蛋白質(zhì)化學精講

第二章蛋白質(zhì)化學

主要內(nèi)容：介紹氨基酸的結(jié)構(gòu)、分類、性質(zhì)及肽的概念，重點討論蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)和功能的相互關(guān)系。目錄第一節(jié)蛋白質(zhì)元素組成及生理功能第二節(jié)蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位──氨基酸第三節(jié)肽第四節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)第五節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第六節(jié)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第七節(jié)蛋白質(zhì)分類（自學）蛋白質(zhì)主要元素組成：C、H、O、N、S及P、Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se等微量元素。

蛋白質(zhì)平均含N量為16％,這是凱氏定氮法測蛋白質(zhì)含量的理論依據(jù)：

蛋白質(zhì)含量＝蛋白質(zhì)含N量×6.25三聚氰胺

三聚氰胺（cyanuramide），分子式C3H6N6。三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，被用作化工原料。微溶于水，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等。又稱蜜胺、2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪。白色單斜棱晶。

三聚氰胺是一種重要的有機化工中間產(chǎn)品，主要用來制作三聚氰胺樹脂，具有優(yōu)良的耐水性、耐熱性、耐電弧性、優(yōu)良阻燃性。用途：可用于裝飾板的制作，用于氨基塑料、粘合劑、涂料、幣紙增強劑、紡織助劑等。三聚氰胺

三聚氰胺是一種重要的有機化工原料(詳細解釋見:/html/20080912/20080912_109294.shtml),既然是一種化工原料為什么跑到八桿子打不到的奶粉里呢?大家知道,奶粉一個重要指標就是蛋白質(zhì)含量,蛋白質(zhì)的主要組成成分是氨基酸,目前的快速檢測法(凱氏定氮法),就是通過估計氮的含量來間接估計蛋白質(zhì)的含量,而三聚氰胺這種東西,最大的特點就是氮的含量很高,高達66%,加入這個東西,能提高產(chǎn)品的蛋白質(zhì)的檢測含量.所以它又美其名曰"蛋白精".

你可以google"三聚氰胺+蛋白精"就可以驚人的發(fā)現(xiàn),原來有多少不法商人在做這個生意,但一般是打動物飼料的主意,有人宣稱,可以隨意配置你所需要的蛋白含量.大量攝入三聚氰胺，會損害人體和動物的生殖、泌尿系統(tǒng)，產(chǎn)生腎、膀胱結(jié)石，其危害性是早就明確了的。美國在從中國進口的動物飼料里發(fā)現(xiàn)這個東西影響動物健康后,已經(jīng)禁止使用這個作為飼料添加劑.而中國卻變本加厲,用做了人而且是嬰兒產(chǎn)品的添加劑.蛋白質(zhì)的主要生理功能

蛋白質(zhì)（protein）是生活細胞內(nèi)含量最豐富、功能最復(fù)雜的生物大分子，并參與了幾乎所有的生命活動和生命過程。因此，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能始終是生命科學最基本的命題。生物體最主要的特征是生命活動，而蛋白質(zhì)是生命活動的體現(xiàn)者，具有以下主要功能：催化功能；結(jié)構(gòu)功能；調(diào)節(jié)功能；防御功能；運動功能；運輸功能；信息功能；儲藏功能

蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位──氨基酸一、氨基酸的通式二、蛋白質(zhì)氨基酸、稀有的蛋白質(zhì)氨基酸和

非蛋白質(zhì)氨基酸的概念三、二十種常見的蛋白質(zhì)氨基酸分類、結(jié)構(gòu)及三字符號四、氨基酸的性質(zhì)五、氨基酸的生產(chǎn)和應(yīng)用-氨基酸的通式

氨基酸光學性質(zhì)

