1醫(yī)學科研的基本要素

醫(yī)學科研的基本要素主講老師：陳青山醫(yī)學院流行病學教研室

醫(yī)學科學研究的三大基本要素：處理因素受試對象實驗效應例如：用某種天然植物藥物治療再生障礙性貧血，觀察比較藥物對兩組病人血小板數量的影響處理因素：重組細胞因子及天然植物藥物受試對象：再生障礙性貧血病人實驗效應：血小板數量的變化一般而言：處理因素（包括生物、化學、物理或內外環(huán)境）指根據研究目的施加于受試對象的因素；受試對象指處理因素作用的對象，醫(yī)學科研的受試對象包括人、動物、細胞與分子；實驗效應指處理因素作用于受試對象所產生的效果和反應。三大基本要素的作用：構成完整的實驗設計；科學研究的必備條件；實驗準確、順利進行的必要保證。第一節(jié)實驗的類型及要素實驗有不同的分類方法，通常按實驗進程可將其分為——預備實驗決定性實驗正式實驗一、預備實驗預備實驗指在正式實驗前所進行的小規(guī)模實驗，簡稱預實驗。預實驗的目的：檢查各項準備工作是否完善；確定實驗操作方法是否正確可行；獲得某些基礎數據，以確保后續(xù)正式實驗的順利進行。不做預實驗的后果例如：某課題在觀察基因修飾的骨髓干細胞對Fischer344大鼠骨髓重建影響的研究中，研究者僅參照文獻報道中其他品系大鼠及小鼠骨髓抑制模型在建模時使用的60Co照射劑量，確定了照射方案，未經預實驗而直接開始正式實驗。結果在隨后“正式”實驗中，因所選照射劑量不適合該品系大鼠，多數模型大鼠在極短時間內死亡，故無法觀察處理因素產生的效應結果。此外，在實驗中還可遇到許多未知因素對實驗結果的影響，以及實驗者對實驗技術方法或實驗儀器操作不熟練而造成的實驗偏差等，都應在預實驗中加以解決。通常采用的方法是利用已知公認的肯定（陽性）和（或）否定（陰性）的樣本對實驗方法和結果的正確性進行驗證。預備實驗的分類(1)導向性實驗：是為了確定正式實驗的意義而針對少數對象進行的小規(guī)模實驗。例如：研究某種降壓藥物的降壓效果首先選取少量高血壓患者作為受試對象，檢測這種藥物是否對血壓有影響。若有降壓效果，再進行大規(guī)模的正式實驗探討該藥的確切療效，并評價其對不同類型高血壓患者的療效。(2)篩選性實驗：指從眾多研究對象或研究指標中選出值得深入研究的對象或需進一步驗證的指標。例如，從大量中草藥中篩選出若干種具有舒張血管功能的藥物，再進行藥理學研究(3)觀測性實驗：是為搜集正式實驗所需數據（如均數、標準差及變異系數等）而進行的小規(guī)模預試，目的是對主要實驗的部署進行指導。例：研究某藥物的傳染或毒性因子在觀測實驗中，采用稀釋度間隔很大（如100倍），用于每一稀釋度的動物很少（如2只）的策略。取得結果后，在可能有作用的滴定終點兩側再選擇間隔小（如5倍）的稀釋度，同時使用較多數量的動物（如5只）。通過此方法，可用最少量動物獲得準確的結果。二、正式實驗正式實驗是通過預實驗獲得所需數據并確認實驗可行性后進行的大規(guī)模實驗。正式實驗的特點：有明確的研究目的和可行的設計方案，能通過設置對照等實驗手段控制影響實驗結果準確性的干擾因素。通常在預實驗后、正式實驗開始前還需進行決定性實驗，即在預實驗所提供數據的基礎上，進行綜合性、整體性、關鍵性的實驗。預備實驗、決定性實驗和正式實驗通常在醫(yī)學科學研究中構成一個完整的實驗流程，其中預備實驗和決定性實驗是確保開展正式實驗的前提。第二節(jié)處理因素處理因素亦稱受試因素，是醫(yī)學科學研究的基本要素之一。一般而言，處理因素是指外界施加于受試對象的因素，是在實驗中需觀察并闡明其效應功能的因素。通常包括——生物因素（如細菌、病毒、生物制品等）化學因素（如藥物、激素、毒物等）物理因素（如溫度、射線、手術等）生物體及其本身的某些特征（如動物品系、人的年齡、性別、民族、遺傳特性等）。選擇處理因素時易犯的錯誤：抓不住實驗中的主要處理因素，選擇過多或過少的處理因素。選擇過多使實驗分組及受試對象的例數增多，實驗誤差難以控制；選擇過少則因處理因素過少使研究工作缺乏深度與廣度。例如：研究者擬觀察類風濕患者外周血調節(jié)性T細胞(regulatoryTcells，Treg)數量，分析IL-4，GM-CSF，IL-6及TGF-(3對其分化發(fā)育及功能的影響。研究中，施加于受試對象(Treg)的處理因素包括影響Treg分化發(fā)育和功能的4種細胞因子，由于處理因素過多，再加之實驗目的欠清晰，故難以確定主要處理因素。需注意如下問題：(1)抓住實驗研究中的主要處理因素：主要處理因素通常是在本人或他人提出的某些假設的基礎上，根據研究目的的需要與實施的可能性而確定。