液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀校準(zhǔn)規(guī)范檢定規(guī)程

本規(guī)范適用于離子阱、單四極桿和三重四極桿型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(以下簡(jiǎn)稱(chēng)GB/T6041—2002質(zhì)譜分析方法通則GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本規(guī)范。3.1分辨力resolution分辨兩個(gè)相鄰質(zhì)譜峰的能力，以某離子峰峰高50%處的峰寬度(簡(jiǎn)稱(chēng)半峰寬)表示，記為W?z,單位為原子質(zhì)量單位(u)。不通過(guò)色譜柱，使用注射泵直接將樣品溶液輸入離子源的一種進(jìn)樣方式。3.3選擇離子監(jiān)測(cè)selectedionmonitor對(duì)特定質(zhì)量的單個(gè)或多個(gè)離子進(jìn)行檢測(cè)的方式，簡(jiǎn)稱(chēng)SIM。3.4選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)selectedreactionmonitor對(duì)母離子在特定碰撞能量下產(chǎn)生的子離子進(jìn)行檢測(cè)的方式，簡(jiǎn)稱(chēng)SRM。3.5離子豐度比重復(fù)性repeatabilityofabundanceratioofion同一濃度的待測(cè)物在相同測(cè)量條件下連續(xù)重復(fù)測(cè)量的離子豐度比之間的重復(fù)性。在高電場(chǎng)中對(duì)樣品溶液進(jìn)行霧化以輔助實(shí)現(xiàn)電離的方式，簡(jiǎn)稱(chēng)ESI,分為ESI正離3.7大氣壓化學(xué)電離atmospherepressurechemic大氣壓電離的一種類(lèi)型，在大氣壓下樣品通過(guò)噴嘴被氮?dú)饬黛F化，以電暈或放射源進(jìn)行電離的離子化方式，簡(jiǎn)稱(chēng)APCI,分為APCI正離子模式(APCI+)和APCI負(fù)離LC-MS是將液相色譜儀與質(zhì)譜儀聯(lián)用的儀器，用于樣品定性定量分析。其工作原理為：樣品通過(guò)液相色譜分離后的各個(gè)組分依次進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器，各組分在離子源被電2離，產(chǎn)生帶有一定電荷、質(zhì)量數(shù)不同的離子。不同離子在電磁場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)行為不同，采用質(zhì)量分析器按不同質(zhì)荷比(以下簡(jiǎn)稱(chēng)m/z)把離子分開(kāi)，得到依質(zhì)荷比順序排列的質(zhì)譜圖。通過(guò)對(duì)質(zhì)譜圖的分析處理，可以得到樣品的定性和定量結(jié)果。LC-MS主要包括液相色譜系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器、真空系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分。5計(jì)量特性LC-MS各項(xiàng)計(jì)量性能指標(biāo)見(jiàn)表1。表1Ee-MS主要計(jì)量性能指標(biāo)儀器類(lèi)型電離模式分辨力單四極桿、離子阱三重四極桿、單四極枉、離子阱離子阱保留時(shí)間重復(fù)性’三重四極桿、單四極桿、離子阱6校準(zhǔn)條件6.1環(huán)境條件6.1.1儀器室內(nèi)不得有明顯的機(jī)械振動(dòng)，無(wú)電磁干擾，不得存放與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的易燃、易爆和強(qiáng)腐蝕性氣體或試劑。6.1.2溫度：15℃~30℃。6.1.3相對(duì)濕度：不大于80%6.1.4電源電壓：(220±22)V;頻率：(50±0.5)Hz。6.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和校準(zhǔn)設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均應(yīng)使用國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，校準(zhǔn)設(shè)備需經(jīng)計(jì)量檢定合格。6.2.1利血平溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，相對(duì)擴(kuò)展不確定度優(yōu)于5%(k=2)。6.2.2移液器或移液管：量程范圍100μL或200μL,B級(jí)及以上。36.2.3容量瓶：10mL或25mL,B級(jí)及以上。儀器銘牌上標(biāo)示儀器的名稱(chēng)、型號(hào)、制造廠名、產(chǎn)品序列號(hào)、出廠日期等內(nèi)容。待儀器運(yùn)行穩(wěn)定后，根據(jù)儀器說(shuō)明書(shū)的推薦條件設(shè)置參數(shù)，將掃描范圍設(shè)為m/z=606～612,直接注入(是指流動(dòng)注射方式，或者使用液相色譜系統(tǒng)的進(jìn)樣器將樣品不經(jīng)色譜柱直接注入離子源的方式)或者經(jīng)色譜柱(液相色譜條件按照附錄B)注入5ng利血平。