1、除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不對稱碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。2、參與蛋白質(zhì)組成的20種氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基團中含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光區(qū)（220-300nm）顯示特征的吸收譜帶，最大光吸收（

max）分別為279、278、和259nm。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有這些氨基酸殘基，因此用紫外分光光度法可測定蛋白質(zhì)含量。生物體內(nèi)的氨基酸類別蛋白質(zhì)氨基酸：蛋白質(zhì)中常見的20種氨基酸稀有的蛋白質(zhì)氨基酸：蛋白質(zhì)組成中，除上述20種常見氨基酸外，從少數(shù)蛋白質(zhì)中還分離出一些稀有氨基酸，它們都是相應(yīng)常見氨基酸的衍生物。如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸等。非蛋白質(zhì)氨基酸：生物體內(nèi)呈游離或結(jié)合態(tài)的氨基酸。二十種常見蛋白質(zhì)氨基酸的分類、結(jié)構(gòu)及三字符號

據(jù)營養(yǎng)學分類

必需ＡＡ非必需ＡＡ據(jù)R基團化學結(jié)構(gòu)分類

脂肪族ＡA（中性、含羥基或巰基、酸性、堿性）芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)雜環(huán)ＡＡ(His、Pro)據(jù)R基團極性分類極性R基團AA非極性R基團AA（８種）不帶電荷（７種）帶電荷：正電荷（３種）負電荷（２種）據(jù)氨基、羧基數(shù)分類一氨基一羧基ＡＡ一氨基二羧基ＡＡ(Glu、Asp)二氨基一羧基ＡＡ(Lys、His、Arg)

人的必需氨基酸LysTrpPheValMetLeuIleThr

Arg、His非極性R基團氨基酸不帶電荷極性R基團氨基酸帶電荷R基團氨基酸甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）纈氨酸（Val,V）亮氨酸（Lue,L）異亮氨酸（Ile,I）中性脂肪族氨基酸含羥基或硫脂肪族氨基酸絲氨酸（Ser,S）蘇氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺（Gln,Q）堿性氨基酸

賴氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）組氨酸（His,H）雜環(huán)雜環(huán)氨基酸

組氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）芳香族氨基酸

苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trg,W）

氨基酸的性質(zhì)

（1）兩性解離和等電點（2）光學性質(zhì)（3）重要化學反應(yīng)

a.與茚三酮反應(yīng):用于氨基酸定量定性測定.

b.與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)（sanger反應(yīng)）:用于蛋白質(zhì)N-端測定.

c.與苯異硫氰酯（PITC）的反應(yīng)（Edman反應(yīng)），用于蛋白N-端測定，蛋白質(zhì)順序測定儀設(shè)計原理的依據(jù)。氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點

pH=pI

凈電荷=0

pH<

pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3++H++

OH-+H++

OH-(pK′1)(pK′2)

當氨基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(isoelectric

point，pI)。

氨基酸等電點的計算

可見，氨基酸的pI值等于該氨基酸的兩性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團pK′值之和的二分之一。pI=2pK′1+pK′2一氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK′2+pK′R二氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK′1+pK′R一氨基二羧基AA的等電點計算：TrpTyrPhe的紫外吸收光譜

摩爾吸收系數(shù)波長氨基酸與茚三酮反應(yīng)+3H20水合茚三酮(無色)NH3CO2RCHO+還原性茚三酮普魯士藍

(弱酸)加熱水合茚三酮+2NH3+還原性茚三酮氨基酸與茚三酮反應(yīng)紫色化合物鉈中毒癥狀最初為胃腸道刺激癥狀，如惡心、嘔吐、食欲減退，腹絞痛或隱痛，也有牙齦糜爛以及出血性胃炎等，有時患者僅表現(xiàn)為厭食或惡心。中毒后2至5天出現(xiàn)雙下肢酸、麻、針刺感，下肢特別是足部疼痛是鉈中毒的突出表現(xiàn)。運動障礙出現(xiàn)較晚，常可波及顱神經(jīng)，可發(fā)生視力減退、中毒性腦病。脫發(fā)也是鉈中毒的體征，一般于中毒后1至3周左右發(fā)生。指甲和趾甲于第4周出現(xiàn)白色橫紋。普魯士藍即亞鐵氰化鐵，是一種無毒色素

.氨基酸與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)

（sanger反應(yīng)）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色)++HF弱鹼中氨基酸氨基酸與苯異硫氰酯（PITC）的反應(yīng)

