植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

植物生理學(xué)

實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

目錄

植物材料的采集、處理與保存..........................................3

實(shí)驗(yàn)一擬南芥種植和形態(tài)觀察........................................7

實(shí)驗(yàn)二植物細(xì)胞的活體染色和死活的鑒定.............................10

實(shí)驗(yàn)三植物原生質(zhì)體的分離和融合...................................12

實(shí)驗(yàn)四植物葉面積測(cè)定原理、方法和步驟.............................16

實(shí)驗(yàn)五植物細(xì)胞滲透勢(shì)的測(cè)定（質(zhì)壁分離法）.........................17

實(shí)驗(yàn)六植物組織水勢(shì)的測(cè)定（小液流法）.............................20

實(shí)驗(yàn)七植物根系活力的測(cè)定（TTC法）................................22

實(shí)驗(yàn)八根系總吸收面積和活躍吸收面積的測(cè)定.........................24

實(shí)驗(yàn)九離體葉綠體的制備以及完整度的測(cè)定...........................27

實(shí)驗(yàn)十葉綠體色素的提取、分離和理化性質(zhì)...........................31

實(shí)驗(yàn)H植物葉片光合速率的測(cè)定（改良半葉法）.....................35

實(shí)驗(yàn)十二氧電極法測(cè)定植物組織的光合與呼吸速率.....................38

實(shí)驗(yàn)十三小籃子法（廣口瓶法）測(cè)定植物的呼吸速率...................43

實(shí)驗(yàn)十四谷物淀粉含量的測(cè)定（旋光法）.............................45

實(shí)驗(yàn)十五類似生長(zhǎng)素對(duì)種子萌發(fā)的影響...............................47

實(shí)驗(yàn)十六赤霉素對(duì)a-淀粉酶的誘導(dǎo)形成..............................48

實(shí)驗(yàn)十七植物種子生活力快速測(cè)定...................................50

實(shí)驗(yàn)十八植物光周期現(xiàn)象的觀察.....................................53

實(shí)驗(yàn)十九植物抗逆性的測(cè)定（電導(dǎo)儀法）.............................55

實(shí)驗(yàn)二十脯氨酸含量的測(cè)定.........................................57

實(shí)驗(yàn)二一丙二醛（MDA）含量的測(cè)定....................................59

實(shí)驗(yàn)二二GUS活性檢測(cè)..............................................62

附錄...........................................................65

主要參考文獻(xiàn).......................................................68

植物材料的采集、處理與保存

植物生理實(shí)驗(yàn)使用的材料非常廣泛，根據(jù)來源可劃分為天然的植物材料（如植物幼苗、

根、莖、葉、花等器官或組織等）和人工培養(yǎng)、選育的植物材料（如雜交種、誘導(dǎo)突變種、

植物組織培養(yǎng)突變型細(xì)胞、愈傷組織、酵母等）兩大類；按其水分狀況、生理狀態(tài)可劃分為

新鮮植物材料（如蘋果、梨、桃果肉，蔬菜葉片，綠豆、豌豆芽下胚軸，麥芽、谷芽，鱗莖、

花椰菜等）和干材料（小麥面粉，玉米粉，大豆粉，根、莖、葉干粉，干酵母等）兩大類，

因?qū)嶒?yàn)?zāi)康暮蜅l件不同，而加以選擇。

植物材料的采集和處理，是植物生理研究測(cè)定中的重要環(huán)節(jié)。在實(shí)際工作中，往往容易

把注意力集中在具體的儀器測(cè)定上，而對(duì)于如何正確地采集和處理樣品卻不夠注意，結(jié)果導(dǎo)

致了較大的實(shí)驗(yàn)誤差，甚至造成整個(gè)測(cè)定結(jié)果的失敗。因此，必須對(duì)樣品的采集、處理與保

存給予足夠的重視。

一、原始樣品及平均樣品的采取、處理

植物生理研究測(cè)定結(jié)果的可靠性（或準(zhǔn)確性），首先取決于試材對(duì)總體的代表性，如果采

樣缺乏代表性，那么測(cè)定所得數(shù)據(jù)再精確也沒有意義。所以，樣品的采集除必須遵循田間試

驗(yàn)抽樣技術(shù)的一般原則外，還要根據(jù)不同測(cè)定項(xiàng)目的具體要求，正確采集所需試材。目前，

隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)該不斷提高采樣技術(shù)的水平。

在作物苗期的許多生理測(cè)定項(xiàng)目中都需要采集整株的試材樣品，在作物中后期的一些生

理測(cè)定項(xiàng)目中，如作物群體物質(zhì)生產(chǎn)的研究，也需要采集整株的試材樣品，有時(shí)雖然是測(cè)定

植株的部分器官，但為了維持器官的正常生理狀態(tài)，也需要進(jìn)行整株采樣。

除研究作物群體物質(zhì)生產(chǎn)外，對(duì)于作物生理過程的研究來說，許多生理指標(biāo)測(cè)定中的整

株采樣，也只是對(duì)地上部分的采樣，沒有必要連根采樣，當(dāng)然對(duì)根系的研究測(cè)定例外。采樣

時(shí)間因研究目的而不同，如按生育時(shí)期或某一特殊需要的時(shí)間進(jìn)行。除逆境生理研究等特殊

需要外，所取植株應(yīng)是能代表試驗(yàn)小區(qū)正常生育無損傷的健康植株。

為了保證植物材料的代表性，必須運(yùn)用科學(xué)方法采取材料。從大田或?qū)嶒?yàn)地、實(shí)驗(yàn)器皿

中采取的植物材料，稱為“原始樣品”，再按原始樣品的種類（如植物的根、莖、葉、花、果

實(shí)、種子等）分別選出“平均樣品”，然后根據(jù)分析的目的、要求和樣品種類的特征，采用適

當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑥摹捌骄鶚悠贰敝羞x出供分析用的“分析樣品”。

（一）原始樣品的取樣法

1.隨機(jī)取樣

在試驗(yàn)區(qū)（或大田）中選擇有代表性的取樣點(diǎn)，取樣點(diǎn)的數(shù)目視田塊的大小而定。選好

點(diǎn)后，隨機(jī)采取一定數(shù)量的樣株，或在每一個(gè)取樣點(diǎn)上按規(guī)定的面積從中采取樣株。

2.對(duì)角線取樣

在試驗(yàn)區(qū)（或大田）可按對(duì)角線選定五個(gè)取樣點(diǎn)，然后在每個(gè)點(diǎn)上隨機(jī)取一定數(shù)量的樣

株，或在每個(gè)取樣點(diǎn)上按規(guī)定的面積從中采取樣株。

（二）平均樣品的取樣法

1.混合取樣法

一般顆粒狀（如種子等）或已碾磨成粉末狀的樣品可以采取混合取樣法進(jìn)行。具體的做

法為：將供采取樣品的材料鋪在木板（或玻璃板、牛皮紙）上成為均勻的一層，按照對(duì)角線

劃分為四等分。取對(duì)角的兩份為進(jìn)一步取樣的材料，而將其余的對(duì)角兩份淘汰。再將已取中

的兩份樣品充分混合后重復(fù)上述方法取樣。反復(fù)操作，每次均淘汰50%的樣品，直至所取

樣品達(dá)到所要求的數(shù)量為止。這種取樣的方法叫做“四分法二

一般禾谷類、豆類及油料作物的種子均可采用這個(gè)方法采取平均樣品，但注意樣品中不

要混有不成熟的種子及其他混雜物。

2.按比例取樣法

有些作物、果品等材料，在生長(zhǎng)不均等的情況下，應(yīng)將原始樣品按不同類型的比例選取

平均樣品。例如對(duì)甘薯、甜菜、馬鈴薯等塊根、塊莖材料選取平均樣品時(shí)，應(yīng)按大、中、小

不同類型的樣品的比例取樣，然后再將每一單個(gè)樣品縱切剖開，每個(gè)切取1/4、1/8或

1/16,混在一起組成平均樣品。

在采取果實(shí)的平均樣品時(shí)，如桃、梨、蘋果、柑橘等果實(shí)，即使是從同一株果樹上取樣,

也應(yīng)考慮到果枝在樹冠上的各個(gè)不同方位和部位以及果實(shí)體積的大、中、小和成熟度上的差

異，按各自相關(guān)的比例取樣，再混合成平均樣品。

（三）取樣注意事項(xiàng)