(2)找出研究中的非處理因素并加以控制：科學研究中除確定的處理因素外，凡是影響實驗結果的其他因素均須明確，這些因素被稱為非處理因素，或稱混雜因素。非處理因素可產生混雜效應，影響處理因素效應的對比和分析。(3)處理因素的標準化：處理因素的標準化，即如何保證處理因素在實驗全過程始終如一，保持不變，按同一標準進行。施加于受試對象的處理因素的強度、頻率、持續(xù)時間及施加方法等，均應通過查閱文獻和預試驗確定其最佳條件，并使之在整個研究中相對固定。如處理因素是細胞因子，須正確選擇批號，且分裝儲存方法、施加處理方式、劑量及時間等均應標準化和相對固定化。一、實驗中的主要處理因素實驗研究中主要處理因素的選擇與確定對研究結果的意義至關重要。確定主要處理因素通常基于本人或他人提出的假設，并根據研究目的的需要與實施的可能性而決定。例如：1920年加拿大青年醫(yī)生班廷基于德國籍俄羅斯裔學者明科夫斯基提出的“胰腺能分泌某種抗糖尿病物質”假說以胰腺分泌物為主要處理因素，探索胰腺分泌物中抗糖尿病物質的分離并研究治療糖尿病的效應最終在生化專家柯利普幫助下獲得可用于臨床治療的胰島素，并首次成功治療一位14歲患兒。班廷等人1923年獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。如何抓住主要因素——首先熟悉所研究領域的相關信息和本人前期研究工作的發(fā)現，通過大量閱讀文獻，為確定主要處理因素奠定基礎。同時，研究者還應根據研究項目的目的不同，以及人力、物力和時間的限制，抓住主要因素，合理選擇受試對象，控制非處理因素對處理因素效應的影響。二、單因素與復因素根據施加于受試對象的處理因素的多少，可將實驗研究分為單因素研究（如觀察單一藥物療效）與復因素研究（同一實驗中施加一個以上處理因素）。例如：某研究觀察低氧環(huán)境下基質金屬蛋白酶一9對滋養(yǎng)細胞生物學行為的影響，低氧環(huán)境和基質金屬蛋白酶一9即為實驗中的兩個處理因素，稱為復因素研究。一次實驗中的處理因素通常不宜過多否則須增加分組及受試對象的數目，實驗條件難以控制且可能加大實驗誤差；處理因素也不能過少單因素實驗雖簡單易行，但因處理過于單一，所能觀察到的結果和說明的問題較少，影響研究的廣度、深度和效率，使研究結論受到限制。解決對策是，增加處理因素水平。例如：在研究某藥對腫瘤細胞侵襲行為的影響時，將藥物分為大、中、小劑量組，觀察不同劑量藥物對受試對象的影響，可有效擴大實驗結果的信息量。處理因素數量與不同處理水平之間可有多種組合方式，包括單因素單水平、單因素多水平、多因素單水平和多因素多水平。研究人員宜根據自身實驗目的設計合理的實驗方案。1．單因素單水平（表3-1）表3-1細菌脂多糖對人外周血單個核細胞干擾素Y分泌的影響2．單因素多水平（表3-2）表3-2孕激素對滋養(yǎng)細胞基質金屬蛋白酶一9表達的影響3．多因素單水平（表3-3）表3-3美托康對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用4．多因素多水平（表3-4）表3-4地塞米松抗過敏效應實驗研究三、處理因素與非處理因素科學研究中除處理因素外，其他能影響實驗結果的因素稱為非處理因素某些非處理因素也可產生與處理因素相似的效應，從而可能掩蓋或混淆處理因素的作用。例如，擬研究雌激素、孕激素對妊娠早期子宮自然殺傷細胞(uterinenaturalkillercell，UNK)趨化因子產生的影響處理因素：雌激素和孕激素；受試對象：孕婦；對實驗結果造成干擾的因素——年齡、營養(yǎng)、健康狀況，實驗操作因素（如細胞分離時間、方法等）培養(yǎng)液中常用的酚紅指示劑具有雌激素樣作用，可對上述實驗處理因素造成干擾故應選用無酚紅培養(yǎng)基進行該實驗研究。再如，研究某種傳統(tǒng)藥物與化學藥物治療再生障礙性貧血病人的療效非處理因素:年齡、性別、營養(yǎng)狀況等如果兩種主要處理因素下的兩組病人的年齡、性別、營養(yǎng)等差異過大，則可能影響藥物療效的比較。對非處理因素的控制一般通過設立對照組而實現。每種處理因素均需設相應對照，實驗組與對照組間除處理因素不同外，其他條件須盡量一致。醫(yī)學研究中對照組設置的遵循原則：對等（除處理因素外，對照組要具備與實驗組對等的非處理因素）同步（在整個研究進程中對照}組與實驗組始終處于同一空間和同一時間）專設（任何一個對照組均為相應實驗組而專門設立）四、處理因素的標準化施加于受試對象的處理因素須在整個實驗過程中保持不變，全部實驗條件須一致。