（Edman反應(yīng)）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱鹼中(400

C)(硝基甲烷400

C)H+第三節(jié)肽一、肽(peptide)和肽鍵(peptidebond)的概念二、肽的重要性質(zhì)

酸堿性質(zhì)、重要化學反應(yīng)類似于氨基酸性質(zhì)三、天然存在的活性肽生理活性肽的功能類別：激素、抗菌素、輔助因子

實例：谷胱甘肽(glutathione,GSH)

短桿菌肽

促甲狀腺素釋放因子（TRH）

-天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯（甜味劑）肽和肽鍵的形成肽鍵肽單位谷胱甘肽

谷胱甘肽在體內(nèi)參與氧化還原過程，作為某些氧化還原酶的輔因子，或保護巰基酶，或防止過氧化物積累。促甲狀腺素釋放因子（TRH）短桿菌肽S

-天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯CH2NH2

CH

C

NH

CH

C

OO

CH2COOH

O

CH3第四節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次的劃分二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)三、多肽主鏈折疊的空間限制和

維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力四、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)五、蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域六、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)七、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要層次一級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure超二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域

supersecondarystructureStructuredoman二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵的位置稱為蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(primarystructure)。這是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)，它內(nèi)寓著決定蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)和生物功能的信息。一級結(jié)構(gòu)測定例：牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)測定

基本戰(zhàn)略：片段重疊法＋氨基酸順序直測法要點：a.測定蛋白質(zhì)的分子量及其氨基酸組分

b.

測定肽鍵的N－末端和C－末端

c.

應(yīng)用兩種或兩種以上的肽鍵內(nèi)切酶分別在多肽鍵的專一位點上斷裂肽鍵；也可用溴化氰法專一性地斷裂甲硫氨酸位點，從而得到一系列大小不等的肽段。

d.

分離提純所產(chǎn)生的肽段，并分別測定它們的氨基酸順序

e.

將這些肽段的順序進行跨切口重疊，進行比較分析，推斷出蛋白質(zhì)分子的全部氨基酸序列。蛋白質(zhì)順序測定基本戰(zhàn)略

將肽段順序進行疊聯(lián)以確定完整的順序?qū)㈦亩畏蛛x并測出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y定二硫鍵拆開純蛋白質(zhì)酰胺平面與α-碳原子的二面角（φ和ψ

）

二面角

兩相鄰酰胺平面之間，能以共同的Cα為定點而旋轉(zhuǎn)，繞Cα-N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱φ角，繞C-Cα鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱ψ角。φ和ψ稱作二面角，亦稱構(gòu)象角。完全伸展的多肽主鏈構(gòu)象α-碳原子酰胺平面Φ=1800，ψ=1800Φ=00，ψ=00的多肽主鏈構(gòu)象酰胺平面Φ=00，ψ=00側(cè)鏈非鍵合原子接觸半徑維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的作用力

a.鹽鍵b.氫鍵c.疏水鍵d.范得華力e.二硫鍵多肽鏈四、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

(１)α－螺旋（α－h(huán)elix）(２)β－折疊（β-pleatedsheet）(３)β－轉(zhuǎn)角（β-turn）(４)無規(guī)則卷曲（nonregularcoil）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）指肽鏈主鏈不同區(qū)段通過自身的相互作用，形成氫鍵，沿某一主軸盤旋折疊而形成的局部空間結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象單元．主要有以下類型：特征：1、每隔3.6個AA殘基螺旋上升一圈，螺距0.54nm;

2、螺旋體中所有氨基酸殘基R側(cè)鏈都伸向外側(cè)，鏈中的全部>C=0和>N-H幾乎都平行于螺旋軸;3、每個氨基酸殘基的>N-H與前面第四個氨基酸殘基的>C=0形成氫鍵，肽鏈上所有的肽鍵都參與氫鍵的形成。

α－螺旋（α－h(huán)elix）形成因素：與ＡＡ組成和排列順序直接相關(guān)。多態(tài)性：多數(shù)為右手（較穩(wěn)定），亦有少數(shù)左手螺旋存在（不穩(wěn)定）；存在尺寸不同的螺旋。β－折疊（β-pleatedsheet）

