動物繁殖學實驗

動物繁殖學實驗實驗一公母畜生殖器官標本及睪丸、卵巢組織切片的觀察一、目的要求認識各種公母畜生殖器官的位置、形態(tài)、大小及解剖結構特點；了解生殖器官的結構與生理功能的關系。通過家畜睪丸、卵巢組織切片觀察，了解家畜睪丸、卵巢的組織結構及其形態(tài)。了解精子的發(fā)生和卵子的發(fā)生、卵泡的發(fā)育過程及其形態(tài)。為學習家畜繁殖學及更好地掌握和應用繁殖技術奠定解剖學基礎。二、材料和方法（一）材料1．各種公母畜生殖器官浸制標本及掛圖。2．大磁方盤、解剖刀、剪刀、鑷子、金屬探針。3．公畜睪丸、母畜卵巢組織切片，顯微鏡。（二）方法用掛圖與標本觀察相結合；比較各種家畜生殖器官的異同。教師先結合掛圖進行講解，使學生對公畜睪丸、母畜卵巢組織學結構及精子發(fā)生、卵泡發(fā)育過程有了初步的了解。然后再用顯微鏡進行睪丸、卵巢組織切片的觀察。三、內容（一）公畜生殖器官的觀察公畜生殖器官包括：睪丸（及陰囊和精索）、附睪、輸精管、尿生殖道、副性腺及陰莖。1．睪丸：家畜睪丸成對，分別位于陰囊的兩個腔內。均為長卵圓形。一側有附睪附著，為附睪緣；另一側為游離緣。隨畜種不同大小有差別。牛、羊、豬的睪丸相對比較大，以羊的睪丸為最大。馬（驢）陰囊位于兩股之間的腹股溝區(qū)，睪丸長軸與地面平行，附睪位于睪丸的背外緣，附睪頭在前、尾在后。牛、羊陰囊較馬陰囊稍靠前，位于前腹股溝區(qū)，睪丸長軸與地面垂直，附睪位于睪丸的后側，附睪頭在上、尾在下。豬的陰囊位于股部之后，睪丸長軸傾斜，前低后高，附睪位于睪丸的前上緣，附睪頭在前下方、尾在后上方。2．附睪：位于睪丸的附著緣。分頭、體、尾三部分。頭膨大，由睪丸輸出管相連結。睪丸輸出管匯合成一條較粗而長的附睪管盤曲成附睪體和附睪尾，最后過渡為輸精管。3．精索、輸精管：輸精管由附睪管延續(xù)而來，而后進入由睪丸系膜、血管、淋巴管、神經(jīng)、睪內體提肌共同組成的精索（成銳三角形）。沿腹股溝管進入腹腔，此后即和精索內的其它部分分開。單獨向后上方進入骨盆腔。至膀胱背面，兩側輸精管都進入尿生殖皺襞內。在此處輸精管變粗，形成輸精管壺腹。馬（尤其是驢）的輸精管壺腹發(fā)達。豬的輸精管壺腹不明顯。牛、羊的輸精管壺腹比較明顯，粗細介于馬和豬之間。輸精管壺腹部的實質為分支管狀腺體組織，有分泌物排出。4．副性腺：（1）精囊腺：成對位于膀胱頸背面的兩旁，輸精管末端的兩側。與同側的輸精管形成射精管，共同開口于尿生殖起始部的精阜上。馬的精囊腺呈梨形囊狀，向后縮小成輸出管。牛、羊、豬的精囊腺都是由致密的分葉腺體組織構成。牛、羊的精囊腺比馬的小。而豬的精囊腺特別發(fā)達。（2）前列腺：位于膀胱尿道開始處精囊腺之后。馬的前列腺由兩個側葉和一個峽部所構成，形似蝴蝶，為復管狀腺，有許多排出管開口于精阜的兩旁。牛和豬的前列腺分為體部和擴散部兩部分。體部位于膀胱頸與骨盆尿道交界處，牛的為棱形，豬的為紐扣形。豬的體部小，而擴散部很始延伸到子宮角尖端。輸卵管的前1/3段較粗，稱輸卵管壺腹，是精子和卵子結合受精的部位；后2/3段變細，稱為輸卵管峽部。兩者的連接部稱為壺峽連接部。輸卵管的子宮端是與子宮角尖端相連接，成為宮管連接部。馬：輸卵管有許多彎曲，輸卵管的腹腔端擴大呈漏斗狀，其邊緣不整齊，形成許多皺襞，稱為輸卵管傘。輸卵管傘附著在卵巢的排卵窩旁邊。卵巢囊比較發(fā)達。宮管連接部界限明顯。牛、羊：輸卵管彎曲較少。輸卵管傘部發(fā)達。輸卵管和子宮角之間的界限不明顯。豬：輸卵管有許多小彎曲。輸卵管傘比較大。其開口接近卵巢囊的底部。輸卵管和子宮角之間界限明顯。3．子宮：大部分位于腹腔，少部分位于骨盆腔。前接輸卵管，后接陰道。借助于子宮闊韌帶懸于腰下。分子宮角、子宮體、子宮頸三部分。馬：整個子宮呈“Y”形。為雙子宮。兩個子宮角不如雙角子宮那樣長、那樣明顯。子宮角為扁帶狀。稍彎曲呈弓形，似香蕉。子宮角小彎在上，大彎在下，小彎上的漿膜和子宮闊韌帶相連接。妊娠時，胎兒占據(jù)兩個子宮角。子宮粘膜上有大量縱行皺褶。子宮體接于兩個子宮角聯(lián)合處，子宮體的下部稱為子宮底。馬的子宮體較其它家畜的發(fā)達。子宮頸前接子宮體，子宮頸外口突出于陰道腔2～4cm，構成明顯的子宮頸陰道部。子宮頸管的粘膜形成許多高低不等的縱形皺襞。子宮頸通常是自然關閉的，但在發(fā)情或分娩以及發(fā)生某些疾病時松弛而張開。牛、羊：子宮形狀似彎曲的綿羊角。子宮角向前下方彎曲再向后上方。子宮角的大彎在上，小彎在下。兩個子宮角在靠近子宮體的一段外表彼此粘連，在內部有縱隔將之分開，在粘連部分的上緣有一明顯的縱溝（稱為角間溝）。這類子宮為雙角子宮。每個子宮角都是從基部開始向前逐漸變細。