如處理因素的施加方法、強度、頻率和持續(xù)時間等，均須通過查閱文獻或在預備實驗中找出各自的合理條件，確定相對固定的條件和方法。通過標準化處理因素，保證每個實驗都按照統(tǒng)一進行，減少因標準不一致造成的失敗或誤差。例如，為觀察某細胞因子對腫瘤細胞生物學行為的影響，應盡量統(tǒng)一——細胞因子的廠家、批號、配制分裝及儲存方法，對選定的實驗指標如侵襲實驗、凋亡所用實驗等應確定實驗方法，建立標準統(tǒng)一的操作流程，全部實驗條件須保持一致。處理因素若是藥品，則應規(guī)定藥品的名稱、性質、成分、批號、出廠日期、保存方法等。如研究接觸粉塵量與塵肺發(fā)病時間的關系，對接觸粉塵量這個因素可標化為車間粉塵平均濃度乘以接觸時間；若處理因素是針灸，須規(guī)定所用針具的型號，針刺使用的手法、留針時間、行針時間和次數、穴位、每日針1次或隔日針1次、針幾次1個療程等；研究中如檢測臨床標本，須首先制定標本采集、處理和存放的標準，如取血及組織的時間、分離存放條件等，避免由于標本處理條件不一致所導致的誤差。易犯的錯誤：在研究過程中對處理因素的標準化不夠重視，研究中經常更換不同廠家生產的細胞因子或單克隆抗體（生產廠家、批號不一致，生物制劑的活性可能各異）；臨床標本的采集與處理缺乏標準化的概念，導致實驗數據混亂，難以判斷是標本采集和處理不規(guī)范對實驗結果的影響，或是處理因素所致的實驗效應。第三節(jié)受試對象受試對象是處理因素施加的對象，亦稱實驗對象或研究對象。正確選擇受試對象是實驗成功的關鍵。大多數醫(yī)學研究的受試對象是動物或人，也可以是器官、細胞、分子或基因。醫(yī)學科研中，受試對象應同時滿足兩個基本條件。(l)須對處理因素敏感：開展相關研究制備動物模型時，須擇敏感性高的動物，還須注意年齡（月齡）、性別、體重、窩別、營養(yǎng)狀況及生活環(huán)境等因素。(2)反應須穩(wěn)定：例如為研究某藥對高血壓患者的降壓效果，宜選用Ⅱ期高血壓患者作為受試對象，因Ⅱ期高血壓患者本身血壓波動較大，而Ⅲ期高血壓患者對藥物的敏感性低。受試對象應診斷明確（依照國內或國際統(tǒng)一的診斷標準）、具有典型性臨床表現、病史記錄全面（心理狀況、情緒起落、病情程度、病程長短、生活習慣、個人嗜好、飲食狀況、家族史等。一、人體人體是臨床科研中常選用的受試對象，以人體為研究對象的實驗研究稱為人體觀察或人體實驗研究。人體觀察的受試對象為人——實驗設計須符合并通過生物醫(yī)學研究機構的倫理審查，須針對研究目的制定受試對象人選及剔除原則，并保證臨床資料完整性。人體觀察實驗往往需多方聯(lián)合協(xié)作，可能導致實驗條件不一致，故在實驗設計時，應對各環(huán)節(jié)均制定詳盡的統(tǒng)一標準。（一）倫理審查人體觀察在人類征服傳染性疾病的過程中做出重要貢獻。隨著科學技術發(fā)展和人類社會進步，涉及人的生物醫(yī)學研究和臨床試驗項目的倫理學問題成為學術界關注的焦點之一。人體觀察與動物實驗的最大區(qū)別在于前者須采取安全、可靠的方法，不能以損害人體健康為研究的代價，同時須遵守人道主義和倫理學基本原則1964年《赫爾辛基宣言》問世，隨后，基于涉及人的生物醫(yī)學研究和臨床試驗的倫理審查，世界醫(yī)學協(xié)會修改的《赫爾辛基宣言》及國際醫(yī)學科學組織理事會和世界衛(wèi)生組織共同頒布的《涉及人的生物醫(yī)學研究的國際倫理準則》等，我國衛(wèi)生部于1998年頒布了《涉及人的生物醫(yī)學研究倫理審查辦法（試行）》2007年衛(wèi)生部發(fā)布了關于印發(fā)《涉及人的生物醫(yī)學研究倫理審查辦法（試行）》的通知充分體現了保護人的生命和健康、維護人的尊嚴、尊重和保護受試者權益的宗旨?！渡婕叭说纳镝t(yī)學研究倫理審查辦法（試行）》的審查原則主要包括：(1)尊重和保障受試者自主決定同意或不同意受試的權利，嚴格履行知情同意程序，不得使用欺騙、利誘、脅迫等不正當手段使受試者同意受試，允許受試者在任何階段退出受試；(2)對受試者的安全、健康和權益的考慮必須高于對科學和社會利益的考慮，力求使受試者最大程度受益和盡可能避免傷害；(3)減輕或者免除受試者在受試過程中因受益而承擔的經濟負擔；(4)尊重和保護受試者的隱私，如實將涉及受試者隱私的資料儲存和使用情況及保密措施告知受試者，不得將涉及受試者隱私的資料和情況向無關的第三者或者傳播媒體透露；(5)確保受試者因受試受到損傷時得到及時免費治療并得到相應賠償；(6)對于喪失或者缺乏能力維護自身權利和利益的受試者（脆弱人群），包括兒童、孕婦、智力低下者、精神病人、囚犯以及經濟條件差和文化程度很低者，應當予以特別保護。（二）受試對象入選原則1．診斷標準