1.取樣的地點(diǎn)，一般在距田填或地邊一定距離的株行取樣，或在特定的取樣區(qū)內(nèi)取樣。

取樣點(diǎn)的四周不應(yīng)該有缺株的現(xiàn)象。

2.取樣后，按分析的目的分成各部分（如根、莖、葉、果等），然后捆齊，并附上標(biāo)簽，

裝入紙袋。有些多汁果實(shí)取樣時(shí)，應(yīng)用鋒利的不銹鋼刀剖切，并注意勿使果汁流失。

3.對(duì)于多汁的瓜、果、蔬菜及幼嫩器官等樣品，因含水分較多，容易變質(zhì)或霉?fàn)€，可以

在冰箱中冷藏，或進(jìn)行滅菌處理或烘干以供分析之用。

4.選取平均樣品的數(shù)量應(yīng)當(dāng)不少于供分析用樣品的兩倍。

5.為了動(dòng)態(tài)地了解供試驗(yàn)用的植物在不同生育期的生理狀況，常按植物不同的生育期采

取樣品進(jìn)行分析。取樣方法系在植物的不同生育時(shí)期先調(diào)查植株的生育狀況并區(qū)分為若干類

型，計(jì)算出各種類型植株所占的百分比，再按此比例采取相應(yīng)數(shù)目的樣株作為平均樣品。

二、分析樣品的處理和保存

1.從田間采取的植株樣品，或是從植株上采取的器官組織樣品，在正式測(cè)定之前的一段

時(shí)間里，如何正確妥善的保存和處理是很重要的，它也關(guān)系到測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

一般測(cè)定中，所取植株樣品應(yīng)該是生育正常無損傷的健康材料。取下的植株樣品或器官

組織樣品，必須放入事先準(zhǔn)備好的保濕容器中，以維持試樣的水分狀況和未取下之前基本一

致。否則，由于取樣后的失水，特別是在田間取樣帶回室內(nèi)的過程中，由于強(qiáng)烈失水，使離

體材料的許多生理過程發(fā)生明顯的變化，用這樣的試材進(jìn)行測(cè)定，就不可能得到正確可靠的

結(jié)果。為了保持正常的水分狀況，在剪取植株樣品后，應(yīng)立即插入有水的桶中，對(duì)于枝條，

還應(yīng)該立即在水中進(jìn)行第二次剪切，即將第一次切口上方的一段在水中剪去，以防輸導(dǎo)組織

中水柱被拉斷，影響正常的水分運(yùn)輸。對(duì)于器官組織樣品，如葉片或葉組織，在取樣后就應(yīng)

立即放入已鋪有濕紗布帶蓋的瓷盤中，或鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中。對(duì)于干旱研究的有關(guān)試材，

應(yīng)盡可能維持其原來的水分狀況。

采回的新鮮樣品（平均樣品）在做分析之前，一般先要經(jīng)過凈化、殺青、烘干（或風(fēng)干）

等一系列處理。

（1）凈化：新鮮樣品從田間或試驗(yàn)地取回時(shí)，常沾有泥土等雜質(zhì)，應(yīng)用柔軟濕布擦凈，

不應(yīng)用水沖洗。

（2）殺青：為了保持樣品化學(xué)成分不發(fā)生轉(zhuǎn)變和損耗，應(yīng)將樣品置于105c的烘箱中

烘15min以終止樣品中酶的活動(dòng)。

（3）烘干：樣品經(jīng)過殺青之后，應(yīng)立即降低烘箱的溫度，維持在70-80°C,直到烘至

恒重。烘干所需的時(shí)間因樣品數(shù)量和含水量、烘箱的容積和通風(fēng)性能而定。在無烘箱的條件

下，也可將樣品置蒸籠中以蒸汽殺青，而后于陰涼通風(fēng)處風(fēng)干。但在蒸汽殺青過程中，常有

可溶性物質(zhì)的外滲損失，因此，此法僅可作為測(cè)量大量樣品干重時(shí)的變通方法，在進(jìn)行成分

分析時(shí)應(yīng)盡量避免。烘干時(shí)應(yīng)注意溫度不可過高，否則會(huì)把樣品烤焦，特別是含糖較多的樣

品，在高溫下更易焦化。為了更精密地分析，避免某些成分的損失（如蛋白質(zhì)、維生素、糖

等），在條件許可的情況下最好采用真空干燥法。

此外，在測(cè)定植物材料中酶的活性或某些成分（如維生素C、DNA、RNA等）的含量

時(shí)，需要用新鮮樣品。取樣時(shí)注意保鮮，取樣后應(yīng)立即進(jìn)行待測(cè)組分提?。灰部刹捎靡旱?/p>

冷凍保存或冰凍真空干燥法得到干燥的制品。放在0-4℃冰箱中保存即可。在鮮樣已進(jìn)行了

勻漿，尚未完成提取、純化，不能進(jìn)行分析測(cè)定等特殊情況下，也可加入防腐劑（甲苯、苯

甲酸），以液態(tài)保存在緩沖液中，置于0-4c冰箱即可。但保存時(shí)間不宜過長(zhǎng)。

2.已經(jīng)烘干（或風(fēng)干）的樣品，可根據(jù)樣品的種類、特點(diǎn)進(jìn)行以下處理：

（1）種子樣品的處理：一般種子（如禾谷類種子）的平均樣品清除雜質(zhì)后要進(jìn)行磨碎，

在磨碎樣品前后都應(yīng)徹底清除磨粉機(jī)（或其他碾磨用具）內(nèi)部的殘留物，以免不同樣品之間

的機(jī)械混雜，也可將最初磨出的少量樣品棄去，然后正式磨碎，最后使樣品全部無損地通過1

mm篩孔的篩子，混合均勻作為分析樣品貯存于具有磨口玻塞的廣口瓶中，貼上標(biāo)簽，注明樣

品的采取地點(diǎn)、試驗(yàn)處理、采樣日期和采樣人姓名等。長(zhǎng)期保存的樣品，貯存瓶上的標(biāo)簽還

需要涂蠟。為防止樣品在貯存期間生蟲，可在瓶中放置一點(diǎn)樟腦或?qū)ξ欢燃妆健?/p>

對(duì)于油料作物種子（如芝麻、亞麻、花生、薨麻等）需要測(cè)定其含油量時(shí)，不應(yīng)當(dāng)用磨

粉機(jī)磨碎，否則樣品中所含的油分會(huì)吸附在磨粉機(jī)上將明顯地影響分析的準(zhǔn)確性。所以，對(duì)