觀察質(zhì)譜圖，記錄m/z609質(zhì)譜峰，并計(jì)算其50%峰高處的峰寬，得到Wrz,根據(jù)附錄B設(shè)定液相色譜條件并優(yōu)化質(zhì)譜條件，將檢測(cè)離子的m/z設(shè)為表2中特征離子的m/z,經(jīng)色譜柱注入相應(yīng)量的利血平。觀察色譜圖，記錄其色譜峰峰高作為H?。同時(shí)記錄信號(hào)峰后1min～3min時(shí)間內(nèi)的基線輸出信號(hào)的最大值與最小值之差，作為H。根據(jù)公式(1)計(jì)算信噪比S/N,連續(xù)測(cè)量6次，以6次測(cè)量S/N的平均值儀器類(lèi)型電離模式特征離子的m/z609(母離子)→195(子離子)單四極桿、離子阱ESI—單四極桿、離子阱單四極桿、離子阱根據(jù)表3和LC-MS質(zhì)量數(shù)應(yīng)用范圍，選用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或試劑，將掃描范圍設(shè)為表3中相應(yīng)特征離子理論值±5的范圍(例如對(duì)于咖啡因，設(shè)為m/z=190～200),直接注入相應(yīng)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或試劑。觀察質(zhì)譜圖，記錄特征離子的實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)(有效數(shù)字取小數(shù)點(diǎn)后兩位)。根據(jù)公式(2)計(jì)算△M,以△M的最大值作為質(zhì)量準(zhǔn)確性的4M?第i個(gè)離子的理論值，u。LC-MS質(zhì)量數(shù)應(yīng)用范圍標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或試劑咖啡因5黃體酮7.5峰面積重復(fù)性與保留時(shí)間重復(fù)性將檢測(cè)離子的m/z設(shè)為表4中特征離子的m/z,經(jīng)色譜柱注入相應(yīng)量的利血平。觀察色譜圖，記錄其色譜峰的峰面積和保留時(shí)間。連續(xù)測(cè)量6次。根據(jù)公式(3)分別計(jì)算峰面積與保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),作為峰面積重復(fù)性與保留時(shí)間重復(fù)性的結(jié)果。式中：x;第i次測(cè)量保留時(shí)間(min)或峰面積；元6次測(cè)量保留時(shí)間(min)或峰面積的算術(shù)平均值；i——測(cè)量序號(hào)。儀器類(lèi)型特征離子的m/z609(母離子)→195(子離子)單四極、離子阱7.6離子豐度比重復(fù)性將檢測(cè)離子的m/z設(shè)為母離子m/z609的兩個(gè)子離子m/z397柱注入利血平500pg。觀察質(zhì)譜圖，分別記錄m/z397和m/z448和m/z448,經(jīng)色譜的豐度。連續(xù)測(cè)量56次，根據(jù)公式(4)計(jì)算兩個(gè)子離子豐度比值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),作為離子豐度比重復(fù)性的結(jié)果：式中：x;——第i次測(cè)量的m/z397豐度與m/z448豐度之比；x——6次測(cè)量的m/z397豐度與m/z448豐度之比的平均值；i——測(cè)量序號(hào)。8校準(zhǔn)結(jié)果校準(zhǔn)結(jié)果應(yīng)在校準(zhǔn)證書(shū)或校準(zhǔn)報(bào)告上反映。校準(zhǔn)證書(shū)或報(bào)告至少包括以下信息：a)標(biāo)題，如“校準(zhǔn)證書(shū)”或“校準(zhǔn)報(bào)告”;b)實(shí)驗(yàn)室名稱(chēng)和地址；c)進(jìn)行校準(zhǔn)的地點(diǎn)(如果不在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行校準(zhǔn));d)證書(shū)或報(bào)告的唯一性標(biāo)識(shí)(如編號(hào)),每頁(yè)及總頁(yè)數(shù)的標(biāo)識(shí)；e)送校單位的名稱(chēng)和地址；f)被校對(duì)象的描述和明確標(biāo)識(shí)；g)進(jìn)行校準(zhǔn)的日期，如果與校準(zhǔn)結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時(shí)，應(yīng)說(shuō)明被校對(duì)象的接受日期；h)如果與校準(zhǔn)結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時(shí)，應(yīng)對(duì)抽樣程序進(jìn)行說(shuō)明；i)對(duì)校準(zhǔn)所依據(jù)的技術(shù)規(guī)范的標(biāo)識(shí)，包括名稱(chēng)及代號(hào)；j)本次校準(zhǔn)所用測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的溯源性及有效性說(shuō)明；k)校準(zhǔn)環(huán)境的描述；1)校準(zhǔn)結(jié)果及測(cè)量不確定度的說(shuō)明；m)校準(zhǔn)證書(shū)或校準(zhǔn)報(bào)告簽發(fā)人的簽名、職務(wù)或等效標(biāo)識(shí)以及簽發(fā)日期n)校準(zhǔn)結(jié)果僅對(duì)被校對(duì)象有效的聲明；o)未經(jīng)實(shí)驗(yàn)室書(shū)面批準(zhǔn)，不得部分復(fù)制證書(shū)或報(bào)告的聲明。