人體觀察研究的受試者須采納國際或國內公認的診斷標準（權威性機構頒布的標準、全國性專業(yè)學會標準或某些權威著作的標準、國際通用標準），對有不同分型的疾病應列出其分型（或分期、分度、分級）標準，即診斷標準原則上要遵循公認、先進、可行的原則，并應注明診斷標準的名稱、來源（包括原作者和修訂者）、制定時間及簡要的說明。2．排除標準根據研究目的不同，還應考慮某些應予排除的因素，其標準各異。一般而言，進行新藥臨床研究的病例排除標準，須考慮年齡、合并癥、婦女特殊生理期、病因、病型、病期、病情程度、病程、既往病史、過敏史、生活史、治療史、鑒別診斷等。3.剔除標準

(1)不符合納入標準而被誤納入的病例和雖符合納入標準而納入后未曾服藥的病例；(2)觀察中受試者自行退出者；(3)醫(yī)生認定受試者應退出的病例，涉及——①受試者依從性差、符合納入標準而因某種原因未完成觀察的病例；②發(fā)生嚴重不良事件、并發(fā)癥和特殊生理變化而不宜繼續(xù)接受觀察的病例；③盲法研究中被破盲的病例；④未按觀察方案規(guī)定用藥的病例；⑤統(tǒng)計學分析時應結合實際情況處理，如發(fā)生不良反應者應計入不良反應的統(tǒng)計。一般剔除的病例不得超過總病例數的5%，如超過10%則研究結論不可信。4．觀察臨床資料的完整性觀察表格的科學性、合理性及臨床研究資料收集的完整準角與否，直接影響臨床研究質量的好壞及成果的重要性。（三）人體實驗常見的設計類型描述性研究病例報告、病例分析、橫斷面研究等；分析性研究病例對照研究、隊列研究、臨床試驗等。1．病例報告指通過對某種罕見病例進行記錄和描述，為疾病的發(fā)病表現、機制及診冶提供詳盡的感性資料，從而可能形成某種新的假設。病例報告往往是識別新出現或不常見的疾病或疾病罕見表現的第一線索。許多疾病均通過病例報告而被發(fā)現，如艾滋病、軍團病、孕婦服用沙利度胺所致新生兒先天畸形、口服避孕藥增加靜脈血栓栓塞的危險等。2．橫斷面研究普查指對某地區(qū)或者某單位所有人員進行全面調查，以了解該地區(qū)或該單位某種疾病的發(fā)病情況。抽樣調查指從被研究人群中隨機抽取一部分具有代表性的病例作為研究對象，描述這部分病例的患病情況。3．病例對照研究回顧性研究的一種方法，回顧病例組暴露因素，通過與對照組暴露因素進行比較，研究這些暴露因素的某些指標與該疾病發(fā)病率之間的關系。如研究某種化學因素或環(huán)境因素對腫瘤發(fā)病率的影響，通常需采用病例對照研究方法。4.隊列研究按照所研究人群是否暴露于某種因素，將受試對象分為實驗組和對照組，隨訪觀察兩組人群某病的發(fā)病率，判斷暴露因素與疾病發(fā)病率的關系。隊列研究可分為前瞻性隊列研究和回顧性隊列研究。5．臨床試驗臨床試驗中的受試對象一般采用隨機化原則分為治療組和對照組，研究者根據實驗目的給予處理因素，并盡量控制非處理因素對實驗結果的影響。臨床試驗可分為——隨機對照試驗、交叉試驗、自身前后對照試驗、非隨機同期對照試驗和序貫試驗等。二、動物動物實驗是指醫(yī)學研究中以動物作為受試對象的實驗。動物實驗對生命科學研究不可或缺，已逐漸成為醫(yī)學各學科（如生理、病理、心理及藥物研發(fā)等）發(fā)展的基礎，推動了諸多領域的突破性進展。（一）動物保護與倫理審查近20年來，人們對動物福利及倫理日趨關注，許多國家通過了動物福利法案，并成立“實驗動物倫理委員會”，某些國際著名學術刊物已要求論文作者提供所在單位“實驗動物倫理委員會”的審查和批準。1988年我國頒布《實驗動物管理條例》2006年9月又制定并印發(fā)《關于善待實驗動物的指導性意見》總則中還提出善待實驗動物，倡導動物實驗研究的“3R”原則：①Reduce，即減少每次實驗中所需動物數量；②Refine，善待動物，盡量減少動物所受痛苦和傷害；③Replace，即使用其他手段替代動物實驗。（二）動物的選擇為正確選擇實驗動物種類，在動物實驗開始前須大量閱讀相關文獻，以了解實驗動物學知識。1．常用實驗動物