于油料種子應(yīng)將少量樣品放在研缽內(nèi)研碎或用切片機(jī)切成薄片作為分析樣品。

（2）莖稈樣品的處理：烘干（或風(fēng)干）的莖稈樣品，均要進(jìn)行磨碎，磨莖稈用的電磨與

磨種子的磨粉機(jī)結(jié)構(gòu)不同，不宜用磨種子的電磨來磨碎莖稈。如果莖稈樣品的含水量偏高而

不利于磨碎時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步烘干后再進(jìn)行磨碎。

-1倍的蒸儲(chǔ)水。充分搗碎后的樣品應(yīng)成漿狀，從中取出混合均勻的樣品進(jìn)行分析。如果

不能及時(shí)分析，最好不要急于將其搗碎，以免其中化學(xué)成分發(fā)生變化而難以準(zhǔn)確測(cè)定。

有些蔬菜（如含水分不太多的葉菜類、豆類、干菜等）的平均樣品可以經(jīng)過干燥磨碎，

也可以直接用新鮮樣品進(jìn)行分析。若采用新鮮樣品，可采用上述方法在電動(dòng)搗碎機(jī)內(nèi)搗碎，

也可用研缽（必要時(shí)加少許干凈的石英砂）充分研磨成勻漿，再進(jìn)行分析。

在進(jìn)行新鮮材料的活性成分（如酶活性）測(cè)定時(shí)，樣品的勻漿、研磨一定要在冰浴上或

低溫室內(nèi)操作。新鮮樣品采后來不及測(cè)定的，可放入液氮中速凍，再放入-70℃冰箱中保存。

測(cè)定材料在取樣后，一般應(yīng)在當(dāng)天測(cè)定使用，不應(yīng)該過夜保存。需要過夜時(shí)，也應(yīng)在較

低溫度下保存，但在測(cè)定前應(yīng)使材料溫度恢復(fù)到測(cè)定條件的溫度。

對(duì)于采集的籽粒樣品，在剔除雜質(zhì)和破損籽粒后，一般可用風(fēng)干法進(jìn)行干燥。但有時(shí)根

據(jù)研究的要求，也可立即烘干。對(duì)葉片等組織樣品，在取樣后則應(yīng)立即烘干。為了加速烘干,

對(duì)于莖稈、果穗等器官組織應(yīng)事先切成細(xì)條或碎塊。

實(shí)驗(yàn)一擬南芥種植和形態(tài)觀察

一、實(shí)驗(yàn)原理

擬南芥屬thaliana）十字花科，被子植物門，雙子葉植物綱。

二年生草本，高7-40厘米?；~有柄呈蓮座狀，葉片倒卵形或匙形；莖生葉

無柄，披針形或線形?？偁罨ㄐ蝽斏ò?片，白色，匙形。長(zhǎng)角果線形，長(zhǎng)

1--5月。我國(guó)內(nèi)蒙、新疆、陜西、甘肅、西藏、山東、江蘇、安徽、湖北、四川、

云南等省區(qū)均有發(fā)現(xiàn)。擬南芥的優(yōu)點(diǎn)是植株?。?個(gè)茶杯可種植好幾棵）、每代時(shí)

間短（從發(fā)芽到開花不超過6周）、結(jié)籽多（每棵植物可產(chǎn)很多粒種子）、生活力

強(qiáng)（用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng)）。擬南芥的基因組是目前已知植物基因組的

1/80,這就使克隆它的的有關(guān)基因相對(duì)說來比較容易。擬南芥是自花受粉植物，

基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。

例如用含殺草劑的培養(yǎng)基來篩選，一般獲得抗殺草劑的突變率是1/100000。由于

上述這些優(yōu)點(diǎn)，所以，廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究，

已成為一種典型的模式植物。

二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備

（-）實(shí)驗(yàn)材料：擬南芥種子

（二）試劑：PNS營(yíng)養(yǎng)液（1L）

母液毫升

母液15

母液22

母液32

母液4

母液5

母液61

PNS營(yíng)養(yǎng)液母液配方

母液1：IMKNO：S

母液2：IMCa(N03)2?4H#

母液3：IMMgSO.1,7HQ

母液4：20mM

FeS04

EDTA

注意先各自配成溶液，再混合。

磷酸二氫鉀

磷酸氫二鉀

母液6：MS微量元素

硼酸

硫酸鎰(MnSO,H20)

CuS04'H，0

ZnSO,,7H20

NaMoOt,2H,0

NaCl

CoCi,6IL0

以上母液均配至IL,配制時(shí)使用滅菌的雙蒸水。配制后4c冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

人工土：3份蛭石，1份珍珠巖和1份黑土混合。

(三)儀器設(shè)備：培養(yǎng)皿，鑲子，托盤，保鮮膜，花盆，人工氣候箱。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.將春化過的擬南芥種子種于澆過飽和PNS營(yíng)養(yǎng)液的人工土中，并用保鮮

膜罩上。兩天后光照，三天后揭膜。

2.人工培養(yǎng)室條件：相對(duì)濕度80%,恒溫20-24°C,光照強(qiáng)度

80-200umol/M7S,光照周期為8h黑暗、16h光照培養(yǎng)。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

每隔三天觀察生長(zhǎng)情況，并適時(shí)澆水。按照下表記錄擬南芥的生長(zhǎng)情況。

株高(cm)葉片花果莢收獲

第1天

第4天

第7天

第10天

第13天

第16天

第19天

第22天

第25天

第28天

第31天

第34天

第37天

第40天

第43天

第47天

第50天

第53天

第56天

第60天

五、思月章題

1.繪制擬南芥的株高的生長(zhǎng)曲線。

2.為什么說擬南芥是模式植物？

3.擬南芥的特點(diǎn)？

實(shí)驗(yàn)二植物細(xì)胞的活體染色和死活的鑒定

一、實(shí)驗(yàn)原理

用某種對(duì)植物無害的染料稀溶液對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色稱活體染色。中性紅（2-

甲基-3-氨基-6-二甲氨基二氮雜恿鹽酸鹽，3-氨基-6-二甲氨基-2-甲基吩嗪鹽酸

鹽，Neutralred,Neutralredchloride,Toluylenered,

Aminodimethy1aminotoluaminozine,

3-Amino-6-dimethylamino-2-methylphenazinehydrochloride0分子式：

C,5H,7CIN,1；分子量：。）是常用的活體染料之一。深綠色、棕色或淺黑色結(jié)晶-

成長(zhǎng)的細(xì)胞是一個(gè)滲透系統(tǒng)，活的原生質(zhì)具有選擇透性，原生質(zhì)內(nèi)部包含著

一個(gè)大液泡，具有一定的溶質(zhì)勢(shì)。當(dāng)細(xì)胞與外界低水勢(shì)溶液接觸時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的水

分外滲，原生質(zhì)隨著液泡一起收縮而發(fā)生質(zhì)壁分離；其后，當(dāng)與清水（或高水勢(shì)

溶液）接觸，細(xì)胞又因液泡的吸水膨脹而發(fā)生質(zhì)壁分離復(fù)原。死細(xì)胞因其原生質(zhì)

的選擇透性已遭破壞，故與低水勢(shì)溶液接觸時(shí)不產(chǎn)生質(zhì)壁分離。

二、材料、儀器設(shè)備及試劑

1.材料：洋蔥；

2.儀器設(shè)備：不銹鋼單面刀片；鑲子；吸水紙；酒精燈；載玻片；蓋玻片；

膠頭滴管；顯微鏡；

3.試劑：蔗糖液；0.1%中性紅溶液母液。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.制片染色

?左右的小塊，用尖頭鏡子輕輕地撕取洋蔥（玉蔥）鱗片內(nèi)表皮薄片，浸到％

中性紅溶液中10T5min進(jìn)行染色。

2.觀察

將染色后的植物材料放到載玻片上，用弱堿性水略加清洗后，蓋好蓋玻片，

在蓋玻片的一側(cè)滴加去離子水（或pH略高于的自來水），然后在顯微鏡下觀察，

可以看出液泡染成櫻桃紅色；原生質(zhì)層（細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞）則無色透明緊貼細(xì)胞壁

（注意：在細(xì)胞的角隅上可以看見）。

在第1項(xiàng)觀察后，接著從蓋玻片的一邊滴2滴蔗糖液，在蓋玻片的另一

邊用吸水紙吸蓋玻片下的水，將蔗糖液引入蓋玻片下浸漬植物材料，并立即鏡檢,

可以看到細(xì)胞很快發(fā)生質(zhì)壁分離。先是凹形質(zhì)壁分離，而后變?yōu)橥剐钨|(zhì)壁分離。

在第2項(xiàng)觀察后，接著在蓋玻片的一邊加入2-3滴去離子水，在另一邊用吸

水紙吸去糖液，將去離子水引入蓋玻片底，立即鏡檢可以看到帶有液泡的原生質(zhì)

體重新吸水膨大，最后充滿整個(gè)細(xì)胞腔，即質(zhì)壁分離復(fù)原（復(fù)原緩慢進(jìn)行時(shí)，細(xì)