子宮粘膜上有突起的子宮阜（成為懷孕牛、羊母體胎盤）。牛和羊的子宮阜不同之點在于羊的子宮阜的中央有一凹陷。牛、羊的子宮體均比較短。牛、羊的子宮頸肌肉層發(fā)達，質地較馬的堅硬，在牛的直腸檢查時很容易摸到。牛的子宮頸管道內不僅有縱形皺襞，而且還有大而橫行的皺襞，使子宮頸管關閉很緊。羊的這種皺襞更明顯。子宮頸外口突出于陰道中，經(jīng)產(chǎn)牛肥大，呈菜花狀。豬：子宮角在靠近子宮體5～10cm的部分也是彼此相連的。分開的兩個子宮角形成許多彎曲，很似小腸。成熟母豬的子宮角長100～150cm。豬的子宮體不明顯。豬的子宮頸長約10～18cm，子宮頸管內粘膜有兩排交錯的半圓形突起，呈連續(xù)性的放射狀，中間的較大，兩端的較小。子宮頸的前方與子宮體、后方與陰道均沒有明顯的界限，而是逐漸地過渡，因此沒有子宮頸陰道部。人工授精時輸精管很容易插入。此外，還有雙子宮型動物，如兔和大鼠，兩個子宮角的每一個具有分開的子宮頸管道，通向陰道。4．陰道：呈管狀，壁薄，具有彈性。為母畜的交配器官。位于骨盆腔內，上為直腸，下為膀胱和尿道，前接子宮，后接尿生殖前庭。馬、牛的陰道長約25～30cm；豬、羊約10～15cm。粘膜層為復層扁平上皮細胞，發(fā)情時發(fā)生角質化。無腺體。陰道前部子宮頸口周圍形成一個環(huán)形隱窩稱為陰道穹隆。豬無陰道穹隆。牛、羊交配時，精液射到陰道穹隆附近；馬、豬精液則射到子宮頸或子宮內。5．外生殖器官（也稱外陰部）：包括尿生殖前庭、陰唇和陰蒂。（1）尿生殖前庭：是指生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)公共的雌性管道部分。即尿道外口至陰門裂的部分。馬、牛的前庭較長；豬、羊的較短。于陰道交界處腹側，馬和羊有很明顯的陰道瓣（一粘膜褶）；牛和豬不明顯。馬的前庭小腺和前庭大腺分別開口于前庭底部和頂部的數(shù)個乳頭上。牛尿道腹側有一粘膜形成的盲囊。前庭大腺開口于側壁一小盲囊。羊的前庭大腺似一小豆，開口于前庭側壁。有時沒有。豬的前庭大腺開口于中線兩旁的兩條粘膜皺褶之間。前庭小腺開口于前庭底中部凹陷兩旁的一對皺褶之間。（2）陰唇、陰蒂：陰唇分左右兩片而構成陰門，兩片陰唇的上端及下端聯(lián)合起來形成陰門上角和下角。馬的陰門上角較尖，陰門下角較圓；牛、羊及豬的陰門相反，下角較尖，呈銳角，且垂至坐骨弓的下面。在陰門下角內包含有球形凸起物即陰蒂，由勃起組織（海綿體）構成，有豐富的感覺神經(jīng)分布。陰蒂與雄性龜頭同源。6．子宮動脈（子宮中動脈）：牛的子宮動脈位于岬部之前、最后腰椎處，與臍動脈共同于髂內動脈，沿子宮闊韌帶走向子宮角小彎進入子宮。馬的子宮動脈起于髂內動脈之前的髂外動脈，或者與髂外動脈共同起于腹主動脈，它沿子宮闊韌帶的中部行走，到達子宮角小彎而進入子宮。子宮動脈向前與卵巢動脈子宮支，向后與尿生殖動脈子宮支吻合。（三）公畜睪丸的組織學觀察1．低倍鏡觀察：（1）被膜：由漿膜和白膜構成。外層漿膜為一較薄的固有鞘膜，從腹膜延伸而來。內層白膜為彈性結締組織白色薄膜層，其中富有血管。白膜下為實質部分，即睪丸的功能層。（2）睪丸縱隔和中隔：睪丸縱隔為睪丸的一端伸向睪丸實質的結締組織素，并向四周發(fā)出許多放射狀的結締組織小梁，伸向白膜。這些結締組織小梁稱為睪丸中隔。豬的睪丸中隔較發(fā)達；牛、羊的薄而不完整。（3）睪丸小葉：睪丸中隔將睪丸實質分成許多小葉，小葉的尖端朝向中央，小葉的基部朝向睪丸的表面。每個小葉由2～3條盤曲的曲精細管及血管和間質細胞組成。曲精細管直徑約200μm。據(jù)估測，牛的曲精細管拉直，頭對頭相接，可長達幾千米，占睪丸重量的80％。曲精細管在各小葉的尖端先各自匯合成直精細管，穿入睪丸縱隔結締組織內，形成彎曲的導管網(wǎng)，稱為睪丸網(wǎng)（馬無此結構），為精細管的收集管道。睪丸網(wǎng)又分出12～15條睪丸輸出管，匯入附睪頭，形成附睪管。2．高倍鏡觀察：（1）睪丸小葉的結構：由曲精細管及其間質細胞構成。此外，還有血管、淋巴管等。（2）間質細胞：又稱Leydig細胞。體積較大，分布于曲精細管之間，近似卵圓形或多角形，胞質嗜酸性，核大而圓。具有分泌雄激素的功能。（3）曲精細管的結構：曲精細管的管壁自外向內由同心圓狀排列的結締組織、基膜和復層上皮構成。上皮細胞成層地排列在基膜上，可分為足細胞核生精細胞兩種。（4）足細胞：又稱Sertoli細胞、支持細胞、營養(yǎng)細胞。體積較大而細長。但數(shù)量較少。屬體細胞。呈輻射狀排列在曲精細管中，分散在各期生殖細胞之間，其底部附著在曲精細管的基膜上，游離端朝向管腔，常有許多各精子嵌在上面。該細胞高低不等，界限不清。