醫(yī)學研究中常用實驗動物包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、豬、牛、羊、地鼠、貓、獼猴、黑猩猩、馬、鹿等。2．選擇實驗動物的一般原則(1)遵循國際及我國相應的動物福利及倫理要求，嚴格執(zhí)行動物實驗研究的國際通用“3R”原則。(2)生物醫(yī)學實驗須選用與人的機能、代謝及疾病特點相似的動物，利用實驗動物與人類某些相近的特性，通過動物實驗對人類疾病的發(fā)生、發(fā)展及規(guī)律進行推斷和探索。例如，不同哺乳動物，其機體各系統(tǒng)組成、組織結構均存在許多相似點，其生命活動的基本功能具有相近的特性。從進化角度，猩猩和猴與人類最接近，其在解剖學、組織器官功能、白細胞抗原及染色體帶型等方面與人類非常相似，故選用這些動物所獲得的實驗結果推測于人類，具有很強的說服力，但這些動物的研究成本昂貴。(3)實驗動物選擇中須充分利用不同品種、品系實驗動物存在的某些特殊反應，選擇解剖、生理特點符合本實驗目的要求的實驗動物。例如：家兔對體溫變化十分敏感，宜選用作發(fā)熱、解熱及致熱原檢查實驗；觀察避孕藥對排卵影響的實驗宜選用兔、貓；以高膽固醇膳食飼喂兔、雞、豬、犬、猴等動物，均可誘發(fā)高脂血癥或動脈粥樣硬化，而猴和豬的心臟冠狀動脈前降支還形成斑塊及大片心肌梗死，情況與人更為相似，故動脈粥樣硬化實驗多選用豬、猴及；家犬的胰腺、胃較小，宜用于胰腺摘除術及胃腸道生理的研究；大鼠無膽囊，不會嘔吐，故不能用于膽功能觀察；犬、貓、猴等動物嘔吐反應敏感，適宜用于嘔吐實驗；對具有雌激素活性的藥物進行避孕藥效研究，不能選用小鼠與大鼠。(4)首先選擇結構、功能簡單且能反映研究指標的動物。在能反映實驗指標的情況下，宜盡量選用結構功能簡單的動物，如被作為模式生物的果蠅，其生活史短（僅12天左右）、飼養(yǎng)簡便、染色體數少（只有4對），同時具有較復雜的生命現象，不僅成為遺傳學研究的絕好材料，在抗感染免疫及腫瘤侵襲特性等研究中也具有廣泛應用前景。(5)選擇適齡實驗動物許多疾病模型的建立對動物年齡有要求，若選擇不當，則不能成功建模。例如誘導免疫耐受，一般需使用胎鼠或幼齡鼠；慢性實驗或觀察動物的生長發(fā)育，應選擇幼齡動物；開展老年醫(yī)學研究，通常選用代謝和功能反應接近老年的老齡動物。（三）實驗動物分類實驗動物指專供醫(yī)學、藥學、生物學、獸醫(yī)學等領域的科研、教學、醫(yī)療、鑒定、診斷、生物制品所用的動物。其特點是——由人工飼養(yǎng)、繁育而成；所攜帶的微生物及寄生蟲受到控制；遺傳背景明確或來源清楚。按微生物學要求，實驗動物分為4個等級：①I級，即普通動物(conventionalanimals，CV)微生物控制要求中級別最低的動物，可用于教學示教及預實驗，但須不存在可能傳染給人類的各種疾病，如皮膚真菌、寄生蟲、結核桿菌等；②Ⅱ級，即清潔動物(cleananimals，CI)用于開展一般動物實驗，其除不帶有普通動物應排除的病原體外，還應不攜帶可能危害動物和干擾科學實驗結果的病原體，如流行性腹瀉病毒、絲蟲病、球蟲病、蠕蟲（除蛔蟲外）病等；③Ⅲ級，即無特定病原體動物(specificpathogen-freeanimals，SPF)動物為剖官產或子宮切除產，均按純系要求進行繁殖，在隔離環(huán)境下飼養(yǎng)，動物體內無致病菌，此類動物是目前國際公認的標準級別實驗動物，適用于所有科研實驗；④Ⅳ級，即無菌動物germ-freeanimals，GF)和悉生動物(gnotobioticanimals)前者指在全封閉條件下飼養(yǎng)的純系動物，采用當前手段無法檢出任何病原體。后者又稱已知菌動物，指用與無菌動物相同的方法飼養(yǎng)，但明確體內所給予的已知微生物的動物，一般將1～3種已知微生物植入無菌動物體內獲得。Ⅳ級實驗動物一般用于具有特殊目的和要求的實驗，如病原研究、宿主與微生物之間關系研究、抗腫瘤研究等。按照遺傳學特性要求，實驗動物分為4類：①I類即近交系，或稱為純系其經20代以上全同胞或親子交配而成，基因純合程度達98%以上，故動物個體間在遺傳特征上高度一致，對處理因素反應的離散性較小，實驗組間可比性強，如常用于制備單克隆抗體的BALB/c小鼠屬近交系小鼠；②Ⅱ類為突變系動物指通過基因變異而具有某種遺傳缺陷的純系動物，常用于制備疾病模型（如裸鼠、糖尿病小鼠、侏儒癥小鼠等），目前借助轉基因技術或基因敲除技術，可制備高表達特定基因或使特定基因缺陷的動物，以觀察動物發(fā)育及其生理功能改變；③Ⅲ類為遠交系動物，又稱封閉群是通過非近親交配方式進行繁殖一定代次的實驗動物生產群體，如我國昆明種小鼠多為采用隨機交配而成的遠交系，大鼠遠交系常用Wistar大鼠和SD大鼠；④Ⅳ類為雜交群，或稱異系雜交由不同品系間交配而產生。雜交一代動物不僅遺傳背景清楚，且由于雜種優(yōu)勢，其適應性強，反應較均一，是使用極為廣泛的實驗動物。