9復(fù)校時(shí)間間隔由于復(fù)校時(shí)間間隔的長(zhǎng)短是由儀器的使用情況、使用者、儀器本身質(zhì)量等因素所決定，因此，送校單位可根據(jù)實(shí)際使用情況自主決定復(fù)校時(shí)間間隔，建議不超過(guò)1年。更換重要部件、維修、重新安裝或?qū)x器性能有懷疑時(shí)，應(yīng)隨時(shí)校準(zhǔn)。6委托單位聯(lián)系電話校準(zhǔn)日期 出廠編號(hào)設(shè)備編號(hào) 環(huán)境溫度1外觀檢查2分辨力標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度進(jìn)樣量質(zhì)譜儀類(lèi)型電離方式調(diào)節(jié)方式結(jié)果3信噪比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)農(nóng)度進(jìn)樣量進(jìn)樣方式掃描范圍電離方式提取離子m/z:4質(zhì)量準(zhǔn)確性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度進(jìn)樣量進(jìn)樣方式理論值實(shí)測(cè)值5重復(fù)性1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度進(jìn)樣量進(jìn)樣方式保留時(shí)間123456RSD2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度進(jìn)樣量進(jìn)樣方式豐度比123456RSD校準(zhǔn)員核驗(yàn)員7液相色譜和質(zhì)譜參數(shù)(建議條件)B.1液相色譜條件色譜柱：2.1mm內(nèi)徑的C18色譜柱。液相色譜流動(dòng)相流速：0.2mL/min～0.4mL/min(不分流)。ESI+與APCI+模式下的流動(dòng)相：甲醇：水(80÷20,體積分?jǐn)?shù)),加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸或乙酸。甲酸或乙酸，再加入0.2%(體積分?jǐn)?shù))氨水。使用GBT6682規(guī)定的一級(jí)水，電導(dǎo)率(25℃)≤0.01mSm,0.1%(體積分?jǐn)?shù))吸光度(254nm,對(duì)于信噪比的校準(zhǔn)，首先應(yīng)使用儀器的質(zhì)譜優(yōu)化功能進(jìn)行優(yōu)化?？梢圆捎脻舛葹?.00ng/gL肉利血平溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以直接注入或經(jīng)液相色譜進(jìn)樣的方式分別對(duì)質(zhì)譜儀的如下參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，即工細(xì)管電、錐孔電壓值、碰撞能量、霧化氣溫度和氣流大小，使利血平在m/2609的離子峰高最高。將質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)的閱值設(shè)為0,其他項(xiàng)目的校準(zhǔn)，參照該條件。在離予豐度比重復(fù)性校準(zhǔn)中，優(yōu)化二級(jí)質(zhì)譜條件時(shí)，選擇適當(dāng)?shù)呐鲎材芰浚箖蓚€(gè)子離子的豐度比值在40%～150%之內(nèi)，再進(jìn)行校準(zhǔn)8附錄C校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、配制方法及其對(duì)應(yīng)校準(zhǔn)項(xiàng)目(建議方法)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或試劑溶劑濃度校準(zhǔn)項(xiàng)目利血平溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)異丙醇水溶液，異丙醇：水=1:1(體積分?jǐn)?shù))峰面積重復(fù)性、液相色譜流動(dòng)相分辨力、信噪比液相色譜流動(dòng)相信噪比和峰面積水溶液，甲醇：水=1:1(體積分?jǐn)?shù))10ng/μL~咖啡因(純度大于95%)甲醇黃體酮(純度大于95%)甲醇注：使用GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。9在LC-MS校準(zhǔn)中，對(duì)信噪比的不確定度進(jìn)行如下評(píng)價(jià)。D.1數(shù)學(xué)模型本校準(zhǔn)規(guī)范計(jì)算信噪比結(jié)果的公式如下，為方便表述，使用z表示信噪比(S/N)H?！狧nViH?——提取離子(mí)的色譜峰峰高；K——單位質(zhì)量響應(yīng)值，為常數(shù)，pg-1;c-所用溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，pg/pL;V?