胞仍可正常存活；如果進(jìn)行很快，則會(huì)因原生質(zhì)機(jī)械破壞而死亡，注意觀察機(jī)械

損傷的細(xì)胞的特點(diǎn)）。

將一片經(jīng)中性紅染色的植物材料放在載玻片上，加一滴去離子水后加蓋玻

片，在酒精燈火焰上微微加熱，然后在顯微鏡下觀察，可以看到細(xì)胞質(zhì)凝結(jié)成不

均勻的凝膠狀，與細(xì)胞核一起染成紅色。然后按法加蔗糖液也不發(fā)生質(zhì)壁分

離。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果收集照片。

五、思考題

1.活體細(xì)胞觀察應(yīng)該注意什么？

2.機(jī)械損傷后的細(xì)胞有什么特點(diǎn)？

實(shí)驗(yàn)三植物原生質(zhì)體的分離和融合

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、掌握原生質(zhì)體分離的方法；

2、了解并掌握利用PEG原生質(zhì)體融合的原理和方法。

一、實(shí)驗(yàn)原理：

植物原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)在理論和實(shí)踐上都有很大的意義，在植物遺傳工程

和育種研究上具有廣闊的應(yīng)用前景。它是植物同源、異源多倍體獲得的途徑之一,

它不僅能克服遠(yuǎn)源雜交有性不親和障礙，也可克服傳統(tǒng)的通過有性雜交誘導(dǎo)多倍

體植株的麻煩，最終將野生種的遠(yuǎn)源基因?qū)朐耘喾N中，原生質(zhì)體融合技術(shù)可望

成為作物改良的有力工具之一。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)方法起源于植物單細(xì)胞的培養(yǎng)

方法。1954年，植物單細(xì)胞培養(yǎng)才獲得成功。Mllir培養(yǎng)的萬壽菊及煙草懸浮細(xì)

胞植入到長(zhǎng)有愈傷組織的培養(yǎng)基上得到了它們的單細(xì)胞克隆，并建立了看護(hù)培養(yǎng)

的方法；1960年，Jone等建立了微室培養(yǎng)法。同年，Cocking應(yīng)用酶法分離原生

質(zhì)獲得成功，從而在實(shí)驗(yàn)條件下很容易獲得大量的原生質(zhì)體。隨著多種適用原生

質(zhì)體分離的商品酶的出現(xiàn)，原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法也得到了不斷地改進(jìn)，現(xiàn)在常用

的原生質(zhì)體培養(yǎng)方法有：液體淺層培養(yǎng)法、雙層培養(yǎng)法、瓊脂糖包埋法、瓊脂島

培養(yǎng)法以及使用條件培養(yǎng)基或飼喂培養(yǎng)等。

植物原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁后為原生質(zhì)所包圍的“裸露細(xì)胞”，是開展基礎(chǔ)

研究的理想材料。其中酶解法分離原生質(zhì)體是一個(gè)常用的技術(shù)，其原理是植物細(xì)

胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和

果膠酶能降解細(xì)胞壁成分，除去細(xì)胞壁，即可得到原生質(zhì)體。由于原生質(zhì)體內(nèi)部

與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細(xì)胞膜，必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保

持其完整性。其次，還應(yīng)當(dāng)考慮取材、酶的種類和純度、酶液的滲透壓、酶解時(shí)

間及溫度等因素對(duì)分離原生質(zhì)體的影響。測(cè)定原生質(zhì)體的活性有多種方法。熒光

素雙醋酸酯(FDA)染色是常用的一種方法,FAD本身無熒光，無極性，可透過完整

的原生質(zhì)膜。一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后，由于受到酯酶分解而產(chǎn)生具有熒光的極性物

質(zhì)熒光素。它不能自由出入原生質(zhì)膜,因此有活力的細(xì)胞能產(chǎn)生熒光,無活力的原

生質(zhì)體不能分解FAD無熒光產(chǎn)生。許多化學(xué)、物理學(xué)和生物學(xué)方法可誘導(dǎo)原生質(zhì)

體融合，現(xiàn)在被廣泛采用并證明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高

鈣高pH法和電融合法；聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，20-50%的濃

度能對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應(yīng)，原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮與粘連，隨后用高鈣

高pH法進(jìn)行清洗，使原生質(zhì)體融合得以完成。聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)的機(jī)理：聚

乙二醇（PEG）由于含有酸鍵而具有負(fù)極性，與水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等一些

正極化基團(tuán)能形成氫鍵，當(dāng)聚乙二醇（PEG）分子足夠長(zhǎng)時(shí)，可作為臨近原生質(zhì)

表面之間的分子橋而使之粘連、聚乙二醇（PEG）也能連接鈣等陽離子，鈣可在

一些負(fù)極化基團(tuán)和聚乙二醇（PEG）之間形成橋，因而促進(jìn)粘連。從而引起原生

質(zhì)體融合：高鈣高pH由于增加了質(zhì)膜的流動(dòng)性，因而也大大提高了融合頻率，

洗滌時(shí)滲透壓沖擊也可能起作用。原生質(zhì)體分離純化后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上應(yīng)用

合適的培養(yǎng)方法，能夠再生細(xì)胞壁，并啟動(dòng)細(xì)胞持續(xù)分裂，直至形成細(xì)胞團(tuán)，長(zhǎng)

成愈傷組織或胚狀體，再分化發(fā)育成苗。其中，選擇合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法時(shí)

原生質(zhì)體培養(yǎng)中最基礎(chǔ)也是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。PEG為一種高分子化合物，能與水、

蛋白質(zhì)、和碳水化合物等一些基團(tuán)能形成氫鍵。普遍認(rèn)為聚乙二醇分子能改變各

類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩

細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生

融合。該方法的優(yōu)點(diǎn)是：用法簡(jiǎn)單，容易獲得融合體，融合效果好。

二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備：

（-）實(shí)驗(yàn)材料：

（1）韭菜或大蒜葉；

（2）紅辣椒

（二）試劑:

（1）20%蔗糖；

（2）13%CPW洗液:

3）

2?2H20）

gSO.）

4）

13%W/V甘露醇

（3）酶液：

1%纖維素酶

1%果膠酶

2Poi

10mM兩個(gè)結(jié)晶水的氯化鈣（CaCk?2HQ）

（4）40%PEG液:

40%PEG液（MW1500-6000）

2?2H20）

2POI）o

（三）儀器設(shè)備：350目網(wǎng)，離心機(jī)，試管，離心管，吸管，顯微鏡，恒溫

水浴鍋。

三、實(shí)驗(yàn)步驟：

植物原生質(zhì)體的分離與純化

25c黑暗條件下，酶解1-2小時(shí)。

2、用350目網(wǎng)過濾除去未完全消化的葉片等殘?jiān)?/p>

3、在lOOOrpm條件下離心5分鐘，棄上清液。紅辣椒800轉(zhuǎn)/分離心5分

鐘。加入3-4ml13/CPW洗液，相同條件下離心,棄上清液。加1ml13隊(duì)PW洗

液懸浮。

4、蔗糖漂浮法去除碎片。

蔗糖漂浮方法：

（1）用細(xì)口吸管吸20%蔗糖溶液約3ml,小心插入盛有原生質(zhì)體懸液的離心

管底部，緩緩將蔗糖溶液擠出，由于比重不同，蔗糖溶液與原生質(zhì)體懸液中間有

一明顯界面（注意要有明顯界面）.

（2）離心5分鐘（韭菜1000轉(zhuǎn)/分，辣椒800轉(zhuǎn)/分），此時(shí)死細(xì)胞及碎片降

至蔗糖溶液內(nèi)，聚集在離心管底部，而活細(xì)胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界

面處，

（3）用細(xì)管吸取漂浮在上下界面處的健康原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，

加入3-4ml13版PW洗液離心（鏡檢決定是否需要離心），離心5分鐘（韭菜1000

轉(zhuǎn)/分，辣椒800轉(zhuǎn)/

細(xì)胞融合

1.不同的原生質(zhì)體各300u1與帶蓋離心管中，另加入300u140%PEG液,

30C水浴中溫浴15min；

2.融合液一滴于載玻片上（注意保持一定濕度，不能太干），輕輕蓋上蓋玻片，

顯微鏡觀察。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

用光學(xué)顯微鏡或倒置顯微鏡（高倍）觀察2-3個(gè)細(xì)胞靠近或融合的過程式觀

察時(shí)注意不同程度的融合現(xiàn)象。通常分為五個(gè)階段。①兩細(xì)胞膜接觸，粘連；②

細(xì)胞膜形成穿孔；③兩細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)連通；④通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成一體；⑤細(xì)