三、細胞細胞是生物體結構和功能的基本單位，也是生命活動的基本單位，在生物進化中處于核心地位。細胞水平研究是最基本的實驗研究模型。細胞學實驗是以細胞作為受試對象的研究。細胞學實驗主要內容包括——從體內分離細胞；借助細胞培養(yǎng)技術模擬體內生理條件，使其在人工條件下生存、生長、繁殖和傳代；以細胞模型研究細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等。細胞生物學行為主要研究——細胞周期、細胞分裂、細胞增殖與分化、細胞凋亡與壞死、細胞逆境適立、細胞間相互作用、物質運輸、細胞遷移及其相關信號通路調控網絡等，有利于更精確地了解生物體的生長、發(fā)育、分化、繁殖、運動、遺傳、變異、衰老和死亡等基本生命現象。以細胞為受試對象的研究具有如下特點：可體外操作；可直接觀察處理因素所致的效應；可進行連續(xù)動態(tài)生物學現象觀察；實驗的安全性和可重復性好；尤其適合研究信號通路中信號分子及信號轉導的調控機制。體外細胞學實驗研究存在一定局限性：①難以精確模擬機體內環(huán)境、正常細胞的比例及細胞一細胞間的相互影響；②難以真實反映機體的整體調節(jié)；③培養(yǎng)方法可能影響細胞形態(tài)及功能，且實驗操作易受各種因素干擾，故須嚴格控制實驗條件，才能獲得可靠結果。細胞與細胞系的類型：1．正常細胞與正常細胞系借助機械研磨、酶消化及磁珠分選等技術從正常人體組織器官分離目的細胞（如各種免疫細胞、不同來源的干細胞等）。除血細胞外，多數正常組織來源的細胞具有貼壁生長、接觸生長抑制等特點，且正常細胞有一定壽命，在體外傳代培養(yǎng)若干代后即會死亡。2．腫瘤細胞與腫瘤細胞系目前已建立的細胞系中以腫瘤細胞系為最多。腫瘤細胞的培養(yǎng)與研究在闡明癌癥發(fā)生發(fā)展機制及抗癌新藥研發(fā)中具有重要價值。體外細胞培養(yǎng)進行腫瘤研究具有如下優(yōu)點：(1)不受機體內環(huán)境因素影響，從而避免個體差異，有利于探討各種物理、化學和生物因素對腫瘤細胞生命活動的影響。(2)便于同時從細胞、分子與基因三個水平研究腫瘤細胞的結構、功能及癌變發(fā)生饑制。(3)能長期傳代、保存，便于觀察腫瘤細胞生物學特性和遺傳行為的改變。(4)能快速篩選抗癌藥物，適宜進行耐藥機制的研究。(5)研究周期較短，經濟。體外培養(yǎng)存在缺點：長期培養(yǎng)可使細胞生物學特性發(fā)生改變例如：黑色素瘤B16細胞系在體外多次傳代后，產黑色素能力及貼壁能力下降；NK92細胞系體外長期傳代，其表達某些標志性表面分子的能力降低甚至喪失，如從NKG-2D陽性轉為陰性，即喪失原有生物學特性，故應特別注意細胞傳代的代數問題。所獲結果并非完全代表體內情況。3．原代細胞、傳代細胞、細胞株經特殊分離方法從胚胎、組織器官及外周血等處分離的細胞在體外培養(yǎng)，該類細胞被稱為原代細胞。相應培養(yǎng)技術稱為原代培養(yǎng)技術。離體時間越短，原代培養(yǎng)細胞性狀與體內相似性越大，故將原代細胞作為受試對象時，應注意處理因素和作用時間。4．細胞庫資源5．人工修飾的細胞四、分子DNA、RNA和蛋白質是三種重要的生物大分子，是生命現象的分子基礎。以上述三種生物大分子為受試對象，研究其結構、性質及調節(jié)，此乃揭示正?；虍惓ＩF象發(fā)生機制的重要途徑。（一）DNADNA是生物體的遺傳物質基礎，具有貯存和傳遞遺傳信息的作用。遺傳物質的最小功能單位（DNA分子中含特定遺傳信息的核苷酸序列）稱為基因單倍體細胞中全部基因為一個基因組。（二）RNA細胞內的信息一般按信息的儲存形式(DNA)、功能形式(RNA)到編碼蛋白質的順序進行傳遞，此即生物學的中心法則。（三）蛋白質與蛋白質組蛋白質是經mRNA翻譯而產生，一個細胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達的全部蛋白質種類稱為蛋白質組(proteome)。蛋白質是生命活動的主要體現者，以其為受試對象的研究包括蛋白質的時空分布、結構、功能及其相互作用方式。疾病發(fā)生通常由蛋白質結構和功能非常所致，故蛋白質分子被視為治療人類疾病和抗傳染病藥物的主要靶點。第四節(jié)檢測指標（效果反應）效果反應是處理因素作用于受試對象所致的實驗效應，是醫(yī)學研究的核心內容。效果反應須通過具體檢測指標而表達，后者指可被儀器檢測或研究者感知的特征或現象，可通過定性或定量方式體現處理因素作用前后受試對象某些生理、病理或生化指標的變化。