—一稀釋溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，移液器或移液管的取液體積，mLV?-稀釋溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，所用容量瓶的體積，mL;從公式(D.1)分析，信噪比的合成度u,)D.2不確定度來(lái)源與量化分析信噪比不確定度來(lái)源主要包括6個(gè)方面，其中測(cè)量重復(fù)性為A卷不確定度，其他為B類(lèi)不確定度。D.2.1測(cè)量重復(fù)性u(píng)rA測(cè)量重復(fù)性可以通過(guò)計(jì)算6次測(cè)量平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差得到；式中：z——信噪比測(cè)量結(jié)果，為6次測(cè)量的平均值；z;——第i次測(cè)量的信噪比結(jié)果；s——實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差。D.2.2溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度的相對(duì)不確定度u,(c)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)查得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度(c)、擴(kuò)展不確定度(Ucrm)和包含因子(kcRm),根據(jù)下式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)不確定度：D.2.3移液器或移液管取液體積的相對(duì)不確定度u,(V?)對(duì)于移液器，通過(guò)其檢定證書(shū)，查得檢定點(diǎn)為所用的取液體積(V?)對(duì)應(yīng)的容量允許誤差[E(V?),其為相對(duì)值],以下式計(jì)算該項(xiàng)不確定度：對(duì)于移液管，通過(guò)其檢定證書(shū)，查得標(biāo)稱(chēng)容量為所用的取液體積(V?)對(duì)應(yīng)的允差E(V?),按下式計(jì)算該項(xiàng)不確定度D.2.4容量瓶體積的相對(duì)不確定度u,(V?)通過(guò)容量瓶的檢定證書(shū)，查得標(biāo)稱(chēng)容量(V?)對(duì)應(yīng)的允差E(V?),項(xiàng)不確定度：以下式計(jì)算該D.2.5進(jìn)樣體積的相對(duì)不確定度u,(V)一般LCMS采用自動(dòng)進(jìn)樣方式，可通過(guò)微量注射器的容量允許誤差E(V),以下式計(jì)算該項(xiàng)不確定度：D.2.6噪聲強(qiáng)度測(cè)量不確定度u,(Hn)噪聲強(qiáng)度的A類(lèi)不確定度已經(jīng)在“測(cè)量重復(fù)性”中計(jì)算，該項(xiàng)為噪聲強(qiáng)度的B類(lèi)不確定度。在實(shí)際計(jì)算中，將譜圖放大后從軟件上讀取噪聲強(qiáng)度，該項(xiàng)不確定度極小，可忽略。D.3擴(kuò)展不確定度通過(guò)以上分析，將上述各分量代入公式(D.2),計(jì)算得到信噪比的相對(duì)合成不確定度，取包含因子k=2(95%的置信度),根據(jù)下式計(jì)算信噪比結(jié)果的擴(kuò)展不確定U=ku,(z)zD.4計(jì)算實(shí)例以下是一次實(shí)際校準(zhǔn)不確定度計(jì)算實(shí)例。此次校準(zhǔn)是對(duì)三重四極桿LC-MS的校準(zhǔn)，進(jìn)樣量要求為50pg的利血平。使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為1.00ng/μL利血平溶液，擴(kuò)展不確定度為0.05ng/μL,相對(duì)擴(kuò)展不確定度為5%。使用100μL的移液器取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL至10mL的容量瓶中，使用流動(dòng)相溶劑定容至10mL,得到10pg/μL的利血平標(biāo)準(zhǔn)溶液。連續(xù)6次進(jìn)樣，每次進(jìn)樣體積為5μL,譜圖略，根據(jù)公式(D.1),6次信噪比計(jì)算結(jié)果分別為：z?=104,z?=100,z?=101,z?=102,zs=100,z6=105。平均值z(mì)=102,實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差s=1.9。D.4.1測(cè)量重復(fù)性u(píng):A根據(jù)公式(D.3)得：D.4.2溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度的相對(duì)不確定度u,(c)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)查得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度(c=1.00ng/μL)、擴(kuò)展不確定度(UcrM=0.05ng/μL)和包含因子(kcrm=2),根據(jù)公式(D.4)得：D.4.3移液器取液體積的相對(duì)不確定度u,(V