特征：兩條或多條伸展的多肽鏈（或一條多肽鏈的若干肽段）側(cè)向集聚，通過相鄰肽鏈主鏈上的N-H與C=O之間有規(guī)則的氫鍵，形成鋸齒狀片層結(jié)構(gòu)，即β－折疊片。類別：平行反平行

β－轉(zhuǎn)角（β-turn）

特征：多肽鏈中氨基酸殘基n的羰基上的氧與殘基（n+3）的氮原上的氫之間形成氫鍵，肽鍵回折1800。無規(guī)則卷曲示意圖無規(guī)則卷曲細胞色素C的三級結(jié)構(gòu)五、蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

(2)結(jié)構(gòu)域（structuredomain）

蛋白質(zhì)中相鄰的二級結(jié)構(gòu)單位（即單個α－螺旋或β－折疊或β－轉(zhuǎn)角）組合在一起，形成有規(guī)則的、在空間上能辯認的二級結(jié)構(gòu)組合體稱為蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)

基本組合方式：αα；β×β；βββ

在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽進一步卷曲折疊成幾個相對獨立、近似球形的三維實體，再由兩個或兩個以上這樣的三維實體締合成三級結(jié)構(gòu)，這種相對獨立的三維實體稱為結(jié)構(gòu)域。

形成意義：

動力學上更為合理

蛋白質(zhì)（酶）活性部位往往位于結(jié)構(gòu)域之間，使其更具柔性(１)超二級結(jié)構(gòu)（supersecondarystructure

）超二級結(jié)構(gòu)類型βββααβ×β12345

52341

Β-鏈βαββ-迂回回形拓撲結(jié)構(gòu)回形拓撲結(jié)構(gòu)β-迂回卵溶菌酶的三級結(jié)構(gòu)中的兩個結(jié)構(gòu)域-螺旋-轉(zhuǎn)角-折疊二硫鍵結(jié)構(gòu)域1結(jié)構(gòu)域2

丙酮酸激酶結(jié)構(gòu)域4羧肽酶

腺苷酸激酶

(a)(b)

丙糖磷酸異構(gòu)酶乳酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域1黃素蛋白平行

-折疊的結(jié)構(gòu)比較（a）

-園桶形排布，（b）馬蹄形排布

六、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)

多肽鍵在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過側(cè)鏈基團的相互作用進一步卷曲折疊，借助次級鍵維系使α－螺旋、β－折疊片、β－轉(zhuǎn)角等二級結(jié)構(gòu)相互配置而形成特定的構(gòu)象。三級結(jié)構(gòu)的形成使肽鏈中所有的原子都達到空間上的重新排布。

實例：肌紅蛋白

核糖核酸酶肌紅蛋白三級結(jié)構(gòu)核糖核酸酶三級結(jié)構(gòu)示意圖

N

His12CHis119Lys41七、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)

四級結(jié)構(gòu)是指由相同或不同的稱作亞基（subunit）的亞單位按照一定排布方式聚合而成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，維持四級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力是疏水鍵、離子鍵、氫鍵、范得華力。亞基本身都具有球狀三級結(jié)構(gòu)，一般只包含一條多肽鏈，也有的由二條或二條以上由二硫鍵連接的肽鏈組成。實例：血紅蛋白

煙草花葉病毒的外殼蛋白四級結(jié)構(gòu)血紅蛋白四級結(jié)構(gòu)

煙草花葉病毒外殼蛋白四級結(jié)構(gòu)的自我組裝

第五節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能二、蛋白質(zhì)高級構(gòu)象與功能蛋白質(zhì)復(fù)雜的組成和結(jié)構(gòu)是其多種多樣生物學功能的基礎(chǔ)；而蛋白質(zhì)獨特的性質(zhì)和功能則是其結(jié)構(gòu)的反映。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)包含了其分子的所有信息，并決定其高級結(jié)構(gòu)，高級結(jié)構(gòu)和其功能密切相關(guān)。