細胞核較大，位于細胞的基部，著色較淺，具有明顯的核仁，但不顯示分裂現(xiàn)象。由于它的頂端有數(shù)個精子伸入胞漿內，故一般認為此種細胞是對生精細胞起著支持、營養(yǎng)、保護等作用。足細胞失去功能，精子便不能成熟。（5）生精細胞（生殖細胞）：數(shù)量比較多，成群的分布在足細胞之間，大致排列成3～7層（同心圓排列）。根據(jù)不同發(fā)育階段及其形態(tài)特點又可分為：精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精（子）細胞和精子。精原細胞：位于最基層，緊貼基膜。細胞體積較小，呈圓形，常有分裂現(xiàn)象。是精子生成的干細胞。細胞質比較清亮。細胞核大而圓，富含染色質，因而著色較深。初級精母細胞：位于精原細胞上面，排成幾層，常顯示有分裂現(xiàn)象。細胞體積較大，呈圓形。細胞核呈球形，富有染色質，故著色較深。分裂時，因染色體所處不同的活動時期而呈線狀、棒狀或粒狀。在最初階段與精原細胞不易區(qū)別。隨著細胞離開基膜向管腔移動，同時胞漿不斷增多，胞體不斷變大，具有明顯的胞核。次級精母細胞：位于初級精母細胞的內側。體積較小。細胞呈圓形。細胞核為球形，染色質細粒狀。由于該細胞很快分裂為兩個精子細胞，因而在切片上很難找到它。精子細胞：位于精母細胞內側，靠近曲精細管的管腔。常排列成數(shù)層。并且多密集在足細胞游離端的周圍。細胞體積更小，胞漿少。胞核呈球形，著色深。精子：位于或靠近曲精細管的管腔內。有明顯的頭和尾，呈蝌蚪狀。頭部含有核物質，染色很深，常深入足細胞的頂部胞漿中。尾部朝向管腔。精子發(fā)育成熟后脫離曲精細管的管壁，游離在管腔中，隨后進入附睪。精子是一種獨特的細胞，不含細胞質。成熟后還有前進運動的能力。3．精子發(fā)生過程（spermatogenesis）可分為兩個明顯的時期。第一時期：精細胞生成：精原細胞經(jīng)一系列分裂形成精子細胞。第二時期：精子形成（spermiogenesis）：精子細胞變形成為精子。原始生殖細胞在移向胚胎睪丸后，經(jīng)一系列有絲分裂形成性原細胞。初情期前，性原細胞分化成A0型精原細胞，為所有其它精原細胞的干細胞。A0、A1和A2精原細胞均沿著曲精細管基膜排列。A2型精原細胞分裂形成一個休眠（A1型）精原細胞和一個活動的（A3型）精原細胞。牛和羊的活動型精原細胞經(jīng)4次有絲分裂，最后形成16個初級精母細胞。初級精母細胞不久進入成熟分裂的前期，經(jīng)過中期、后期和末期逐漸完成第一次成熟分裂，產(chǎn)生兩個較小的次級精母細胞。其核內染色體數(shù)目減半，這種分裂又稱為減數(shù)分裂。幾個小時后，次級精母細胞進行第二次成熟分裂，形成兩個精子細胞。精子細胞不再進行分裂，經(jīng)過一系列復雜的形態(tài)變化，即分化為精子。對于綿羊，一個精原細胞的干細胞可以分裂為16個初級精母細胞或64個精子。休眠的A1型精原細胞經(jīng)有絲分裂，形成A2型精原細胞。這對于精子發(fā)生的持續(xù)進行非常重要。隨著精子發(fā)生的進行，生精細胞逐漸由曲精細管基膜移向管腔。精子發(fā)生整個過程的完成，羊需要46～49d；豬稍短些（36～40d）；牛長些（56～63d）。（四）母畜卵巢的組織學觀察1．低倍鏡觀察：在低倍鏡下找出卵巢表面上皮和白膜，區(qū)分卵巢的皮質部和髓質部。（1）表面上皮：位于卵巢皮質的最外層，為單層立方上皮細胞所組成。馬卵巢表面上皮僅分布于排卵窩。其余部分被漿膜覆蓋。（2）白膜：位于表面上皮的一薄層致密結締組織。（3）皮質部：位于白膜下面、卵巢的外周部分（馬的則位于卵巢中央靠近排卵窩處）。由許多大小不等的發(fā)育卵泡和閉鎖卵泡、少量黃體以及較致密的結締組織所構成。占卵巢的大部分，與髓質無明顯界限。由于皮質部含有卵泡和產(chǎn)生卵巢激素的細胞，故也稱“功能層”。（4）髓質部：位于卵巢中央（馬則在卵巢周圍）。內含有許多細小的血管、神經(jīng)和富有彈性纖維的疏松結締組織。2．高倍鏡觀察：（1）卵泡發(fā)育的觀察：每個卵泡都由位于中央的卵母細胞和圍繞在卵母細胞周圍的卵泡細胞所組成。有的卵泡在發(fā)育過程中可能退化而形成閉鎖卵泡。卵泡可根據(jù)發(fā)育程度不同而分成下列各期。1）原始卵泡：卵泡呈球形。卵原細胞有絲分裂增殖停止，形成初級卵母細胞。初級卵母細胞進入第一次減數(shù)分裂，然后休止在前期的雙線期。初級卵母細胞位于中央，周圍包有一單層扁平的卵泡（顆粒）細胞。卵母細胞的體積比較大，中央有一圓形的泡狀核，核內染色質稀少，著色較淺，核仁明顯。卵泡細胞體積小，核扁圓形，著色深。所有的原始卵泡在出生前就形成了。