原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)-原生質(zhì)體的融合

原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交

——原生質(zhì)體融合方法

主講人：姜放軍湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物組織培養(yǎng)技術(shù)定義：原生質(zhì)體融合也叫做體細(xì)胞雜交，使分離出來的不同親本的原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互融合成一體，形成雜種細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成雜種植株的技術(shù)。原生質(zhì)體融合體細(xì)胞雜交：通過物理或化學(xué)的方法使原生質(zhì)體融合，通過培養(yǎng)獲得具有雙親遺傳物質(zhì)的后代。也叫做原生質(zhì)體融合。問題探究一、原生質(zhì)體融合意義—克服雜交不親合—克服生殖器官敗育—克服柑桔多胚對照果實(shí)處理果實(shí)對照種子處理種子

１９６０年英國生物學(xué)家科金發(fā)明了用酶脫除細(xì)胞壁的方法，給植物細(xì)胞融合技術(shù)掃清了第一道障礙。在許多研究人員成功地進(jìn)行了不同植物的細(xì)胞融合，并培養(yǎng)出了再生植株后，許多人開始嘗試培育不同種屬的超級雜交植物。１９７８年，德國的梅羅帕斯博士用細(xì)胞融合的方法培育出了馬鈴薯（土豆）和番茄的雜交后代———薯番茄。

先用酶液除去馬鈴薯、番茄的細(xì)胞壁，然后將兩種去壁細(xì)胞（原生質(zhì)體）等量混合，在混合液中加進(jìn)聚乙二醇溶液，使原生質(zhì)體緊密粘聚，再用高鈣和高ｐＨ溶液處理，結(jié)果，馬鈴薯與番茄兩種原生質(zhì)體的融合率竟高達(dá)４０％～５０％。他們也曾進(jìn)行過有性雜交的實(shí)驗，但都失敗了。

01ｅ26超級雜交水稻

通過秈粳亞種間雜交，獲得超級優(yōu)質(zhì)雜交晚稻01ｅ26，該品種具有產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)、米質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn).2003年開始在寧海、溫嶺、溫州、福建4個不同緯度的基地試種，其中溫嶺測產(chǎn)每畝突破750公斤。

01e26超級雜交晚稻番茄+馬鈴薯

1978年，德國科學(xué)家梅羅帕斯博士向世界宣告，他用馬鈴薯與番茄相結(jié)合，得到了地上部分結(jié)青色果實(shí)的“薯番茄”，但地下尚未結(jié)出馬鈴薯的塊莖。后來，美國堪薩斯州立大學(xué)的科學(xué)家，把番茄和馬鈴薯的細(xì)胞部分融合在一起，培育出了地上結(jié)黃色果實(shí)、地下長白色薯塊的“番茄薯”，據(jù)說番茄的產(chǎn)量很高。二、植物體細(xì)胞雜交的主要程序：原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體融合雜種細(xì)胞的選擇雜種細(xì)胞的培養(yǎng)雜種植株的鑒定融合過程

產(chǎn)生的融合子中可能有雜合雙倍體和單倍重組體不同的類型三、融合方法1、自發(fā)融合自發(fā)融合是在酶解細(xì)胞壁過程中，由于細(xì)胞間連絲的擴(kuò)展和黏連，有些相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體，每個同核體包含2－40個核。

無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合高pH-高Ca離子聚乙二醇(PEG)法

PEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法電融合技術(shù)2、誘發(fā)融合

由于質(zhì)膜表面帶負(fù)電性，原生質(zhì)體間互相排斥，所以要采用一定的誘導(dǎo)方法，能促進(jìn)原生質(zhì)體的融合。不同來源的原生質(zhì)體融合形成的雜種原生質(zhì)體叫做異核體。(一)無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合:NaNO3法

1972年：Carlson誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合獲得首例雜種植株粉藍(lán)煙草和朗氏煙草體細(xì)胞雜種。NaNO3的作用：中和質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起不足：誘導(dǎo)頻率不高。1973年：Keller用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃時，誘發(fā)煙草葉肉原生質(zhì)體融合。優(yōu)點(diǎn)：雜種產(chǎn)量高。不足：高pH值對細(xì)胞有毒害作用。（二）高pH-高Ca離子法（聚乙二醇）（三）PEG法PEG法原理PEG是一種帶負(fù)電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體凝聚。在洗脫過程中，PEG將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排隊導(dǎo)致一個原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。PEG：略帶負(fù)電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋的作用，可使原生質(zhì)體凝聚。PEG法示意圖-+-橋梁+-PEG被洗掉+-+-電荷重排+-+-+-+-膜接觸PEG法特點(diǎn)：融合頻率高可重復(fù)性強(qiáng)誘發(fā)融合無特異性毒性較低植物+植物植物+動物動物+酵母PEG處理特點(diǎn)：有異核體形成頻率高、重復(fù)性高、對細(xì)胞的毒性低、融合誘導(dǎo)無特異性。最為常用。具體做法：在無菌條件下混合雙親原生質(zhì)體----滴加PEG溶液，搖勻，靜置---滴加高鈣-高pH溶液，搖勻，靜置---滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次---離心獲得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)---篩選---再生雜合細(xì)胞（四）PEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法Ca2＋：可以在蛋白質(zhì)（或磷脂）與PEG的負(fù)極性基團(tuán)間形成橋，因而可促進(jìn)粘連。(五)電融合技術(shù)電融合儀

在現(xiàn)代生物學(xué)研究中，細(xì)胞電融合是單克隆抗體制備、哺乳動物克隆以及抗腫瘤疫苗制備等最新方法中的一個基本步驟。與通過聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)細(xì)胞融合的化學(xué)方法相比，細(xì)胞電融合是一種更高效的方法。