一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，

也決定蛋白質(zhì)的功能1、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異與同源性

實例：細胞色素Ｃ2、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的變異與分子病

實例：血紅蛋白質(zhì)異常病變

鐮刀型貧血病3、蛋白質(zhì)前體的激活與一級結(jié)構(gòu)

實例：胰島素原的激活

高級構(gòu)象決定蛋白質(zhì)的功能

1、蛋白質(zhì)高級構(gòu)象破壞，功能喪失

實例：核糖核酸酶的變性與復(fù)性2、蛋白質(zhì)在表現(xiàn)生物功能時，構(gòu)象發(fā)生一定變化（變構(gòu)效應(yīng)）

實例：血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)和輸氧功能不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目生物與人不同的AA數(shù)目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、豬、羊、狗11馬12雞、火雞13響尾蛇14海龜15金槍魚21角餃23小蠅25蛾31小麥35粗早鏈孢霉43酵母44

不同生物來源的細胞色素c中不變的AA殘基

14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素細胞色素c分子的空間結(jié)構(gòu)不變的AA殘基

35個不變的AA殘基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與“識別”并結(jié)合細胞色素還原酶和氧化酶。正常紅細胞與鐮刀形紅細胞的掃描電鏡圖鐮刀形紅細胞正常紅細胞

-鏈N端氨基酸排列順序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…

Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…豬胰島素原激活成形成胰島素示意圖

核糖核酸酶變性與復(fù)性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis變性復(fù)性血紅蛋白輸氧功能和構(gòu)象變化O2HbHb-O2O2血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線活動肌肉毛細血管中的PO2020406080100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin第六節(jié)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)

一、兩性解離性質(zhì)及等電點二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的沉淀四、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性五、蛋白質(zhì)的紫外吸收特性六、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)

蛋白質(zhì)兩性解離性質(zhì)和等電點

pH=pI

凈電荷=0

pH<

pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+

當?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定pH值時，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點（isoelectric

point，pI）。二、電泳技術(shù)

1．電泳的一般原理2.

電泳技術(shù)的類別

3、常用電泳技術(shù)4、電泳技術(shù)的拓展電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH。如果混合物中各組分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，而達到分離鑒定各組分的目的。電泳技術(shù)分類垂直板電泳毛細管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜圓盤電泳常用電泳技術(shù)1、醋酸纖維薄膜電泳2、聚丙烯酰胺凝膠電泳3、瓊脂糖電泳4、毛細管電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）

1、一般PAGE2、SDS3、PAGE等電點聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

PAGE是在區(qū)帶電泳原理的基礎(chǔ)上，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠(PAG)作為支持物，采用電泳基質(zhì)的不連續(xù)體系(即凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、pH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性)或連續(xù)體系（一層凝膠、一種pH和一種緩沖溶液），進行電泳分離一種方法。

PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N

-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應(yīng)的催化系統(tǒng)有兩種?；瘜W聚合:催化劑過硫酸銨(AP)，加速劑TEMED

光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED

不連續(xù)PAGE三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)不連續(xù)PAGE的濃縮效應(yīng)

樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質(zhì)ABC++--樣品濃縮膠分離膠電極緩沖液低電位梯度E11高電位梯度E21+-SDS

原理：

當SDS（SodiumDodecylSulfate）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負電荷，并遠遠超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質(zhì)在SDS的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時產(chǎn)生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系?？捎孟率奖硎荆?/p>

LogMr=a–bmr應(yīng)用:測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)亞基數(shù)Mr（相對遷移率）mr（相對遷移率）LogMr等電點聚焦（isoelectricfocusing）

原理:

在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應(yīng)用：

高效率分離純化蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+線性梯度瓊脂糖電泳

瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈，這種多糖鏈在1000C左右時呈液態(tài)，當溫度下降到450C以下時，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。

瓊脂糖凝膠用作電泳的固相支持物具有分子篩效應(yīng)，其對生物分子的分離作用不僅與其分子的構(gòu)象及其相對分子質(zhì)量大小有關(guān)，而且與凝膠的濃度也有密切關(guān)系，故可根據(jù)分離對象分子量大小選擇適當濃度的凝膠。

瓊脂糖電泳常用于核酸分離，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為2OObP至5Okb的DNA，