它處于貯備狀態(tài)未進入生長。常常在皮質外周成群的出現(xiàn)，稱作“卵窩”。據(jù)估計，一頭出生牛犢卵巢中央有大約75，000個原始卵泡。2）初級卵泡：初級卵母細胞迅速生長，外有一層立方形的顆粒細胞包圍。此時，卵母細胞已有透明帶形成。并由卵泡顆粒細胞長出絨毛滲透到透明帶內，為卵母細胞提供營養(yǎng)。3）次級卵泡：初級卵泡經(jīng)過發(fā)育和生長，即成為次級卵泡。卵母細胞體積基本不變，但外圍的卵泡顆粒細胞生長。卵母細胞由多層顆細胞所包圍。其外有卵泡膜形成。4）三級卵泡：卵泡體積增大。顆粒細胞之間有液體形成并將它們分開，形成卵泡腔。小卵泡腔合并成為大卵泡腔。初級卵母細胞逐漸發(fā)育增大，胞漿中卵黃顆粒增多。透明帶為較均一的厚層蛋白質膜。卵泡細胞層增厚。5）成熟卵泡：也叫Graafian卵泡。三級卵泡進一步成熟，形成充滿卵泡液的水泡，卵泡突出于卵巢表面。卵泡體積很大。卵泡腔擴大。此時初級卵母細胞長大成熟，核呈空泡狀，染色質很少，核仁明顯。胞漿內富有卵黃顆粒。排卵前即恢復并完成第一次減數(shù)分裂，結果形成大小不等的兩個細胞，大的細胞為次級卵母細胞，小的叫第一極體。透明帶變厚。極體呈卵圓形，位于透明帶與次級卵母細胞之間的卵黃周隙，只要由核質構成，以后逐漸退化。Graafian卵泡的卵泡壁由幾個功能細胞層構成。最外層，為有較多纖維細胞層的外膜；向內為內膜層。這兩種細胞層由毛細血管網(wǎng)提供血液。外膜與內膜層分界明顯，常合稱為卵泡膜。內膜增厚，內膜細胞肥大，呈圓形或多角形，類脂質顆粒增多，細胞核為橢圓形。在內膜層下面有一層基膜，將內膜與最內層細胞即顆粒細胞層分開?；ぷ柚寡芟到y(tǒng)進入顆粒細胞層。隨著卵泡腔擴大，顆粒細胞層變薄，包圍卵泡腔。顆粒細胞排列整齊。有時可見到細胞分裂。此外，卵丘（顆粒細胞形成的小丘）位于卵泡腔的一側。卵丘和其它顆粒細胞包裹卵母細胞。與卵母細胞直接接觸的顆粒細胞呈輻射狀排列，稱作放射冠。排卵開始時。放射冠細胞與周圍的卵泡壁顆粒細胞之間開始出現(xiàn)裂隙，彼此的聯(lián)系疏松。牛、羊、豬的卵泡在排卵前（馬排卵后）完成第一次減數(shù)分裂，形成次級卵母細胞。隨即開始第二次減數(shù)分裂，然后休止在中期（M）。受精過程才使第二次減數(shù)分裂恢復并完成。結果產(chǎn)生合子（受精卵）及第二極體。因而，牛、羊、豬、馬等家畜沒有真正的卵子存在。6）閉鎖卵泡：初級卵泡退化后，一般不留痕跡。但生長卵泡退化時，卵母細胞萎縮，透明帶皺縮塌陷，卵泡液被吸收，卵泡壁凹陷，以后結締組織侵入泡內。（2）黃體：是排卵后的卵泡轉變成的富于血管的內分泌器官。牛、羊、豬的黃體位于卵巢皮質淺層突出于表面。馬的黃體則完全埋藏在卵巢深部。根據(jù)黃體發(fā)育階段而分成下列各期。1）血體期：卵泡破裂后，血液流入卵泡腔內，形成血凝塊，也叫紅體期。2）增生期：當破裂卵泡傷口愈合，黃體細胞增生，外觀呈黃色。黃體細胞分下列兩種：A、粒黃體細胞：來源于卵泡顆粒細胞。多分布于黃體中心，著色淺，呈多角形，體積較大，胞質出現(xiàn)類脂質顆粒，球形細胞核明顯。B、膜黃體細胞：來源于內膜細胞。多分布在黃體邊緣或粒黃體細胞之間，體積小，核及胞質著色較深。3）血管盛開期：血管與結締組織伸入黃體中心，形成花彩狀，黃體細胞清晰可見。4）成熟期：黃體增大到最高峰，黃體內各種結構明顯。5）白體期：黃體退化、萎縮，變成白色的痕跡。3．輸卵管組織學輸卵管從外向內由漿膜、肌層和粘膜三層不同細胞層構成。（1）粘膜：由上皮和固有膜構成。粘膜形成若干初級縱襞，在壺腹內又分出許多次級縱襞。上皮：為單層柱狀纖毛上皮。其中央為無纖毛的分泌上皮細胞。在漏斗和壺腹部的的上皮纖毛較高，向子宮逐漸變低。纖毛向子宮端顫動，有助于卵的運送。分泌細胞的分泌物可供卵的營養(yǎng)。固有膜：由致密的纖維性結締組織構成。但在壺腹部組織較疏松，伸入皺褶內構成支柱。（2）肌層：分內環(huán)肌和外縱肌兩層。兩側之間無明顯界限?？拷訉m端的肌層較厚。傘部的外縱肌消失，僅含有分散的肌細胞。（3）漿膜：為輸卵管壁最外層。漿膜基本上為結締組織。在肌層和漿膜之間有很寬的一層疏松結締組織，叫漿膜下層，其中含有卵巢和子宮血管的分支、淋巴管、神經(jīng)和縱行平滑肌。4．子宮組織學子宮壁分為三層：內膜、肌層和外膜。（1）內膜：由上皮和固有膜構成。上皮：為單層的柱狀上皮。細胞有時有纖毛。無纖毛的細胞有分泌性質。上皮陷入固有膜內，形成子宮腺。固有膜：又叫內膜基質。為環(huán)形的結締組織，纖維較細，還有網(wǎng)狀纖維和網(wǎng)狀細胞，之間有各種白細胞和巨噬細胞、淋巴管、血管和子宮腺。子宮腺是彎曲的分支管狀腺。