講課色譜分析法

講課色譜分析法第2頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜法的基礎(chǔ)

色譜法(Chromatography)是一種物理或物理化學(xué)分離方法，將混合物中各組分分離后在線或離線分析的方法。色譜區(qū)別與其他分析方法的特點(diǎn)是什么？光譜分析法：判斷一種物質(zhì)是否存在，和此物質(zhì)的含量。色譜分析法：主要應(yīng)用于混合物的分離。色譜法第3頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天主要內(nèi)容色譜法的來(lái)源和特點(diǎn)色譜流出曲線和相關(guān)概念色譜過(guò)程和基本原理第4頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜法概述1903年俄羅斯植物學(xué)家Tsweet茨維特植物提取液CaCO3玻璃柱石油醚色譜色：顏色譜：圖譜創(chuàng)建1903第5頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天

分析過(guò)程是離線的，不能連續(xù)進(jìn)行。第6頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天現(xiàn)代色譜法的分離、分析過(guò)程是在線的，即連續(xù)進(jìn)行的。不僅可用于分離有色物質(zhì)，同樣適用于無(wú)色物質(zhì)的分離。第7頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天

色譜法的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：“三高”、“一快”、“一廣”分離效率高----可將性質(zhì)相近的組分分開分離能力高----反復(fù)多次利用組分性質(zhì)差異將產(chǎn)生很好的分離靈敏度高----10-11～10-13

g，適于痕量分析分析速度快----幾到幾十分鐘可完成一個(gè)復(fù)雜樣品的分離分析應(yīng)用范圍廣----氣體、液體、固體物質(zhì)；無(wú)機(jī)物或有機(jī)物也可通過(guò)化學(xué)衍生化進(jìn)行色譜分離和分析缺點(diǎn)：對(duì)未知物分析的定性專屬性差需要與其他分析方法聯(lián)用（GC-MS,LC-MS）

第8頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天石油醚流動(dòng)相(Mobilephase)石油醚固定相(Stationaryphase)

CaCO3兩相混合物分離色譜分離過(guò)程實(shí)現(xiàn)色譜操作的基本條件：必須具備相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相（固定相和流動(dòng)相）第9頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜分離過(guò)程---多次分配的過(guò)程

色譜過(guò)程是組分的分子在固定相和流動(dòng)相間多次分配的過(guò)程。植物葉片的色素包含有多種成分，如胡蘿卜素、葉綠素A、葉綠素B、葉黃素，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，從而導(dǎo)致其化學(xué)性質(zhì)不同，并進(jìn)一步導(dǎo)致混合物中不同組分在石油醚中的溶解能力及其對(duì)碳酸鈣的吸附能力有差別，這種差別就體現(xiàn)在不同的組分被石油醚攜帶著向下遷移的速度不同，遷移速度快的就先下來(lái)，遷移速度慢的就后下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)不同組分的分離。第10頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天

色譜分離過(guò)程，是一個(gè)多次的吸附---溶解---再吸附---再溶解的過(guò)程，那么這樣一個(gè)反復(fù)多次的過(guò)程，它有一個(gè)什么樣的好處呢？組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的微小差別，導(dǎo)致組分與固定相之間作用的性質(zhì)有微小差別，并進(jìn)一步導(dǎo)致不同組分隨流動(dòng)相向下遷移的速度有微小差別，那么這種微小的差別，是如何導(dǎo)致混合物的完全分離呢？關(guān)鍵就在于“多次的分配”，微小的差異經(jīng)多次分配過(guò)程被累加放大了，只要色譜柱足夠長(zhǎng)，越往玻璃管下端，組分分離的越開。色譜分離過(guò)程---多次分配的過(guò)程第11頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜分離法的原理？？？色譜分離的基礎(chǔ)：差速遷移組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的微小差異與固定相作用有差異隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度不等差速遷移第12頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天思考：茨維特所做的植物色素分離的實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了不同色素組分的分離，那么我們采用什么方法，可以將得到的各個(gè)組分進(jìn)行分析、測(cè)定？

可以將分離之后得到的組分，采用紫外-可見光譜、紅外光譜、質(zhì)譜的方法進(jìn)行分析，現(xiàn)代色譜分析法往往是在色譜柱后面加一個(gè)檢測(cè)器，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)組分流出色譜柱時(shí)，檢測(cè)器上就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)峰，當(dāng)?shù)诙€(gè)組分流出之后，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的信號(hào)峰，當(dāng)沒(méi)有組分流出時(shí)，產(chǎn)生的是一條平直的直線，沒(méi)有信號(hào)峰產(chǎn)生。色譜流出曲線和相關(guān)概念1.色譜流出曲線是由檢測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖所繪制的曲線，又稱為色譜圖。第13頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.