Zimmermann教授于1978年創(chuàng)立了細(xì)胞電融合的方法。從那以后，他一直致力于進(jìn)一步發(fā)展該技術(shù)。Senda1979年首先用此方法實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體融合1.電融合法原理

交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠。+-負(fù)極正極+-+-+-+-+-+-+-+-

施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-細(xì)胞融合儀

細(xì)胞先在交流電場中聚集，然后通過直流脈沖融合。特定的緩沖液體系可幫助完成高效的細(xì)胞電融合。A．聚集通過雙向電泳，細(xì)胞互相緊密接觸。B．融合脈沖采用僅僅15微秒的方波脈沖穿透細(xì)胞膜，細(xì)胞膜隨后發(fā)生融合。C．異核體期細(xì)胞膜完全融合，細(xì)胞質(zhì)也完全混合。只有細(xì)胞核仍然保持分離狀態(tài)D．完全融合產(chǎn)物現(xiàn)在細(xì)胞核也發(fā)生了融合。根據(jù)常識，染色體數(shù)量下降。ABCD2.電融合的過程燕麥原生質(zhì)體的融合電融合技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：避免PEG、高pH、高Ca2＋這些非正常生理條件；融合條件數(shù)據(jù)化，便于控制與相互比較。其他方式融合

神舟四號飛船上進(jìn)行的太空細(xì)胞順利融合，返回艙里的電融合儀內(nèi)孕育出首批國產(chǎn)太空生命。應(yīng)用舉例二十世紀(jì)80年代末，細(xì)胞電融合技術(shù)被用于從胚胎細(xì)胞克隆哺乳動物。

單克隆抗體制備G.Kohler和C.Milstein將能產(chǎn)生特異性抗體的原代B淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，創(chuàng)立了單克隆抗體制備這種革命性的制備抗體的方法。無數(shù)的融合產(chǎn)物經(jīng)分離和篩選后，將符合要求的單個細(xì)胞作為克隆進(jìn)行擴(kuò)增，這就是使用“單克隆”一詞的原因。這種融合產(chǎn)物被稱為雜交瘤.三、體細(xì)胞雜種細(xì)胞篩選與鑒定1．互補(bǔ)選擇法2、機(jī)械分離雜種細(xì)胞法3.雙熒光標(biāo)記選擇法原生質(zhì)體發(fā)生融合時，有相當(dāng)一部分并未融合，或發(fā)生的是非目的性融合，所以會呈現(xiàn)多種融合狀態(tài)，故有必要進(jìn)行篩選出異核體，其主要方法有：1.互補(bǔ)選擇法(1)遺傳互補(bǔ)選擇法

采用缺陷型親本進(jìn)行融合產(chǎn)生野生型雜種，從而從整體水平進(jìn)行有效選擇。另外也可以利用原生質(zhì)體對藥物，抗生素的不同抗性來進(jìn)行篩選。

(2)營養(yǎng)互補(bǔ)選擇法也稱生理互補(bǔ)法

指親本雙方都有營養(yǎng)缺陷的情況下，只有雜種細(xì)胞能在選定的特種培養(yǎng)基上生存，而親本雙方皆不能生存.

如粉藍(lán)煙草和郎氏煙草原生質(zhì)體融合后，惟有雜種細(xì)胞能在無激素培養(yǎng)基上正常生長，而兩親本的細(xì)胞則不能分裂，從而可用該方法篩選出雜種后代。

營養(yǎng)缺陷(aB)+營養(yǎng)缺陷(Ab)→自養(yǎng)(AaBb)抗性(aB)+抗性(Ab)→雙抗(AaBb)Harms等（1981）2、機(jī)械篩選法

該方法不要求原生質(zhì)體具有特殊的遺傳北背景，通過顯微鏡操作的手段對異核體進(jìn)行分揀，是最為直接和準(zhǔn)確的手段。

雖然此法操作難度較大，但結(jié)果正確可靠，是目前常用的篩選方法。異硫氰酸熒光素（FITC）：綠色異硫氰酸羅丹明（RITC）：紅色3、雙熒光標(biāo)記選擇法用熒光染料異硫氰酸熒光素（FITC，綠色）和異硫氰酸羅丹明（RTTC，紅光），分別標(biāo)記兩種來源的原生質(zhì)體。在熒光顯微鏡下，選擇雜種細(xì)胞。體細(xì)胞雜種植株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定細(xì)胞學(xué)觀察

DNA內(nèi)切圖譜分析同工酶分析問題探究1、形態(tài)學(xué)鑒定2、細(xì)胞學(xué)觀察染色體形態(tài)和數(shù)目的比較18條染色體36條染色體應(yīng)用染色體計數(shù)法、核型分析和顯帶技術(shù)鑒定觀察染色體數(shù)目、大小與形態(tài)變化。3、DNA內(nèi)切圖譜分析RAPD帶型（隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA）雜種細(xì)胞線粒體DNA發(fā)生重排，出現(xiàn)新的線粒體DNA內(nèi)譜帶。1、細(xì)胞雜交產(chǎn)生的新品種或新種應(yīng)具有A、多種利用價值的新經(jīng)濟(jì)植物，B、將一種植物的抗性（抗病、抗寒等）轉(zhuǎn)入另一植物。C、使低光合作用效率的植物轉(zhuǎn)變成高光效植物。D、將豆科植物的共生結(jié)瘤固氮能力轉(zhuǎn)入非豆科植物。E、得到高含量次生代謝產(chǎn)物（生物堿等）的植物。細(xì)胞雜交的研究進(jìn)展和存在問題2、體細(xì)胞雜交涉及的基本理論問題A、是什么遺傳因子和條件決定果實(shí)與塊莖的形成。