胞完全合并，形成一個(gè)含有兩個(gè)或多個(gè)核的圓形細(xì)胞。）

五、思考題

1.繪制原生質(zhì)體融合的基本過程；

2.簡(jiǎn)述細(xì)胞融合的原理

3.做細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)注意哪些問題？

實(shí)驗(yàn)四植物葉面積測(cè)定原理、方法和步驟

植物的生長(zhǎng)與葉面積密切相關(guān)，一方面葉面積的大小影響了植物的光合物質(zhì)

積累，另一方面掌握的生長(zhǎng)又通過葉面積的變化得到體現(xiàn)，因此測(cè)定植物的葉面

積對(duì)于植物的生長(zhǎng)生理、光合生理和逆境生理具有重要的意義。

一、實(shí)驗(yàn)原理

植物的生長(zhǎng)與葉面積密切相關(guān)，一方面葉面積的大小影響了植物的光合物質(zhì)

積累，另一方面掌握的生長(zhǎng)又通過葉面積的變化得到體現(xiàn)，因此測(cè)定植物的葉面

積對(duì)于植物的生長(zhǎng)生理、光合生理和逆境生理具有重要的意義。可以用葉面積儀

直接測(cè)定，沒有條件的試驗(yàn)室也可以通過測(cè)量、稱重的方法測(cè)得。

二、材料與用品

校園里各種植物葉片

直尺、剪刀、復(fù)印紙、電子天平等

三、方法與步驟

1、從葉片基部用剪刀小心剪取10片葉片。

2、用直尺量取每一片葉的最長(zhǎng)處為葉長(zhǎng)、最寬處為葉寬，記錄下來。

3、將葉片固定在復(fù)印紙上，用鉛筆沿葉緣將葉片形狀描下來，用剪刀剪下來。

4、將剪下的紙葉子在電子天平上稱重，記錄。

5、稱出一張復(fù)印紙的質(zhì)量，測(cè)量出長(zhǎng)和寬，計(jì)算出紙的面積，然后換算出每

克重量所對(duì)應(yīng)的紙面積。

6、將剪下來的紙葉子的質(zhì)量換算成面積，是為每片葉的面積。

7、用每片葉的面積除以其長(zhǎng)度與寬度的乘積，可以得到一個(gè)小于1的系數(shù)，

該系數(shù)與葉片的形狀有關(guān)，稱為形狀系數(shù)或校正因子，計(jì)算10片葉子的形狀系

數(shù)，算出其平均值。在以后的測(cè)量中，可以只用直尺測(cè)量該種植物葉片的長(zhǎng)和寬，

二者的乘積乘以形狀系數(shù)，即為葉面積。

8、測(cè)定形狀不規(guī)則葉片的葉面積可按照上述1,2,3,4,5,6步操作。

四、結(jié)果與分析

測(cè)量出葉片的長(zhǎng)和寬，計(jì)算出葉面積和形狀系數(shù)。

實(shí)驗(yàn)五植物細(xì)胞滲透勢(shì)的測(cè)定（質(zhì)壁分離法）

一、實(shí)驗(yàn)原理

植物細(xì)胞的滲透勢(shì)主要取決于液泡的溶質(zhì)濃度，因此又稱溶質(zhì)勢(shì)。滲透勢(shì)與

植物水分代謝、生長(zhǎng)及抗逆性等有密切關(guān)系。已知在干旱、鹽漬等條件下，一些

植物常在細(xì)胞內(nèi)主動(dòng)積累溶質(zhì)，以降低其滲透勢(shì)，增加吸水能力，而在一定程度

上維持細(xì)胞膨壓，保障細(xì)胞的生長(zhǎng)和氣孔的開放，這種現(xiàn)象叫做滲透調(diào)節(jié)作用。

滲透調(diào)節(jié)能力的大小可以用逆境條件下細(xì)胞的滲透勢(shì)的降低值來表示，在水分生

理與抗逆性生理研究中經(jīng)常需要測(cè)定植物細(xì)胞的滲透勢(shì)。

將植物組織放入一系列不同濃度的蔗糖溶液中，經(jīng)過一段時(shí)間，植物細(xì)胞與

蔗糖溶液間將達(dá)到滲透平衡狀態(tài)。如果在某一溶液中細(xì)胞脫水達(dá)到平衡時(shí)剛好處

于臨界質(zhì)壁分離狀態(tài)，則細(xì)胞的壓力勢(shì)（中p）將下降為零。此時(shí)細(xì)胞液的滲透

勢(shì)（中S）等于外液的滲透勢(shì)中so。此溶液稱為該組織的等滲溶液，其濃度稱為

該組織的等滲濃度，即可計(jì)算出細(xì)胞液的滲透勢(shì)（甲S）。實(shí)際測(cè)定時(shí)，因?yàn)榕R界

質(zhì)壁分離狀態(tài)難以在顯微鏡下直接觀察到，所以一般均以初始質(zhì)壁分離作為判斷

等滲濃度的標(biāo)準(zhǔn)。處于初始質(zhì)壁分離狀態(tài)的細(xì)胞體積，比吸水飽和時(shí)略小，故細(xì)

胞液濃縮而滲透勢(shì)略低于吸水飽和狀態(tài)時(shí)的滲透勢(shì)稱基態(tài)滲透勢(shì)。

二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備

（-）實(shí)驗(yàn)材料

紫皮洋蔥鱗莖

（二）試劑

1.1mol/L蔗糖水溶液：稱取預(yù)先在60-80C下烘干的蔗糖溶于60ml蒸

儲(chǔ)水中，定容到100ml。

3.蔗糖系列標(biāo)準(zhǔn)液：取干燥潔凈的小試劑瓶7支編號(hào)，用1mol/L蔗糖水

溶液依據(jù)C1XV1=C2XLLLLLLL等一系列不同濃度的蔗糖水溶液（具體范圍可

根據(jù)材料不同而加以調(diào)整），貯于試劑瓶中，瓶口加塞以防蒸發(fā)濃縮。取不同濃

度的蔗糖溶液10ml稱重，計(jì)算其密度。

（三）儀器設(shè)備

顯微鏡，載玻片，蓋玻片，溫度計(jì)，尖頭鏡子，刀片，直徑6cm小培養(yǎng)皿,

試劑瓶若干，燒杯，容量瓶，量筒，吸管，吸水紙適量。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.取干燥、潔凈的培養(yǎng)皿7套編號(hào)，將配制好的不同濃度的蔗糖溶液約5ml

按順序加入各培養(yǎng)皿，使之成一薄層，蓋好皿蓋備用。

2,迅速分別投入各種濃度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，每一濃度4-

3.5-10min后，取出表皮薄片放在滴有同樣溶液的載玻片上，蓋上蓋玻片，

于低倍顯微鏡下觀察，如果所有細(xì)胞都產(chǎn)生質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，則取低濃度溶液中

的制片作同樣觀察，并記錄質(zhì)壁分離的相對(duì)程度。如果在兩個(gè)相鄰濃度的切片中，

一個(gè)沒有發(fā)生質(zhì)壁分離或質(zhì)壁分離的細(xì)胞不足50%,另一個(gè)發(fā)生質(zhì)壁分離的細(xì)胞

數(shù)超過50%,則可粗略地將這兩個(gè)濃度的平均值作為其等滲濃度，也可用插值法

更準(zhǔn)確地確定等滲濃度。每一制片觀察的細(xì)胞不應(yīng)少于100個(gè)。檢查時(shí)可先從中

間濃度開始。

在找到上述濃度極限時(shí)，用新的溶液和新鮮的葉片重復(fù)進(jìn)行幾次，直至有把

握確定為止。在此條件下，細(xì)胞的滲透勢(shì)與兩個(gè)極限溶液濃度之平均值的滲透勢(shì)

相等。

4.也可用CaCk或NaCl代替蔗糖，但須改變式中等滲系數(shù)。CaCl2?

