免疫組織化學(xué)染色注意事項(xiàng)

免疫組織化學(xué)染色注意事項(xiàng)

李磊抗體的保存濃縮抗體，在有效期以?xún)?nèi)，一般只需放在普通4℃冰箱內(nèi)保存，保存時(shí)間可達(dá)5-10年以上（免疫熒光試劑例外）。最好不要用塑料管分裝，因?yàn)樗芰蠈?duì)抗體有吸附作用，用負(fù)20℃至負(fù)40℃低溫冰箱冷凍，由于凍融也會(huì)使抗體效價(jià)降低。而即用型抗體保存時(shí)間一般在一年以?xún)?nèi)。用PBS稀釋的抗體，一般可放置1個(gè)月，稀釋比越低，效價(jià)降低越快。非特異性找色的原因1、抗體稀釋度過(guò)高，導(dǎo)致切片深染?，F(xiàn)象：無(wú)法分清細(xì)胞找色解決辦法：找出最佳的稀釋比陽(yáng)性對(duì)照染色正常，受測(cè)組織染色陰性一、抗原修復(fù)不當(dāng)。二、一抗與二抗檢測(cè)系統(tǒng)匹配錯(cuò)誤三、實(shí)驗(yàn)操作錯(cuò)誤四、使用不合格的稀釋劑五、一抗選擇錯(cuò)誤。六、一抗二抗檢測(cè)系統(tǒng)、顯色試劑被污染，失效或已超過(guò)有效期。七、二抗檢測(cè)系統(tǒng)與顯色試劑不匹配八、抗原含量過(guò)低九、試劑濃度過(guò)低，過(guò)高或不合適的孵育時(shí)間和溫度。陽(yáng)性對(duì)照正常，受測(cè)組織染色弱一、固定液使用不當(dāng)，破壞了組織的抗原二、組織經(jīng)固定和包埋后抗原被破壞。三、烤片溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。陽(yáng)性對(duì)照和受測(cè)組織均為染色弱一、抗原修復(fù)方式不正確或遺漏，或者是修復(fù)時(shí)間、溫度、修復(fù)液的PH值沒(méi)有達(dá)到要求。二、過(guò)氧化物酶阻斷試劑阻斷或血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，試劑濃度不合適。三、一抗，二抗檢測(cè)系統(tǒng)、顯色試劑濃度過(guò)高、過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短。四、使用已超過(guò)有效期的試劑。五、孵育溫度過(guò)低。六、滴加試劑時(shí)，組織上的緩沖液（或血清）殘留過(guò)多，導(dǎo)致試劑滴加后被稀釋。七、復(fù)染液復(fù)染過(guò)度。八、重復(fù)使用抗原修復(fù)液。九、顯色試劑孵育時(shí)間過(guò)短或試劑配制錯(cuò)誤。對(duì)照組織和受測(cè)組織，或在一些組織成分如脂肪、結(jié)締組織和上皮組織中有背景染色。一、抗原修復(fù)過(guò)度二、一抗?jié)舛冗^(guò)高，孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或孵育溫度過(guò)高。三、二抗檢測(cè)系統(tǒng)濃度過(guò)高，孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高。四、顯色試劑孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。五、PBS緩沖液重復(fù)使用多次或沖洗不足。六、使用錯(cuò)誤的封閉血清。七、切片粘附劑過(guò)厚。受測(cè)組織和陰性對(duì)照玻片有背景染色，而陽(yáng)性和陰性組織對(duì)照染色正常。一、組織固定不及時(shí)，造成部分抗原彌散并遺留在組織內(nèi)。二、取材時(shí)，由于使用鈍的刀片，導(dǎo)致組織受到人為擠壓而變形，血清蛋白彌散并遺留在組織內(nèi)。三、受測(cè)組織有部分壞死、損傷或壓迫成分。四、組織切片太厚。陰性試劑對(duì)照有背景染色，而陽(yáng)性、陰性組織對(duì)照和受測(cè)組織染色正常。一、陰性對(duì)照血清濃度不合適。二、陰性對(duì)照血清被污染并與受測(cè)組織中的蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。2、抗體不純或抗體特異性不強(qiáng)，交叉反應(yīng)較多，或抗體表達(dá)較弱現(xiàn)象：陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞都著色，只是陽(yáng)性細(xì)胞著色略強(qiáng)一些。像這類(lèi)情況很難有好的辦法解決，可找一個(gè)背景著色較淺的試劑盒試一下，或用其它修復(fù)方法試試。組織染色灶狀背景染色一、裱片時(shí)水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中滴加試劑后不易沖洗干凈，導(dǎo)致染色過(guò)深。二、用于裱片的水浴鍋中的水質(zhì)被細(xì)菌或酵母菌等污染。三、制作涂膠玻片時(shí)，濃度過(guò)高，干燥后在玻片留下白色小點(diǎn)，顯色時(shí)白色小點(diǎn)著色。色原顆粒未完全溶解。切片出現(xiàn)邊緣效應(yīng)一、組織邊緣與玻片黏貼不牢，經(jīng)抗原熱修復(fù)或后續(xù)緩沖液沖洗后，造成邊緣組織松脫浮在玻片上方，每次沖洗時(shí)不易將組織下面的試劑洗干凈，導(dǎo)致此區(qū)域染色過(guò)深。二、滴加試劑時(shí)，試劑未充分覆蓋組織，導(dǎo)致組織邊緣無(wú)試劑或試劑很少，孵育時(shí)此區(qū)域容易首先變干，造成濃度較中心組織高而導(dǎo)致染色過(guò)深。切片出現(xiàn)“陰陽(yáng)臉”著色一、滴加試劑時(shí)，試劑未完全覆蓋組織。二、試驗(yàn)操作臺(tái)不平或孵育盒不平，導(dǎo)致切片有個(gè)傾斜度最終導(dǎo)致“陰陽(yáng)臉”結(jié)果。三、滴加試劑到組織上時(shí)存在氣泡，卻沒(méi)有將氣泡除去。四、組織固定時(shí)間過(guò)短，造成中心部位固定不足。切片出現(xiàn)非特異的細(xì)胞核著色組織前期處理不適當(dāng)，如組織在二甲苯中浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，固定液使用不當(dāng)，組織變干，抗原修復(fù)液的PH值和修復(fù)時(shí)間不當(dāng)或修復(fù)過(guò)程中修復(fù)液蒸發(fā)過(guò)多，造成最后部分組織沒(méi)有浸泡在修復(fù)液中。使用生物素二抗檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，組織中內(nèi)源性生物素顯色這種非特異性顯色通常發(fā)生在高代謝器官組織中，當(dāng)組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)后，組織中所含的內(nèi)源性生物素同生物素二抗檢測(cè)系統(tǒng)中的鏈霉菌抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶發(fā)生鏈接二造成非特異性顯色，顯色多位于胞漿中，且迷惑性極大。使用辣根過(guò)氧化物酶二抗檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，組織中內(nèi)源性過(guò)氧化物酶顯色這種顯色通常發(fā)生在紅細(xì)胞，壞死組織，炎癥細(xì)胞中，是由于組織中所含的過(guò)氧化物沒(méi)有用相應(yīng)的阻斷試劑阻斷或阻斷不完全。3、抗體本身的特異性異常表達(dá)從理論上說(shuō)一種