合理的指標選擇可體現——實驗設計科學性實驗結果的準確性實驗結果的特異性實驗結果的客觀性。一、指標選擇的原則遵循客觀性、特異性、靈敏性和精確性等基本原則。某些效應如采用單一指標檢測、判斷結果，其可信度不足，往往采用至少兩種以上方法（如檢測細胞凋亡）。研究者應根據研究的目的和擬揭示問題的角度，選擇能說明問題的指標。另外，還需注意指標間的關聯(lián)性，避免相似指標的堆積，造成不必要的時間、精力和財力的浪費。（一）指標的客觀性(l)主觀指標：觀察者或受試對象的主觀判斷或感受例如：觀察者對受試對象精神狀態(tài)、營養(yǎng)狀態(tài)、異常行為等總體表現的評價以及受試對象對疼痛、眩暈、焦慮等主觀癥狀的感受和描述等。例如：檢查痛覺時，用針刺深度或壓強進行定量，但什么深度發(fā)生疼痛仍有賴于受試者主觀感覺和敘述而判斷，故仍屬主觀指標。(2)客觀指標：其數據通過設備或儀器測定而獲得，能真實顯示效果反應大小或性質，其數據的真實性與所用儀器或設備的精密性有關，而不受人為主觀因素干擾。例如——應用流式細胞儀檢測膜表面蛋白表達；定量PCR儀檢測基因；臨床上檢測血液生化指標；……（二）指標的靈敏度指標靈敏度指處理因素的作用水平發(fā)生變化時，指標效應量的增減幅度。靈敏度大小一般根據檢測指標所能正確反映的最小數量級或水平而確定。靈敏度高的指標對外界反應靈敏，能顯示處理因素的微小效應，從而減少假陰性發(fā)生率，醫(yī)學科研中常用的聚合酶鏈反應法、放射免疫分析法等，均具有很高靈敏度。靈敏度低的指標則難以正確反映處理因素的效應，易造成假陰性，故應盡量選擇高靈敏性的指標。（三）指標的精確性涉及兩重含義：①精密度，指同一現象重復觀察時，各次測定值與平均值的接近程度，即檢測指標的可重復性，精密度常用變異系數或標準差表示，反映隨機誤差的大??；②準確度，指測定值與真實值接近的程度，體現所觀察結果的真實程度，主要受系統(tǒng)誤差影響。理想的實驗指標應既準確又精密，而首先保證準確、可靠。（四）指標的特異性為更好體現處理因素的效應，所選擇的檢測指標還應具有特異性，即所選擇的檢測指標應能特異性反映某一特定現象，且不易受其他因素干擾。指標的特異性越高，越能體現處理因素的作用效果。（五）指標的關聯(lián)性指檢測指標與實驗目的應具有本質的相關性，能正確反映處理因素的效應。為使所選檢測指標具有關聯(lián)性，研究者須充分了解和熟練掌握相關領域的背景知識，分析事物間相關程度，從而選擇關聯(lián)性高的檢測指標。（六）指標的穩(wěn)定性指所觀察到的數據波動幅度的大小，波動幅度小，穩(wěn)定性好；波動幅度大，穩(wěn)定性差。（七）指標的可行性指標的可行性包括兩個方面：①檢測指標的設置應盡可能明確易懂，指標數據易于采集、計算，采集的數據須進行標準化、規(guī)范化處理，方便各項指標的定量處理，盡量不采用實際操作中難以采集或處理的指標；②獲得檢測指標的實驗方法和各項指標的計算方法均須簡便、科學、易于掌握。（八）指標的可比性指標的可比性，包括：①縱向可比性，指從時間上可通過檢測指標來分析處理因素的實驗效應；②橫向可比性，指可通過檢測指標分析比較各組處理因素的效果反應。另外，檢測指標應符合公認標準，以保證指標間的可比性。還須考慮選擇指標的認可性。還應注意：(l)實驗標本的采集處理與保存：實驗過程中標本的采集、處理及保存須嚴格標準化。如提取組織總RNA時，所采集的新鮮組織應立即處理或置液氮中保存，所使用的實驗用品須無RNA酶污染并經高壓滅菌。(2)指標的檢測方法應標準化：實驗過程中，要保證實驗儀器、實驗方法和所用試劑固定不變，盡量減少其對實驗結果的干擾。尤其是對同一實驗指標進行重復驗證時，若采用不同實驗方法，實驗結果往往出現顯著性差別。例如，臨床血小板計數試驗中，若檢測標本采用不同抗凝劑，則可能因抗凝劑促血小板聚集程度的不同而影響實驗結果(3)多種檢測指標相互補充：醫(yī)學科研中，由于單一指標的局限性，往往難以全部體現處理因素的作用效應，而需選用不同檢測指標，以相互驗證和互為補充。例如，臨床上采用多項指標判斷肝功能。但強調多指標聯(lián)合檢測并非意味著所選擇的檢測指標越多越好，應根據實驗目的，按照指標選擇的基本原則確定合理的實驗指標。(4)檢測指標的可靠性和穩(wěn)定性：確定檢測指標后，實驗過程中須對該指標進行多次重復檢測，以保證指標的可靠性和穩(wěn)定性。二、指標的種類醫(yī)學科研所采用的檢測指標繁多，應用時須根據實驗目的、指標性質和實驗條件進行選擇。