將結(jié)果記錄于下表中。

植物細(xì)胞滲透勢(shì)測(cè)定記載表

實(shí)驗(yàn)人日期材料名稱實(shí)驗(yàn)

室溫度

蔗糖濃度（mol/kg）滲透勢(shì)（Mpa）質(zhì)壁分離細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)

*100%

四、結(jié)果計(jì)算

由所得到的等滲濃度和測(cè)定的室溫，用下式計(jì)算供試溶液的滲透勢(shì)（中so）,

即為細(xì)胞的滲透勢(shì)(Ws)。

Ws(MPa)=Wso=-iCRT

式中，Wso——供試溶液的滲透勢(shì)，MPao

i一一解離系數(shù)，蔗糖=1o

C——供試溶液的濃度，mol/L(以水作溶劑)。

R-----MPa/(mol?K)］。

T——絕對(duì)溫度，(273+t℃),Ko

五、思考題

1、某種植物葉片吸水飽和時(shí)的滲透勢(shì)經(jīng)測(cè)定為--

2、試問不同植物材料得滲透勢(shì)是否相同？

實(shí)驗(yàn)六植物組織水勢(shì)的測(cè)定（小液流法）

一、實(shí)驗(yàn)原理

水勢(shì)（waterpotential）表示水分的化學(xué)勢(shì)，象電流之由高電位處流向低電

位處一樣，水從水勢(shì)高處流向低處（代表水的能量水平）。植物體組織之間，細(xì)胞

之間以及植物體及環(huán)境間的水分移動(dòng)方向都由水勢(shì)差決定。當(dāng)植物細(xì)胞或組織放

在溶液中時(shí)，如果植物的水勢(shì)小于溶液的滲透勢(shì)（溶質(zhì)勢(shì)），則組織吸水而使溶液

濃度變大；反之，則植物細(xì)胞內(nèi)水分外流而使溶液濃度變小；若植物組織的水勢(shì)

與溶液的滲透勢(shì)相等，則二者水分保持動(dòng)態(tài)平衡，外部溶液濃度不變，此溶液的

滲透勢(shì)即等于所測(cè)植物的水勢(shì)。可以利用溶液的濃度不同其比重也不同的原理來

測(cè)定試驗(yàn)前后溶液濃度的變化。然后根據(jù)公式計(jì)算其滲透勢(shì)。因溶液的濃度是已

知的，可以根據(jù)公式算出其滲透壓，取其負(fù)值，為溶液的滲透勢(shì)（中“），即代表

植物的水勢(shì)（力.）。

%=2,=-iCRT（大氣壓）

二、材料、儀器設(shè)備及試劑

（-）材料：小白菜葉片

（-）儀器設(shè)備：具塞小瓶12個(gè)、帶有橡皮管的注射針頭、鑲子、打孔器

培養(yǎng)皿。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

（-）取干燥潔凈的具-小瓶的2/3處），另取6個(gè)干燥潔凈的小-

（二）取待測(cè)樣品的功能葉數(shù)片，用打孔器打取小圓片約50片，放至培養(yǎng)

皿中，混合均勻。用鏡子分別夾入5-8個(gè)小圓片到盛有不同濃度的甲烯藍(lán)蔗糖溶

液的小瓶中（乙組）。蓋上瓶塞，并使葉圓片全部浸沒于溶液中。放置約30-60min,

為加速水分平衡，應(yīng)經(jīng)常搖動(dòng)小瓶。

（三）經(jīng)一定時(shí)間后，用注射針頭吸取乙組各瓶藍(lán)色糖液少許，將針頭插入

對(duì)應(yīng)濃度甲組小瓶溶液中部，小心地放出少量液流，觀察藍(lán)色液流的升降動(dòng)向。

（每次測(cè)定均要用待測(cè)濃度的甲烯藍(lán)蔗糖溶液清洗幾次注射針頭）。如此方法檢

查各瓶中液流的升降動(dòng)向。若液流上升，說明浸過小圓片的蔗糖溶液濃度變?。?/p>

植物組織失水）；表明葉片組織的水勢(shì)高于該濃度糖溶液的滲透勢(shì)；如果藍(lán)色液

流下降則說明葉片組織的水勢(shì)低于該糖溶液的滲透勢(shì)，若藍(lán)色液流靜止不動(dòng)，則

說明葉片組織的水勢(shì)等于該糖溶液的滲透勢(shì)，此糖溶液的濃度即為葉片組織的等

滲濃度。

四、結(jié)果計(jì)算

將求得的等滲濃度值代入如下公式：

力，=W?=—iCRT

式中：口=植物組織的水勢(shì)(單位：MPa)；帆=溶液的滲透勢(shì)；C=等滲濃

度(mol/L)；區(qū)=氣體常數(shù)［L?MPa/(mol-K)］；T=絕對(duì)溫度；1=解離系數(shù)

(蔗糖=1,CaCl2

五、思考題

1、測(cè)定同一植物上部及下部葉片的水勢(shì)有何差別？

2、用小液流法測(cè)定植物組織水勢(shì)與用質(zhì)壁分離法測(cè)定植物細(xì)胞滲透勢(shì)都是

以外界溶液的濃度算出的溶質(zhì)勢(shì)為根據(jù)，它們之間的區(qū)別何在？

實(shí)驗(yàn)七植物根系活力的測(cè)定(TTC法)

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)情況和活力水平直接影響

地上部的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。本實(shí)驗(yàn)練習(xí)測(cè)定根系活力的方法，為植物

營(yíng)養(yǎng)研究提供依據(jù)。

一、實(shí)驗(yàn)原理

氯化三苯基四氮哩(TTC)是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水

中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲瓚，生成的三苯甲瓚

比較穩(wěn)定，不會(huì)被空氣中的氧自動(dòng)氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗(yàn)的氫受體,

植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋果酸得到

增強(qiáng)，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根

系活力的指標(biāo)。

(TTC)(TTF)

二、材料、設(shè)備儀器及試劑

(-)材料：水培小麥根系。

(三)試劑:

1、乙酸乙酯(分析純)。

2、次硫酸鈉(Na2szOD，分析純，粉末。

3、1%TTC溶液：準(zhǔn)確稱取TTC,溶于少量水中，定容到100ml。用時(shí)稀釋至

各需要的濃度。

4、磷酸緩沖液(1/15mol/L,pH7)0

5、Imol/L硫酸:

6、：稱取琥珀酸，溶于水中，定容至100ml即成。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、定性測(cè)定

(2)把根仔細(xì)洗凈，把地上部分從莖基部切除。將根放入三角瓶中，倒入

反應(yīng)液，以浸沒根為度，置37℃左右暗處放1-3h,以觀察著色情況，新根尖

端幾毫米以及細(xì)側(cè)根都明顯地變成紅色，表明該處有脫氫酶存在。

2、定量測(cè)定

（1）TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：2SO粉搖勻后立即產(chǎn)生紅色的甲攢攢25ug、

50ug,100ug、150ug,200Pg的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波

長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

C下暗保溫l-3h,此后加入lmol/L硫酸2ml,以停止反應(yīng)。（與此同時(shí)做一

空白實(shí)驗(yàn)，先加硫酸與根樣品，10分鐘以后（完全殺死根系）再加其他藥品，操

作同上）。

（3）把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯3-4ml和少量石英砂一起在研缽內(nèi)

磨碎，以提出甲攢。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈於?、?/p>

次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量為10ml,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)485nm下

比色，以空白試驗(yàn)作參比測(cè)出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出四氮理還原量。

四、結(jié)果計(jì)算

四氮嚏還原強(qiáng)度（mg/g（根鮮重）/h）=四氮理還原量（mg）/［根重（g）X

時(shí)間（h）］

五、思考題

1、為什么要測(cè)定根系活力？植物的根與地上部分有何關(guān)系？

2、植物根系活力的測(cè)定為什么要以殺死根系作為空白對(duì)照？

實(shí)驗(yàn)八根系總吸收面積和活躍吸收面積的測(cè)定

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)情況和活力水平直接影響

地上部的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)測(cè)定根系吸收面積和活力的方

法。

一、實(shí)驗(yàn)原理

根據(jù)植物礦質(zhì)吸收的理論，植物對(duì)溶質(zhì)的最初吸收具有吸附的特性，并假定

這時(shí)在根系表面均勻地覆蓋了一層被吸附物質(zhì)的單分子層，因此可以根據(jù)根系對(duì)