瓊脂糖凝膠還常用作免疫電泳的固相支持物。不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍瓊脂糖凝膠濃度／(%)可分辨的線性DNA大小范圍／(kb)

0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.1DNA相對分子質(zhì)量標準物水平型平板電泳槽

蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)

由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征?？扇苄缘鞍踪|(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水化層，同時這些顆粒帶有電荷，因而蛋白質(zhì)溶液是相當穩(wěn)定的親水膠體。

蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用透析法:利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱為透析（dialysis）。

鹽析法:在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的硫酸銨、氯化鈉等中性鹽，可有效地破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層。同時又中和了蛋白質(zhì)表面的電荷，從而使蛋白質(zhì)顆粒集聚而生成沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析（saltingout）。透析（dialysis）半透膜袋蛋白質(zhì)溶液透析液磁棒磁力攪拌器

透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無機鹽單糖等分開。常用的半透膜：

玻璃紙（賽璐玢紙，cellophanepaper）

火綿紙（賽璐玎紙,celloidinpaper）

其他改型纖維素材料超過濾（ultrafiltration）

利用壓力、抽濾（A）或離心力（B）等多種形式，強行使水和其它小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性的截留相對分子量不同的蛋白質(zhì)。為了避免被膜截留的蛋白質(zhì)在膜表面上堆積，現(xiàn)常用截向流過濾的方法，即液體在泵驅(qū)動下沿著與膜表面相切方向流動，在膜上形成壓力，使部分液體透過膜，而另一部分液體切向地流過表面將被膜截留的蛋白質(zhì)分子沖走。濾膜抽氣濾膜離心AB蛋白質(zhì)的沉淀

如果加入適當?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。沉淀方法類別:

1、高濃度中性鹽（鹽析、鹽溶）2、酸鹼（等電點沉淀）3、有機溶劑沉淀4、重金屬鹽類沉淀5、生物堿試劑和某些酸類沉淀6、加熱變性沉淀

蛋白質(zhì)變性與復(fù)性

●蛋白質(zhì)各自所特有的高級結(jié)構(gòu)，是表現(xiàn)其物理性質(zhì)和化學特性以及生物學功能的基礎(chǔ)。當天然蛋白質(zhì)受到某些物理因素和化學因素的影響，使其分子內(nèi)部原有的高級構(gòu)象發(fā)生變化時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學功能都隨之改變或喪失，但并未導(dǎo)致其一級結(jié)構(gòu)的變化，這種現(xiàn)象稱為變性作用（denaturation）。

表征：生物活性喪失；物理性質(zhì)（溶解度、粘度、擴散系數(shù)、光譜特性等）和化學性質(zhì)（化學反應(yīng)，被酶解性）改變

應(yīng)用：變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰老……

●蛋白質(zhì)的變性作用如果不過于劇烈，則是一種可逆過程，變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象成為復(fù)性（renaturation）。蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng)

雙縮脲反應(yīng)酚試劑反應(yīng)→蛋白質(zhì)定量、定性

茚三酮反應(yīng)測定常用方法

雙縮脲反應(yīng)

蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物紅紫色絡(luò)合物(鹼性溶液)Cu2+蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜

蛋白質(zhì)在遠紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對蛋白質(zhì)進行定性定量鑒定。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260測定范圍：0.1～0.5mg/ml第一節(jié)生物大分子物質(zhì)的制備

一．一般過程和原則二．注意事項三．純化方案的設(shè)計和評價例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化確立有效成分的測定方法材料的選擇和預(yù)處理細胞的破碎和細胞組分分離有效成分的抽提有效成分的純化和濃縮生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法電泳法超離心法透析和超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等點電沉淀有機溶劑沉淀離心│←前處理→│←粗分級→│←細分級→│材料選擇與處理細胞破碎（機械破碎、溶賬和自溶、酶解、化學處理）生物組織→→提取液→

→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶分子大小溶解度電荷性質(zhì)吸附性質(zhì)生物親和力依據(jù)原理注意事項

基本原則：防止生物分子變性、降解1．控制適當?shù)膒H2．控制低溫