管壁由單層柱狀上皮構成，多為分泌粘液的細胞，纖毛細胞較少。管壁外有分層的結締組織鞘。（2）肌層：分厚的內環(huán)肌和薄的外縱肌，在內外肌層之間為血管層，其中有神經(jīng)分布。（3）外膜：為漿膜，由疏松結締組織和間皮組成。四、作業(yè)：1．通過觀察和比較，說明各種公、母畜生殖器官的形態(tài)、大小、相互關系和大體構造以及在活體上的位置有何特點。2．繪出任一種公、母畜生殖器官的標本圖。3．繪出并注明睪丸曲精細管及其所含細胞的構造圖。4．繪出并注明卵巢組織結構及卵泡發(fā)育各階段示意圖。實驗三死活精子數(shù)的測定一、目的和要求掌握死活精子染色和制作抹片的方法。二、實驗原理活精子頭部是不易著色的，鏡檢時，精子頭部是透明、無色的。而死精子則因伊紅滲入細胞質，使整個精子頭部呈紅色。苯胺黑為背景染色，使著色的精子頭部可見。三、材料h1．精液：牛、豬或兔等任一種動物的精液。2．藥品器械：顯微鏡、載玻片、凹玻片、搪瓷盤、滴管、擦鏡紙、紗布、試管、75%酒精、5%伊紅、1%苯胺黑。四、方法和步驟1.將5%的伊紅和1%的苯胺黑按1:1混勻，分裝于1～2ml容量的試管中（加入試管容量的1/2），并在37℃水浴中加溫，隨后加入原精液1～3滴，搖勻后再放回水浴中，3min后立即取出待用。也可將染液預熱后，將伊紅、精液及苯胺黑按照1：1：1～2的比例及順序滴入預熱的凹玻片中混勻染色。2.從以上混合液中用火柴棍沾上一小滴于載玻片的一端，用另一載玻片進行推動制成抹片，待干燥后，高倍鏡鏡檢（400倍）。抹片時，最好在35～40℃的條件下制作，而且制作過程要快。也可將制好的抹片放在37～38℃保溫箱內干燥30～60秒。結果：活精子頭部是不易著色的，鏡檢時，精子頭部是透明、無色的。而死精子則因伊紅滲入細胞質，使整個精子頭部呈紅色。苯胺黑為背景染色，使著色的精子頭部可見。在高倍鏡下數(shù)200或500個精子，其中分別數(shù)出死、活精子各占的百分率?；罹影俜致士偸且染踊盥矢?。活精子百分率＝×100%五、作業(yè)計算活精子百分率，比較其與精子活率的大小并說明原因。實驗二精子的活率和密度測定一、目的和要求掌握檢查精子密度、評定活率的方法；熟悉肉眼檢查精液品質的方法；驗證觀察理化因素對精子運動及生存能力的影響。由于目測法不夠準確，所以采用精子計數(shù)的方法，測定1ml精液內的精子數(shù)。不過要有一定經(jīng)驗才會準確。要求同學們一定要熟練掌握此法，它是目前許多簡單而實用方法的基礎。二、材料和儀器1．精液：牛、豬或兔等任一種動物的精液。2．藥品器械：顯微鏡、顯微鏡保溫箱（或顯微鏡恒溫臺）、載玻片、蓋玻片、搪瓷盤、溫度計、滴管、擦鏡紙、紗布、試管、75%酒精、5%伊紅、1%苯胺黑、血細胞計數(shù)板、計數(shù)器、95%酒精、乙醚、0.9％和3%NaCl、保溫瓶、藥棉等。三、內容和方法（一）精子密度的檢查（顯微鏡觀測法）及活率評分1．檢查精子的密度：取一小滴精液于潔凈的載玻上，蓋上潔凈的蓋玻片，使精液分散成均勻的一薄層，不得有氣泡存留，也不能使精液外流或溢出于蓋玻片上。置于顯微鏡下放大100倍觀察，按下列等級評定其密度。密——在整個視野中精子的密度很大，彼此之間空隙很小，看不清各個精子個體運動的情況。每毫升精液含精子數(shù)約在10億個以上。登記時以“密”字。中——精子之間空隙明顯，精子彼此之間的距離約有一個精子的長度，有些精子的活動情況清楚可見。這種精液的密度評為“中”，每毫升所含精子數(shù)約2～10億個之間。登記時以“中”字。稀——視野中精子稀疏、分散，精子之間的空隙超過一個精子的長度。這種精液每毫升所含精子數(shù)在2億以下。登記時以“稀”字。2．評定精子的活率：必須于采精后立刻在25℃左右的實驗室內進行，最好在37℃保溫箱內或加熱的載物臺上進行。在評定精子活率的同時也可以測定精子的密度。用玻璃棒蘸取一滴原精液或經(jīng)稀釋的精液（馬、豬精液的精子密度低，不須稀釋；而牛、羊精液的密度大，須用0.9%氯化鈉溶液稀釋，其溫度須與精液密度相近），滴在潔凈的載玻片上，蓋上潔凈的蓋玻片，其間充滿精液，不存留氣泡。也可滴在蓋玻片上翻放于凹玻片的凹窩上。置于顯微鏡下，放大250～400倍檢查。注意顯微鏡的載物臺須放平，最好是在暗視野中觀察。精子活動有三種類型：直線前進運動、旋轉運動和原地擺動。評價精子活率是根據(jù)直線前進運動精子數(shù)的多少而定。精子活率＝×100%分子也可用“總精子數(shù)-非直線前進運動精子數(shù)表示。目前評定精子活率等級的方法有兩種：十級制——在顯微鏡視野中估算直線前進運動精子所占全部精子的百分數(shù)。直線前進運動的精子為100%者評為1.0級；90%者為0.9級。