐵氰化鈉

藍色顆粒（漿內(nèi)酶部位）粒、單核細胞胞漿【原理】四甲基苯醌二胺(棕色)自我脫氫氧化10/73【試劑】1%TMB亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液1%過氧化氫溶液稀過氧化氫溶液瑞氏染色液11/73

【操作】1.取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液10μl，混合溶液呈淡棕黃色。2.在新鮮干燥血片上，加混合溶液0.5ml,

放置lmin后，再加稀過氧化氫溶液0.7ml，染色6min。3.瑞氏染液復(fù)染15～20min。4.油鏡鏡檢。12/73

【結(jié)果】細胞質(zhì)內(nèi)有藍黑色顆粒者為陽性。（－）無顆粒從容；（±）顆粒細小，分布稀疏；（+）顆粒較粗，局灶分布；（++）顆粒粗大，分布較密，占胞質(zhì)1/2~2/3；（+++）顆粒粗大，呈團塊分布；（++++）全部胞質(zhì)均部滿顆粒，可覆蓋胞核。13/7314/73骨髓片POX染色15/73【臨床意義】（1）粒系：POX主要分布在粒細胞和單核細胞內(nèi)，伴隨粒細胞成熟程度而逐步增強，中性分葉核粒細胞為強陽性。嗜酸性粒細胞陽性程度最強，其陽性顆粒比中性粒細胞粗大，有折光。堿性粒細胞為陰性。16/73（2）單核細胞：

原始單核細胞為陰性反應(yīng)，

幼稚單核細胞和成熟單核細胞呈弱陽性反應(yīng)，顆粒細小，彌散分布。17/73（3）其它細胞淋巴細胞、漿細胞、幼紅細胞、組織細胞、巨核細胞均呈陰性反應(yīng)。（4）血小板過氧化物酶主要定位于幼稚型巨核細胞核膜上，可作為原巨核細胞一個標(biāo)志物，有利于FABM7識別。18/73（5）過氧化物酶染色主要用于判別急性白血病類型，急性髓細胞白血病多呈陽性反應(yīng)，以M3和M2型反應(yīng)最強，MI和M5型反應(yīng)較弱，故有利于區(qū)分M3和M5型。急性淋巴細胞白血病呈POX陰性反應(yīng)，故為急性髓細胞和淋巴細胞白血病判別主要指標(biāo)。19/73

注意事項

涂片應(yīng)新鮮制作、厚薄適宜。TMB配制在85％～88％乙醇溶液中染色效果很好，勿用90％～95％乙醇，不然細胞表面蛋白質(zhì)很快凝固，妨礙試劑向胞內(nèi)滲透而使顯色反應(yīng)減弱或消失。過氧化氫溶液需新鮮配制，其濃度與加入量不能隨意更改。涂片中粒細胞看不見陽性顆粒，紅細胞呈棕色或綠色，即表示過氧化氫過濃。若過氧化氫加于血片上不產(chǎn)生氣泡，則示無效。染色液適宜pH值應(yīng)為5.5，若pH值<5.0會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。試劑應(yīng)置于低溫暗處，預(yù)防光線照射失效。染色時加稀過氧化氫溶液之后必須與染色液充分混勻，不然同一片子上細胞染色情況不一致。20/73AML-M121/7322/73M1-POX(+)23/73×24/73二、蘇丹黑B染色【原理】蘇丹黑B(sudanblackB,SB)是一個能溶解于脂肪中色素染料，可使細胞內(nèi)中性脂肪、磷脂和類固醇著色，即使細胞內(nèi)微細結(jié)構(gòu)脂類物質(zhì)也能顯示出來。25/73【試劑】1.10%甲醛液。2.蘇丹黑B乙醇溶液26/73【操作】1．干燥血片或骨髓片在甲醛蒸氣中固定。2．自來水沖洗。3．放人染色液中，37℃染色30~60min。4．用70%乙醇脫色1~2min，水洗lmin。.5．瑞氏染液復(fù)染20~30min。27/73