某種物質(zhì)的吸附量來測(cè)定根的吸收面積。常用甲烯藍(lán)作為被吸附物質(zhì)，它的被吸

附量可以根據(jù)供試液濃度的變化用比色法準(zhǔn)確地測(cè)出。已知Img甲烯藍(lán)成單分子

層時(shí)所占面積為2,據(jù)此即可求出根系的總吸收面積。當(dāng)根系在甲烯藍(lán)溶液中已

達(dá)到吸附飽和而仍留在溶液中時(shí)，根系的活躍部分能把原來吸附的物質(zhì)吸收到細(xì)

胞中去，因而繼續(xù)吸附甲烯藍(lán)。從后一吸附量求出活躍吸收面積，可作為根系活

力指標(biāo)。

二、儀器與試劑

分光光度計(jì)1臺(tái)、50ml燒杯3只、20或50ml量筒1個(gè)(依根系大小而定)、

移液管1ml1支,10ml1支、試管(15X150mm)10支、容量瓶1000ml1個(gè)、

100ml1個(gè)、吸水紙適量、試管架1個(gè)。

甲烯藍(lán)溶液：精確稱取甲烯藍(lán)(C//3SCI-3H20),加水溶解，定容至1000ml。

此溶液每ml含甲烯藍(lán)。

的甲烯藍(lán)溶液：用刻度吸管吸取甲烯藍(lán)定容至100ml,搖勻即成。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.植物材料的準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)最好采用水培玉米，以獲得完整而無損傷的根

系。玉米根系發(fā)達(dá)，是較好的材料。田間栽培的材料因不可能無損地挖出全部根

系，最好避免在正式試驗(yàn)中使用。

2.甲烯藍(lán)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取試管7支編號(hào)，按表1次序加入各溶液,

即成甲烯藍(lán)系列標(biāo)準(zhǔn)液。

表1各試劑加入順序

試管號(hào)1234567

甲烯藍(lán)溶液(ml)0

1246810

蒸儲(chǔ)水(ml)10

986420

甲烯藍(lán)濃度mg/ml0

-以第1管(水)為參比在分光光度計(jì)下比色，取波長(zhǎng)660nm,讀出光密度,

以甲烯藍(lán)濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.取待測(cè)植物根系用濾紙將水吸干再用排水法在量杯或量筒中測(cè)定其根系

體積。把甲烯藍(lán)溶液分別倒在三個(gè)編號(hào)的小燒杯里，每杯中溶液量約10倍于根

的體積，準(zhǔn)確記下每杯的溶液用量。

4.取根系，用吸水紙小心吸干數(shù)次，慎勿傷根，然后順次浸入盛有甲烯藍(lán)

溶液的燒杯中，每杯中浸。注意每次取出時(shí)都要使甲烯藍(lán)溶液能從根上流回到原

燒杯中。

5.從三個(gè)燒杯中各取1ml溶液加入試管，均稀釋10倍，測(cè)得其光密度，查

標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出每杯浸入根系后溶液中剩下的甲烯藍(lán)毫克數(shù)。

測(cè)定根系吸收面積記載表

植物名稱

杯中甲烯藍(lán)溶液量(ml)

開始時(shí)甲烯藍(lán)濃度

(mg/ml)

浸根后燒杯1

溶液濃度燒杯2

(mg/ml)燒杯3

燒杯1

被吸收的

燒杯2

甲烯藍(lán)量

燒杯1+2

(mg)

燒杯3

根體積(ml)

總的

根吸收

活躍的

面積m2

活躍/總的(%)

總的

比表面______________________________________________

活躍的

四、結(jié)果計(jì)算

把結(jié)果記入上表，并以下式求出根的吸收面積：

總吸收面積面)={[(Cl-ClOXV1]+[(C2-C2OXV2]}

活躍吸收面積(m2)=[(C3—C3'

活躍吸收面積(％)=活躍吸收面積/總吸收面積x100

比表面=根的總吸收面積/根的體積

式中C—溶液原來的濃度mg/ml；

C'—浸提后的濃度mg/ml；

1,2,3—燒杯編號(hào)

實(shí)驗(yàn)九離體葉綠體的制備以及完整度的測(cè)定

一、實(shí)驗(yàn)原理

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，分布在葉肉細(xì)胞內(nèi)（組成氣孔的保衛(wèi)

細(xì)胞也含有葉綠體）。葉綠體是由被膜、間質(zhì)和類囊體三部分組成。依據(jù)分離所

得葉綠體的結(jié)構(gòu)完整程度，大致將葉綠體分成兩類：一類為被膜已破碎的葉綠體,

稱之為破碎葉綠體，它具有光合電子傳遞、光合放氧和光合磷酸化的功能；另一

類為被膜完整的葉綠體，它具有同化二氧化碳的完全的光合作用功能。分離和制

備有活性的離題葉綠體是研究葉綠體的結(jié)構(gòu)功能、光合作用原理及遺傳控制機(jī)理

的前提。要分離有活性、較純的完整葉綠體相當(dāng)困難，有些植物葉片細(xì)胞的細(xì)胞

比較厚，葉綠體不易從細(xì)胞中分離出來；有些植物葉綠體外膜極易破損，有些植

物葉片細(xì)胞中含有某些內(nèi)源性抑制物質(zhì)。例如：水解酶、氧化酶等，在制備過程

中極易釋放出來，破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)和活性。因此，不是所有的高等植物都適合

用來分離和制備葉綠體，最常用的植物材料有菠菜、豌豆、玉米、甜菜、大麥等。

此外，低等植物如衣藻、小球藻等也是常用的材料。葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)作為一

項(xiàng)新技術(shù)近年來為植物基因工程提供了一條新途徑。但葉綠體一旦離體，其翻譯

活性在15-30min后就可能完全喪失。葉綠體是綠色植物細(xì)胞中典型的細(xì)胞器，

可通過研磨葉片并勻漿后，根據(jù)其顆粒大小經(jīng)過濾、差速離心加以分離。分離葉

綠體應(yīng)在等滲溶液中制備，以減少滲透壓對(duì)葉綠體的傷害。整個(gè)分離過程應(yīng)在

0-4℃下進(jìn)行，所有提取物、溶液和材料，也應(yīng)保存在該溫度下備用。葉綠體活

力會(huì)隨著離體時(shí)間延長(zhǎng)而不斷下降，因此，分離工作應(yīng)盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成。

下面分別介紹這兩類葉綠體的制備以及被膜完整度的測(cè)定。

分離和制備葉綠體的方法很多，目前最常用且較方便的是分步差速離心的方

法。一般葉綠體的直徑約為幾個(gè)微米，因此細(xì)胞破碎后在一定的離心力范圍內(nèi)即

能分離獲得葉綠體。

二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備

1.器材與試劑

（1）器材

普通離心機(jī)（最好帶有水平離心頭）、研缽或電動(dòng)搗碎器、分光光度計(jì)、冰箱、

扭力天平、pH計(jì)、量筒、移液管、離心管、脫脂紗布等。

(2)試劑

①，「'，Tricine20mmol?匚一小冰箱中備用。)

②80%的丙酮

三、實(shí)驗(yàn)步驟

(1)葉綠體制備

取菠菜、豌豆或小麥苗等新鮮葉片，洗凈后去除中脈，置于研缽或搗碎器中，

加人冰冷的提取液，每10g葉片約加20ml冰冷的STN溶液。用手工研磨或用電

動(dòng)搗碎器搗碎，使葉片搗碎至碎米粒樣大小，經(jīng)過4層紗布過濾，濾液先以200Xg

離心Imin,4℃,去除粗粒沉淀，上層液再以lOOOXg離心3min,4℃,倒掉上

層液，沉淀為葉綠體。用少量STN溶液懸浮葉綠體，懸浮時(shí)可用棉球分散沉淀，

并通過棉球吸取，以過濾葉綠體結(jié)塊，葉綠體懸浮液置于冰浴中備用。

(2)葉綠素濃度測(cè)定

注意事項(xiàng)