以此類推。五級制——全部精子都呈直線前進運動，屬于“5”級；絕大多數(shù)呈直線前進運動（約80%）為“4”級；前進運動精子略多于半數(shù)者（約60%）為“3”級；不及半數(shù)者為“2”級；呈直線前進運動的精子數(shù)目極少者屬“1”級。精子活率是精液品質評定的重要指標。受精能力與直線前進運動精子數(shù)的多少密切相關。一般活率在50～80%之間時，輸精后受精力差別不大；而低于50%者，對于受精力影響較大。（二）精子密度的計數(shù)檢查1.器材介紹：（1）介紹血細胞計數(shù)室的構造。（2）介紹血球吸管的構造及各種家畜應該使用何種血球吸管（紅血球吸管或白血球吸管）。由于同學們在學習生理時已熟悉有關血細胞計數(shù)板的運用，故不再詳述它的結構。牛、羊、雞的精液（密度高）用紅血球吸管：若將精液吸至“0.5”刻度處，然后再吸3%NaCl至“101”刻度，為稀釋200倍。如將精液吸至“1.0”刻度處，再吸3%NaCl至“101”刻度，則為稀釋100倍。豬、馬、兔的精液（密度低）用白血球吸管：若將精液吸至“0.5”刻度處，然后再吸3%NaCl至“11”刻度，為稀釋20倍。如將精液吸至“1.0”刻度處，再吸3%NaCl至“11”刻度，則為稀釋10倍。2.方法和步驟（1）將計數(shù)室推上蓋玻片。要求蓋玻片被推上后以立起計數(shù)板不掉下來為原則，并且蓋玻片在折光時可見到清晰的彩色條紋。（2）將蓋好蓋玻片的計數(shù)板置于低倍鏡下觀察，首先要求找到清晰的計數(shù)室。（3）用血球吸管吸精液，用藥棉擦去吸管尖端外圍附著的精液，并用3%NaCl稀釋，因不同的家畜用不同的吸管稀釋。（4）吸管吸好精液和3%NaCl以后，用拇指及食指堵住吸管兩端進行來回的充分搖動，混勻。然后棄去吸管中的前兩滴，再將吸管尖端置于血球計數(shù)室和蓋玻片交界處的邊緣上，吸管內的精液自動滲入計數(shù)室內，使之自然、均勻地分充滿計數(shù)室。注意不要使精液溢出蓋玻片，也不可因精液不足而使計數(shù)室內有氣泡或干燥處，否則，應重新操作。靜放2分鐘，開始計數(shù)。（5）鏡檢和計數(shù)：移到高倍鏡下檢查。首先數(shù)出四角和正中間的五個方格中的精子數(shù)，也就是80個小方格中的精子數(shù)。載物臺要平置，不能斜放。光線不必過強。計算精子數(shù)：5個方格中共數(shù)的精子數(shù)×5＝整個計數(shù)室中25個中方格內的精子總數(shù)。也就是1m2×1/10mm＝1/10mm3的精子。如果再×10，就＝1mm3精液內的精子數(shù)。再×1000＝1ml精液內的精子數(shù)（因為1cm3為1ml）。再×稀釋倍數(shù)。如果取來的精液本身不是原精液，而是經(jīng)稀釋“X”倍，那么還須再דX”倍。將以上的結果總括起來說：1ml原精液內的精子數(shù)＝5個中方格數(shù)的精子數(shù)×5×10×1000×稀釋倍數(shù)×X（如果是原精液不要דX”）。注：（1）一般羊的精子密度大約為20～30億／ml；一般牛的精子密度為10～15億／ml；一般豬、馬的精子密度為1～1.5億／ml；一般兔的精子密度為2～3億／ml；一般雞的精子密度為35～38億／ml。（2）吸管用后清洗步驟：自來水→蒸餾水→95％酒精→乙醚。（3）計數(shù)板用后清洗方法:自來水→蒸餾水→白稠布擦干凈備用。（4）也可用移液器稀釋。用移液器吸10μl精液＋1990μl（在小試管內先加2ml，再吸出10μl）的3%NaCl，即稀釋200倍。同樣，20μl精液用1980μl的3％NaCl稀釋，即稀釋100倍。以此類推。還有其它方法，如在10ml離心管中，加0.5ml精液，再用NaCl稀釋至10ml，即稀釋20倍。（5）也可用2％伊紅溶液稀釋精子，既殺死精子又使精子頭部著色，使計數(shù)容易。（三）注意事項：1．若精子壓計數(shù)室的線，則以精子頭為準，按照快速連接“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則計數(shù)。2．為了減少誤差，應對同一樣品做2～3次重復，求其平均值。如果計數(shù)的結果相差較大，則應進行再次檢查。四、作業(yè)寫出實驗過程及其精子活率、密度測定結果。實驗四精子畸形率的測定一、目的和要求由于所需時間等原因，無需對每次采精進行精子畸形率的測定。但應當每月對每一頭種公畜進行一次畸形率的測定，以繪出精子畸形率變化圖?；温释蝗辉龈?，表明存在問題，應當查找和分析原因?；温试?5％以內，受精力一般不受影響?