【結(jié)果】脂類呈黑色或棕黑色顆粒，定位于細胞漿中（+）顆粒很小，細小、稀疏，或胞質(zhì)局部面積1/4有致密顆粒。（++）顆粒較少，或胞質(zhì)面積1/2出現(xiàn)黑色顆粒。（+++）顆粒較密，或胞質(zhì)面積3/4出現(xiàn)黑色顆粒。（++++）顆粒極密，顆粒間無間隙。28/73【臨床意義】1.粒細胞系早幼粒及以下階段伴隨細胞成熟，陽性顆粒逐步增加。早期原粒細胞普通為陰性，少數(shù)細小點狀顆粒代表線粒體被染色晚期原粒細胞可出現(xiàn)陽性顆粒，其顆粒限于胞漿某一區(qū)域。29/732.單核細胞系陽性，顆粒細小，分布彌散，形狀不規(guī)則。原單核細胞為陰性。3．紅細胞系、淋巴細胞系均呈陰性反應(yīng)4．尼曼一匹克細胞和戈謝細胞均為陽性反應(yīng)。30/735．蘇丹黑B和過氧化物酶染色臨床意義相同，主要用于急性白血病類型判別。蘇丹黑B染色較過氧化物酶染色更敏感，但特異性不如過氧化物酶染色（極少數(shù)急性淋巴細胞白血病可為陽性）。31/73M1-SBB(+)32/73M2-SBB(+)33/73三、過碘酸一雪夫（PAS)染色【原理】

胞漿內(nèi)存在糖原或多糖類物質(zhì)（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中乙二醇基（CHOH-CHOH）經(jīng)過碘酸（periodicacid）氧化，轉(zhuǎn)變?yōu)槎┗–HO-CHO），與雪夫(Schiff)試劑中無色品紅結(jié)合，形成紫紅色染料而沉積于胞漿中。該反應(yīng)稱為過碘酸一雪夫(PAS)陽性反應(yīng)。34/73【結(jié)果】（1）粒細胞系：原粒細胞多呈陰性反應(yīng)，也可弱陽性。自早幼粒細胞以后伴隨細胞成熟程度，陽性反應(yīng)逐步增強。嗜酸粒細胞顆粒本身不著色，但顆粒間胞質(zhì)呈彌漫性陽性反應(yīng)；嗜堿粒細胞為陽性反應(yīng)，顆粒紫紅色，大小不一。35/73

中性粒細胞糖原含量參考標(biāo)準(zhǔn)（-）胞質(zhì)無顆粒（+）胞質(zhì)呈淡紅色，無顆粒（++）胞質(zhì)呈紅色，有少許顆粒（+++）胞質(zhì)呈暗紅色，顆粒較密（++++）胞質(zhì)呈紫紅色，顆粒極密36/73過碘酸-Schiff反應(yīng)(PAS)37/73（2）淋巴細胞系：

大多數(shù)淋巴細胞呈陰性反應(yīng)，

少數(shù)為（+）陽性反應(yīng)。淋巴細胞糖原含量程度參考標(biāo)準(zhǔn)（-）胞質(zhì)內(nèi)無顆粒（+）胞質(zhì)內(nèi)有顆粒（++）有較粗紅色顆粒（+++）有粗大紅色顆粒（++++）顆粒粗大并有紅色塊狀38/73

（3）紅細胞系：

幼紅細胞和紅細胞呈陰性反應(yīng)紅細胞系列糖原含量程度參考標(biāo)準(zhǔn)（-）胞質(zhì)無顆粒（+）有少數(shù)紅色顆粒（++）有較粗紅色顆?；驈浡t色（+++）有粗大紅色顆粒或深紅色（++++）有粗大紅色塊狀或紫紅色39/73（4）巨核細胞：

巨核細胞和血小板染色反應(yīng)均為陽性巨核細胞糖原含量程度參考標(biāo)準(zhǔn)（-）胞質(zhì)無顆粒（+）少許糖原包涵體（++）中等量糖原包涵體，定位于核膜出或分散胞質(zhì)中，占胞質(zhì)1/3

（+++）大量糖原包涵體分散于胞質(zhì)1/2

（++++）糖原包涵體充滿整個胞質(zhì)40/73PAS巨核細胞巨核細胞包涵體41/73

（5）單核細胞呈陰性或陽性，顆粒細小，往往位于胞質(zhì)邊緣；

漿細胞大多呈陰性，少數(shù)為紅色顆粒陽性；

組織細胞為陰性反應(yīng)；巨噬細胞可呈陽性，為紅色顆粒反應(yīng)。42/73

【臨床意義】（1）M6與巨幼貧判別

M6幼紅細胞PAS可呈強陽性，積分顯著增高，巨貧、再障、溶貧時PAS反應(yīng)為陰性。（2）急性白血病類型判別

ALL，PAS呈大塊狀陽性，也可是陰性，AML為陰性，急性單核細胞白血病時原單核細胞及幼單核細胞PAS陽性，積分增高，陽性顆粒小而多，呈彌散分布。43/73ALL-L144/73L1PAS(+)45/73AML-M546/73M5PAS(+)47/73AML-M648/73AML-M6PAS(+)49/73AML-M750/73M7PAS(+)51/73（3）巨核細胞和Sternberg細胞判別