(1)提取葉綠體操作都在低溫下進(jìn)行，所用器皿都需預(yù)冷。

(2)葉綠體活力會(huì)隨著離體時(shí)間延長(zhǎng)而不斷下降，因此，操作盡可能迅速，

分離工作盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成。

(3)破碎的葉綠體制劑儲(chǔ)存在液氮中，其Hill反應(yīng)活性可保持較長(zhǎng)時(shí)間，儲(chǔ)

存時(shí)葉綠體的濃度宜濃些(約3-4mg葉綠素/ml),并加25%體積的甘油。

完整葉綠體的制備

分離方法一般有兩種，一是酶消化方法，把葉片表皮撕去后，用纖維素酶和

果膠酶消化細(xì)胞壁，得到原生質(zhì)體，再把原生質(zhì)體通過尼龍網(wǎng)小孔(孔徑20um),

使原生質(zhì)體破裂而釋放出完整葉綠體，但此方法分離得到的葉綠體數(shù)量有限。另

一種是用機(jī)械方法，先用搗碎機(jī)破碎葉片，再分步離心，可以大量制備葉綠體。

這里主要介紹離心法分離完整葉綠體。

1.器材與試劑

(1)器材

普通離心機(jī)(需帶有水平離心頭)，或低溫離心機(jī)、電動(dòng)搗碎器、照光裝置、

氧電極測(cè)氧裝置等。

(2)試劑

①2,2mmol/LEDTA-Na22P0?2mmol/L抗壞血酸鈉(抗壞血酸鈉宜在使用前

現(xiàn)配現(xiàn)加)

②2,10mmol/LNaCl,10mmol/LK:iFe(CN)6?10mmol/LNH“C1

③

④

Percoll濃度706050403020

(%)

比重g/ml

2.操作方法

(1)采摘新鮮菠菜或豌豆葉片

菠菜要選擇嫩而厚，無顯著皺紋的葉片，最好在早晨摘取，以免日照后在葉

綠體內(nèi)積累淀粉，不利于完整葉綠體的分離。豌豆也要選擇嫩而厚的葉片，摘取

后應(yīng)盡快使用。葉片先在強(qiáng)光下照射15-20min,用以激活葉綠體，尤其用在完整

葉綠體的以二氧化碳為底物放氧活性測(cè)定時(shí)，能使其縮短光合作用誘導(dǎo)期。為了

防止強(qiáng)光照射下的溫度上升，可把葉片鋪放在冰塊上，并在光源與葉片之間放隔

水層。

(2)葉綠體制備

葉片去除葉柄及中脈后，以每10g葉片約加20-30ml冰冷的提取液。在電動(dòng)

搗碎器上高速搗碎，約2s/次，間隔搗碎3-4次，使葉片碎成綠豆粒樣大小，然

后經(jīng)4層紗布過濾，去除殘?jiān)?。注意過濾時(shí)不可用力擠壓，以免葉綠體被膜破碎。

濾液以1000Xg離心，4℃,將離心管放人離心機(jī)后，使離心機(jī)的加速很快上升

到預(yù)定值，經(jīng)約30s后再很快使其下降停止，整個(gè)離心程序大約用2-

(3)葉綠體被膜完整率的進(jìn)一步提高

上述方法所得葉綠體被膜完整率一般約在60%左右，好的時(shí)候也可達(dá)到70%

以上。如果需要進(jìn)一步提純，一種簡(jiǎn)單的方法是再次用懸浮介質(zhì)洗滌葉綠體，并

用同樣離心方法沉淀葉綠體，把破碎的葉綠體漂洗去，起著浮選作用，但用此方

法提高被膜完整率的程度有限，而且葉綠體損失也多。另一種方法是用Percoll

作為密度梯度介質(zhì)，方法是將3ml含有80%Percoll(以原液為100%濃度，用水

稀釋)，鋪在10ml體積的離心管下層，再把3ml40%Percoll鋪在離心管的中層,

然后將1ml葉綠體懸浮液輕輕地鋪在離心管的上層，用水平離心頭的離心機(jī)在

1500Xg下離心2-3min,注意此時(shí)離心機(jī)的加速一定要緩慢上升，而下降時(shí)也要

緩慢停下，否則會(huì)破壞Percoll的濃度梯度層的形成，取出離心管可以看到有3

層綠色帶，最上層的為破碎葉綠體，沉在底層的為粗顆粒，而40%-80%Percoll

之間的界面上有一綠色層，是完整葉綠體，小心地將它吸取出來，轉(zhuǎn)移到葉綠體

懸浮介質(zhì)里。此部分葉綠體的被膜完整率可達(dá)95%以上，有時(shí)甚至100虬Percoll

介質(zhì)可以重復(fù)使用，把密度梯度離心用過以后的40%和80%Percoll,分別吸取

出來，存儲(chǔ)于冰箱中以備下次使用。如果制備完整葉綠體的目的只是為了供葉綠

體DNA的分離所用，則主要獲得被膜完整率高的葉綠體制劑即可，不必考慮葉綠

體同化二氧化碳的活性，因此提取介質(zhì)可改用簡(jiǎn)單的STN溶液，但是操作順序需

按照制備完整葉綠體的方法，再用Percoll作密度梯度離心提純。

葉綠體被膜完整率的測(cè)定：

被膜完整率（盼=［（被膜漲破葉綠體的Hill反應(yīng)速率一完整葉綠體的Hill

反應(yīng)速率）/被膜漲破葉綠體的Hill反應(yīng)速率］X100

測(cè)定計(jì)算實(shí)例見下圖：

圖8用鐵氟化鉀作Hill氧化劑檢測(cè)葉綠體完整度記錄圖

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照上述的圖表記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并計(jì)算。

五、思考題

1.被膜完整的葉綠體與破碎的葉綠體在功能上有什么區(qū)別？

2.在本實(shí)驗(yàn)中山梨醇的作用？

3.本實(shí)驗(yàn)中鐵氟化鉀的作用？

實(shí)驗(yàn)十葉綠體色素的提取、分離和理化性質(zhì)

I葉綠體色素的提取與分離

一、實(shí)驗(yàn)原理

葉綠體中含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黃色素（包括胡蘿卜素

和葉黃素）兩大類。它們與類囊體膜相結(jié)合成為色素蛋白復(fù)合體。這兩類色素都

不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑提取。提取液可用色

譜分析的原理加以分離。因吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩?/p>

動(dòng)時(shí)，混合物中各種成分在兩相（固定相和流動(dòng)相）間具有不同的分配系數(shù)，所

以移動(dòng)速度不同，經(jīng)過一定時(shí)間層析后，可將各種色素分開。

二、材料、儀器設(shè)備及試劑

（-）材料：菠菜葉片

（二）儀器設(shè)備：研缽、漏斗、100ml三角瓶、剪刀、滴管、培養(yǎng)皿（直

徑11cm）、康維皿或平底短玻管、圓形濾紙（直徑11cm）、濾紙條（）。

（三）試劑：95%乙醇、石英砂、碳酸鈣粉、推動(dòng)劑：按石油酸：丙酮:

苯（10:2:1）比例配制（V/V）o

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、葉綠體色素的提取

（1）取新鮮菠菜葉片4-5片（2g左右），洗凈，擦干，去掉中脈剪碎，放入

研缽中。

（2）研缽中加2-3ml95%乙醇，加入少許石英砂、碳酸鈣粉末，研磨至糊

狀，再加10T5ml95%乙醇，提取35min,上清液過濾于三角瓶中，殘?jiān)?0ml

95%乙醇沖洗，一同濾于三角瓶中。

（3）如無新鮮葉片，也可用事先制好的葉干粉提取。取新鮮葉片（以菠菜

葉最好），先用105c殺青，再在80C下烘干，研成粉末，密閉貯存。用時(shí)稱葉

粉2g放入小燒杯中，加95%乙醇20-30口1浸提，并隨時(shí)攪動(dòng)。待乙醇呈深綠色

時(shí)，濾出浸提液備用。

2、葉綠體色素的分離

（1）取圓形定性濾紙一張（直徑11cm）,在其中心戳一圓形小孔（直徑約2

（2）將紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，使與濾紙剛剛平齊（勿

突出）。

（3）在培養(yǎng)皿內(nèi)放一康維皿，在康維皿中央小室中加入適量的推動(dòng)劑，