；尉右话悴槐憩F(xiàn)前進運動，因而隨著畸形精子數(shù)增多，精子活率下降。如在檢查精子運動力時，可觀察到許多畸形精子，也需要進一步作形態(tài)學檢查。通過本實驗，了解家畜精液中精子形態(tài)與精液品質的關系，掌握精子形態(tài)的分類和分析方法。二、材料和儀器設備：精液、0.5％龍膽紫酒精溶液、高倍顯微鏡、計數(shù)器、載玻片等。三、方法和步驟：（一）制作抹片1.以細玻璃棒蘸取精液1滴，滴于載玻片一端，如牛羊精液應再加1～2滴0.9％NaCl溶液。2.以另一載玻片的頂端呈35度角，抵于精液滴上，向另一端拉去，將精液均勻涂抹于載玻片上。3.抹片于空氣中自然干燥。（二）染色用0.5％龍膽紫酒精溶液染色3min，水洗、晾干備用。（三）鏡檢在400倍顯微鏡下觀察精子形態(tài)。隨機觀察400個精子，計算各種畸形精子所占的比例。畸形精子百分率＝×100%（四）畸形精子形態(tài)的分類1．頭部畸形的精子包括：窄頭、頭基部狹窄、梨形頭、圓頭、巨頭、小頭、頭基部過寬、雙頭、頂部脫落等。但以前六種居多。2．尾部畸形精子包括：帶原生質滴的精子（近端、遠端）、無頭的尾（它和無尾的頭往往是一個精子的兩部分，在分析時一般算作尾部的畸形）、單卷尾、多重卷尾、環(huán)形卷尾、雙尾等。3．中段畸形包括：頸部腫脹、中段纖絲裸露、中段呈螺旋狀、雙中段等。實驗五卵子形態(tài)結構觀察一、目的和要求通過實驗及操作，使學生了解孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）對卵巢機能的生理作用，掌握超數(shù)排卵方法。觀察卵子的形態(tài)和結構，充分認識正常與異常卵子的形態(tài)結構及等級劃分標準，為大家畜超數(shù)排卵和胚胎移植打下良好的基礎。二、材料1．實驗動物：5～6周齡昆明白系雌性小鼠。2．藥物與試劑：PMSG、hCG、75％酒精、mPBS液或生理鹽水、礦物油等。3．器材：一次性1ml注射器、鑷子、剪刀、表面皿、巴氏吸管、Ф35mm培養(yǎng)皿、實體顯微鏡等。三、超數(shù)排卵方法及卵子采集取5～6周齡昆明白系雌性小鼠，間隔48h分別腹腔注射5～10IUPMSG和hCG，hCG注射后15h處死、摘取卵巢、輸卵管及子宮置于含有mPBS液的表面皿中，在實體顯微鏡下，小心剔除附著的脂肪和系膜，用mPBS液沖洗3遍后，用眼科小鑷子將輸卵管膨大部撕破，以回收卵丘卵母細胞復合體。用0.1％透明質酸酶處理，脫去卵丘細胞，得到裸卵。還可將卵巢上的卵泡刺破，獲得未成熟卵母細胞。操作液和卵子置于37℃恒溫臺上保存。四、卵子形態(tài)結構觀察將回收的卵子用mPBS洗凈后，移入新鮮的覆蓋有礦物油的100μlmPBS液滴中，在4×10倍以上實體顯微鏡下進行卵子形態(tài)結構觀察及質量鑒定。（一）卵子的結構正常卵子呈球形，其結構包括放射冠、透明帶、卵黃膜和卵黃等部分。（二）卵子形態(tài)和質量鑒定目前對卵子的質量鑒定基本上采用形態(tài)學的方法。1.卵丘卵母細胞復合體卵子周圍的卵丘細胞層的致密程度和卵子形態(tài)學特征進行質量評價。1級：多層致密的卵丘細胞附著在卵子周圍，在顯微鏡下卵母細胞和卵丘細胞都明亮；2級：卵子的細胞質均勻，卵子周圍部分卵丘細胞脫落；3級：卵子的細胞質均勻，但卵子周圍只附著1～2層或完全沒有卵丘細胞；4級：卵子周圍卵丘細胞間呈放射狀散開。2.脫除卵丘細胞后的卵母細胞（1）正常卵子呈圓球形，外周有一圈折光性強且發(fā)亮的透明帶，輪廓清晰，細胞質均勻，色澤和透明度適中。成熟卵母細胞的卵黃周隙中可見第一極體。（2）異常卵子凡是橢圓形或扁形的、有大型極體的、卵黃內有大空泡的、體積過大或過小的、異常卵裂、透明帶破裂或收縮、變形、細胞質顏色發(fā)暗卵黃膜邊緣粗糙、輪廓不清晰、空透明帶等都屬于畸形卵子。五、作業(yè)將觀察到的卵丘卵母細胞復合體、成熟卵母細胞和未成熟卵母細胞繪圖并加以說明。實驗六人工授精器材的認識與假陰道的安裝一、目的和要求1．熟悉人工授精所用的采精和輸精器材，了解其用途及使用方法。2．練習假陰道的安裝方法。二、材料和儀器設備1．采精器材：各種公畜采精用假陰道，牛、羊電刺激采精棒，豬手握法采精用的橡膠手套等。2．輸精器材：各種母畜輸精器、陰道開張器、額燈和手電筒。3．輔助器材及藥品：高壓滅菌器、酒精燈、長柄鉗、鑷子、玻璃棒、棒狀溫度計、漏斗、量杯、滅菌凡士林、70％和95％酒精棉球、滑石粉、來蘇兒、洗衣粉等。三、方法和步驟先由老師講解人工授精器材的構造、各部分名稱和用途，并作假陰道安裝的示范。然后學生分組觀察并作假陰道的安裝練習。（一）人工授精器材的認識：1．假陰道：為長筒狀，由外殼、內胎和集精杯（管）三個主要部分組成。