基線是柱中僅有流動(dòng)相通過(guò)時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)信號(hào)的記錄值?；€反映儀器（主要是檢測(cè)器）的噪音隨時(shí)間的變化。3.色譜峰是色譜流出曲線上突起的部分。根據(jù)色譜峰的性狀，可以將其分為正常色譜峰、拖尾峰和前延峰。對(duì)稱因子fs(synmetryfactor)，衡量色譜法的對(duì)稱性。色譜流出曲線和相關(guān)概念第14頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1

保留時(shí)間（retentiontime,tR）：從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分色譜峰頂點(diǎn)的時(shí)間間隔稱為該組分的保留時(shí)間。單位為s或min。

2

死時(shí)間（deadtime,t0,

tM）：不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)，分配系數(shù)為零的組分的保留時(shí)間稱為死時(shí)間，是流動(dòng)相充滿輸液系統(tǒng)管路、色譜柱空隙及檢測(cè)池所需的時(shí)間。單位為s或min。

3

調(diào)整保留時(shí)間（adjustedretentiontime,t’R）：組分在固定相中停留的時(shí)間稱為調(diào)整保留時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間與保留時(shí)間和死時(shí)間有如下關(guān)系：

t’R=tR-t04.

定性參數(shù)第15頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天4相對(duì)保留值r2,1：兩組分的調(diào)整保留值之比稱為相對(duì)保留值，又稱選擇性因子，即：由于相對(duì)保留值只與柱溫、固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，因此，它在色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。

5分配系數(shù)K：在一定的溫度、壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相中分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度比，是衡量色譜柱對(duì)被分離組分保留能力的重要參數(shù)。

K=cs/cm

cs和cm

分別為組分在固定相和流動(dòng)相中的濃度

分配系數(shù)是由組分和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)決定的。它僅與固定相和溫度有關(guān)，但與兩相體積、柱管的特性以及所使用的儀器無(wú)關(guān)。第16頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.

定量參數(shù)1峰高（peakheight;h）:色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離。

2峰面積（peakarea;A）:色譜曲線與基線之間的包圍的面積。第17頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天1標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation;

）:正態(tài)色譜流出曲線上令拐點(diǎn)之間距離的一半，即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。

的大小表示組分被帶出色譜柱的分散程度。

越大，組分越分散，反之，越集中。

2半高峰寬（peakwidth;W1/2）:峰高一半處對(duì)應(yīng)的色譜峰寬度。

W1/2=2.354

3色譜峰底寬（peakwidth;Wb）:由色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)做切線與基線交點(diǎn)間的距離。6.區(qū)域?qū)挾葏^(qū)域?qū)挾?是組分在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，反映了色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素。度量法有:標(biāo)準(zhǔn)偏差

半峰寬W1/2

色譜峰底寬Wb。第18頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天

理論塔板數(shù)n(n有效)是衡量柱效的指標(biāo)，反映了色譜分離過(guò)程動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。

常用色譜圖上兩峰間的距離衡量色譜柱的選擇性，其距離越大說(shuō)明柱子的選擇性越好。柱子的選擇性主要取決于組分在固定相上的熱力學(xué)性質(zhì)。

左圖反映了柱效能及選擇性對(duì)分離的影響。圖中（a）兩色譜峰峰形寬且嚴(yán)重相疊，表明柱效能和選擇性都很差。（b）兩色譜峰間距足夠大，但峰形很寬，說(shuō)明選擇性好，但柱效能低。（c）分離最理想，說(shuō)明選擇性好，柱效能也高。7.柱效和選擇性用于考察色譜系統(tǒng)的優(yōu)劣、好壞第19頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天8.

總分離效能指標(biāo)：分離度分離度

(R)：它是指相鄰兩色譜峰保留值之差與兩峰底寬平均值之比，即注意：計(jì)算R時(shí)，保留時(shí)間和色譜峰底寬應(yīng)采取相同的時(shí)間單位。

分離度R既反映了峰間距的大小，又反映了峰的寬窄，它全面衡量了色譜柱對(duì)難分離物質(zhì)對(duì)的分離效能，故把分離度叫做色譜柱的總分離效能指標(biāo)。第20頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天上圖為不同分離度時(shí)色譜峰分離的程度當(dāng)R<1時(shí)，兩峰總有部分重疊；當(dāng)R=1時(shí)，兩峰能明顯分離；當(dāng)R=1.5時(shí)，兩峰已完全分離，分離程度可達(dá)99.7%。通常，用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標(biāo)志。第21頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天組分完全分離的必須條件:下圖是A、B兩組分沿色譜柱移動(dòng)時(shí)，不同位置處的濃度輪廓。

圖中KA<KB，因此，A組分在色譜柱中遷移的速度更快，隨著兩組分在色譜柱中移動(dòng)距離的增加，兩色譜峰的間距逐漸變大，同時(shí)，每一組分的濃度輪廓（即區(qū)域?qū)挾龋┮猜儗挕ｏ@然，區(qū)域擴(kuò)寬對(duì)分離是不利的，但不可避免。第22頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天組分完全分離的必須條件:組分的分配系數(shù)K必須有差異;

K=cs/cm

cs和cm

分別為組分在固定相和流動(dòng)相中的濃度區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)小于區(qū)域分離的速度;在保證快速分離的前提下，提供足夠長(zhǎng)的色譜柱。下圖是A、B兩組分沿色譜柱移動(dòng)時(shí)，不同位置處的濃度輪廓。第23頁(yè),共25頁(yè)，2024年2月25日，星期天從色譜流出曲線可以得到的重要信息根據(jù)