巨核細胞PAS強陽性，Sternberg細胞為陰性或弱陽性。（4）戈謝氏細胞強陽性，尼曼-皮克細胞陰性或弱陽性。（5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴細胞糖原積分增高；普通病毒感染，糖原積分在正常范圍內(nèi)。52/73四、中性粒細胞堿性磷酸酶染色偶氮偶聯(lián)法（Kaplow法）【原理】中性粒細胞胞漿中堿性磷酸酶在pH9.2~9.8緩沖液中，能水解磷酸萘酚鈉，并釋放出磷酸與萘酚。再以重氮鹽與萘酚偶聯(lián)成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞漿中。53/73【結(jié)果】堅牢藍RR陽性為紫黑色顆粒，堅牢紫醬GBC陽性為棕紅色沉淀。“一”陰性反應(yīng)，胞漿中無陽性染色顆粒?！埃卑麧{中含有少許顆?；虺蕪浬\紅色（或彌散紫色）。

“2＋”胞漿中含有中等量顆?；驈浬⑹苌！?＋”胞漿中有豐富顆?；驈浬⑸钌?，胞核清楚?！?＋”有極豐富粗大顆粒，充滿胞漿，或彌散深色，胞核不清楚。54/73中性粒細胞堿性磷酸酶(NAP)偶氮偶聯(lián)法55/73

NAP積分法

計數(shù)100個成熟中性粒細胞，按其反應(yīng)強度分級，各級百分率與其級數(shù)乘積總和，即為積分。例如：NAP反應(yīng)結(jié)果（%）（-）（+）（++）（+++）（++++）

204020155

積分=（0×20）+（2×20）+（3×15）+（4×5）=145

參考值：正常人血細胞堿性磷酸酶除成熟中性粒細胞（桿狀核及分葉核）可見陽性外，其它血細胞均為陰性。中性粒細胞NAP活性積分值普通為10～50分，但有時可高達162分。

56/73

【臨床意義】（1）生理改變：

新生兒NAP增高，成人較兒童減低，老人更低；激烈運動增高；

月經(jīng)期經(jīng)前增高，行經(jīng)后降低，經(jīng)后期恢復(fù)正常；

妊娠期2-3月輕度增高，以后逐步增高，分娩時到達高峰，產(chǎn)后恢復(fù)正常。57/73（2）、病理改變

增高：嚴(yán)重化膿性感染、類白血病反應(yīng)、AA、CML加速期、ALL、CLL、惡性淋巴瘤、癌轉(zhuǎn)移、MM、真紅、骨髓纖維化等。

減低：PNH、CML、惡性組織細胞病、MDS。58/73

（3）疾病判別診療慢粒與類白判別：CML減低，類白增高。急性白血病判別：AML減低，ALL增高。

PNH與AA判別：PNH減低，AA增高。病原微生物判別：病毒感染減低，細菌感染增高。59/7360/73NAP(++++)CML-NAP(-)61/73五、骨髓鐵染色

【原理】正常人骨髓中貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細胞中，骨髓中鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍反應(yīng)，形成藍色亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵部位，從而反應(yīng)骨髓中鐵儲存量?；瘜W(xué)反應(yīng)過程為：

4Fe3+＋3K4［Fe（CN）6］→Fe4〔Fe（CN）6〕3＋12K+（含鐵物質(zhì)）

（亞鐵氰化鉀）

（亞鐵氰化鐵）

62/73【結(jié)果】

（1）細胞外鐵觀察：

細胞外鐵呈藍色顆粒狀、小株狀或團塊狀。以油鏡觀察定級標(biāo)準(zhǔn)（-）無鐵粒可見。（+）少數(shù)鐵粒或鐵小珠。（++）較多鐵粒和鐵小珠。（+++）很多鐵粒、鐵小珠和少數(shù)小塊。（++++）極多鐵粒、鐵小珠并有很多小塊，密集成堆。正常范圍：+～++，“+”占2/3，“++”占1/3。63/73細胞外鐵64/73（2）細胞內(nèi)鐵觀察：

細胞內(nèi)鐵指有核紅細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍色顆粒，以油鏡計100個中、晚幼紅細胞，統(tǒng)計胞質(zhì)中含有藍色小顆