其粗細和長短因畜種而異。不同國家不同時期的設計形式也不盡一致，目前我國常用的有美、蘇和日等形式。外殼：牛、羊和豬的假陰道外殼一般為硬橡膠或塑料制成的圓筒，中部裝有可吹氣、注水和排水的開關。豬用假陰道則在此處連接一個可向假陰道內打氣的雙鏈球，以調節(jié)壓力。馬的假陰道的外殼由鍍鋅鐵皮或金屬制成。分頭、頸和體三部分。筒體的中部裝有把柄，其側面有吹氣和注、排水孔，并有封閉塞或橡膠帶。內胎：由優(yōu)質橡膠制成的膠筒，目前有些國家將其內胎面制成粗糙面，以增強采精時對陰莖的刺激，利于采精。集精杯（管）：牛、羊用雙層的棕色集精杯（蘇式）或有刻度的離心管（美式）。馬用黑色橡皮杯（蘇式）。豬用棕色有刻度的廣口瓶。當用手握法對公豬進行采精時，只需備一只乳膠手套和收集精液的容器即可。集精杯（管）可借橡皮圈直接固定于假陰道的一端或借橡膠漏斗與假陰道連接。2．輸精器：蘇式牛、羊輸精器為一長頸玻璃注射器。目前常用的為金屬或塑料制成的輸精管，其后連接一個橡皮球。冷凍細管精液輸精則使用特制的卡蘇槍或輸精器。對一些家畜的輸精需借助陰道開張器和額燈或手電筒照明進行。開張器的種類和大小因畜種而異。（二）假陰道的準備要點：1．假陰道外殼及內胎的檢查（1）檢查假陰道外殼兩端是否光滑，外殼有否裂隙或開焊之處（特別是馬用外殼）。（2）檢查內胎是否漏水?？蓪忍プM水，用兩手握緊兩端，并扭轉內胎施以壓力，觀察胎壁有無破損漏水之處，如發(fā)現(xiàn)應及時修補或更換。公豬的手握法采精用的乳膠手套在用前也應檢查。2．采精器材的清洗：（1）外殼、內胎、集精杯（管）等用具用后可用熱的洗衣粉水清洗。內胎的油污必須洗凈。（2）以清水沖凈洗衣粉，待自然干燥后即可使用。3．內胎的安裝：將內胎放入外殼，內胎露出外殼兩端的部分長短應相等。而后將其翻轉在外殼外，內胎應平整，不應扭曲，再以橡皮圈加以固定。4．消毒：先以長柄鉗夾取75%的酒精棉球擦拭內胎和集精杯，再以95%的酒精棉球充分擦拭。采精前，最好用稀釋液沖洗1～2次。5．集精杯（管）的的安裝：牛、羊、豬的集精杯（管）可借助特制的保定套或橡皮漏斗與假陰道連接。6．注水：通過注水孔向假陰道內、外壁之間注入50～55℃溫水，使其能在采精時保持38～42℃，注水總量約為內、外壁間容積的1/3～1/2。7．涂潤滑劑：用消毒好的玻璃棒，取滅菌凡士林少許，均勻的涂于內胎的表面，涂抹深度為假陰道長度的1/2左右，潤滑劑不宜過多、過厚，以免混入精液，降低精液品質。當用手握法給公豬采精時不須使用潤滑劑。8．調節(jié)假陰道內腔的壓力：從注氣孔吹入或打入（豬）空氣，根據(jù)不同家畜和個體的要求調整內腔壓力。9．假陰道內腔溫度的測量：把消毒的溫度計插入假陰道內腔，待溫度不變時再讀數(shù)，一般40℃左右為宜，馬可稍高，也要根據(jù)不同個體的要求，作適當調整。10．用一塊褶成四折的消毒紗布蓋住假陰道入口，以防灰塵落入，即可準備采精。（三）輸精器材的準備金屬和玻璃制成的輸精管、輸精槍，最好用高壓蒸汽消毒，在輸精前最好將輸精管用稀釋液沖洗1～2次。細管冷凍精液的輸精器一般由金屬外殼和里面的推桿組成。使用前金屬外套應進行消毒，前端的金屬套不能連續(xù)使用。使用時將細管的一端剪去，棉栓一端插在輸精槍的推桿上。借助推桿，推動細管中的棉栓即可將精液推出。若采用開張器法輸精，需對開張器先進行嚴格消毒方可使用。四、作業(yè)指出各種公畜采精器材的異同及優(yōu)缺點，試提出改進意見。實驗七精子頂體染色一、目的和要求頂體在精子受精過程中起著重要的作用。因它能釋放蛋白質分解酶消化卵丘細胞之間的粘合基質，使精子能夠通過卵的被膜進行受精。由于頂體結構的畸形，可導致受精率降低或者不受精。精子老化或損傷，會引起頂體帽破壞，先是頂體嵴部分變化，最后整個頂體消失。這些變化可用電鏡觀察到。但用微分干涉顯微鏡及相差顯微鏡也能看到。精液冷凍解凍會損傷一些精子，重要的是要準確知道受傷精子百分數(shù)。優(yōu)質奶牛精液冷凍前，約90％精子具有完整的頂體。冷凍后下降至60％～65％。研究表明，頂體完整率和不返情率之間比精子活率與不返情率之間的相關性更強。因而，檢查精子頂體完整率很重要。通過本實驗，要求：1）學習精液抹片染色技術；2）觀察正常精子頂體和異常精子頂體形態(tài)，計算精子頂體完整率。二、材料和儀器設備（一）二人一組，每組所需材料及器材：燒杯2個（大小均可，用于清洗染色片用）；玻璃滴管2支；小磁盤、染色架各一個；衛(wèi)生紙（墊在小磁盤內，以免磁盤被顏色污染）；玻璃平皿1個；切片盒一個；血球計數(shù)器2個；普通光學顯微鏡1臺；鑷子1把。（二）公用器材酒精棉球；姬姆薩（Giemsa）原液（預先一個月前配好）；固定液；擦鏡紙；精液；蒸