根據指標所能反映的機體基本特征，可分為形態(tài)學、生物化學、生物物理學、免疫學、生理學等指標。（一）形態(tài)學指標判斷處理因素對受試對象影響，最直觀的檢測指標就是形態(tài)學檢測，其通過肉眼或借助儀器設備觀察受試對象形態(tài)學改變而獲得結果，包括解剖學、組織學、病理學、醫(yī)學影像等指標。形態(tài)學指標能直觀測定受試對象大體水平、組織水平及細胞、亞細胞水平的變化，包括腫瘤瘤體大小、轉移灶多少、細胞凋亡及轉化、蛋白質分子的功能定位及組織與病理學改變等。（二）生化指標生化指標一般指機體的肝功能、腎功能、電解質、血糖、血脂、蛋白質及各種酶類等的檢測。受試對象生化指標改變，代表其相應組織或細胞功能狀態(tài)的變化，如轉氨酶測定與肝功能的關系，肌酐和尿素氮水平與腎功能的關系等。實驗研究中須根據研究目的和受試對象不同而選擇相應生化指標進行效應測定。（三）生物物理學指標細胞生物物理學變化（如細胞電泳率、滲透脆性、膜流動性等）能反映細胞生物學特性的變化。（四）免疫學指標免疫學指標是指基于抗原一抗體反應而衍生的一系列檢測指標（如ELISA、放射免疫、ELISPOT試驗等），其特點是特異性及靈敏度高。此外，免疫學指標還包括諸多細胞免疫學檢測指標（如CTL功能檢測等）。（五）生理指標生理指標種類較多，包括體溫、脈搏、呼吸、血壓和肺活量等。檢測生理學指標是揭示人體和動物生理及病理現象的重要手段。根據處理因素作用于受試對象所產生的效應而選擇檢測指標，通常需與研究目的緊密關聯(lián)，僅選一個指標并不能確認相應的受試效應，往往需要不同指標的結合。三、處理與效應處理因素指研究者根據實驗目的施加給受試對象的特定實驗措施實驗效應指處理因素作用于受試對象后所引起的反應，故處理因素和實驗效應間存在一定聯(lián)系，處理因素水平的變化往往引起實驗效應指標的改變。研究者須正確處理處理因素與效應間的關系，才能保證實驗結果的科學合理性。在醫(yī)學科學實驗中，研究者須通過查閱文獻及進行預實驗，以確定處理因素的合理用量。第五節(jié)實驗誤差與控制實驗誤差(error)

即測量值與真實值間存在一定差異。一、誤差的意義及其性質實驗誤差難以避免，若其超過一定限度，所獲測量值與真實值間的差異增大，可造成實驗假象，最終導致錯誤的結論。因此，醫(yī)學研究中須意識到誤差的存在，并采取有效措施控制誤差，避免錯誤結論的產生。誤差的種類1．隨機誤差(randomerror)又稱為偶然誤差(accidentalerror)，是一類由隨機因素所致的誤差。醫(yī)學科研中隨機誤差不可避免，具有隨機、變化、不恒定的性質，即使排除系統(tǒng)誤差后仍然存在，主要表現為抽樣誤差。2．系統(tǒng)誤差(systcmalicerror)又稱可測誤差，指在一定實驗條件下所呈現的一定規(guī)律的誤差，其產生原因通?？芍?。系統(tǒng)誤差屬恒定誤差，具有方向性、系統(tǒng)性、規(guī)律性系統(tǒng)誤差(systcmalicerror)產生原因①儀器、試劑因素，即儀器未作校正或所測指標的數值超出儀器所設定的測量范圍。試劑純度、批號、生產廠家等不同；②方法因素，即所選擇的實驗方法不當或方法本身有缺陷；③條件因素，即進行實驗的條件不同，如實驗室溫度、濕度、通風條件等不同；④人為因素，研究者未按標準操作規(guī)程操作。另外，不同研究者的技術水平、經驗、操作習慣及標準掌握各異，也可能導致誤差的產生。隨機誤差與系統(tǒng)誤差并非截然分開、固定不變，二者在一定條件下可相互轉換。例如，某廠生產的一批sysmexK-4500血液分析儀，若其中一臺儀器所測得的白細胞數值偏低，對于這一批血液分析儀來說，此現象屬隨機誤差；但若研究者使用這臺儀器進行大量樣本血常規(guī)檢測，所獲白細胞數值大部分偏低，這一誤差則屬系統(tǒng)誤差。實驗過程中——若發(fā)現系統(tǒng)誤差大于隨機誤差，應分析誤差產生的原因，予以降低或消除，并采取一定措施預防。若系統(tǒng)誤差很小，可按隨機誤差處理。二、誤差的表現形式誤差常表現——抽樣誤差非均勻性誤差條件誤差順序誤差估計誤差感官誤差過失誤差1．抽樣誤差(samplingerror)

由于受試對象本身存在個體差異，研究時所抽取的樣本僅是總體觀察對象的一小部分，故樣本統(tǒng)計量與總體參數間或各樣本統(tǒng)計量間存在一定差異，這種由于個體差異所致的誤差稱為抽樣誤差。生物間個體差異所引起的誤差有的難以控制，不可避免。即使抽取同齡、同性別的不同個體測量其血糖變化，所得測量值間必然存在一定差異。2．非均勻性誤差(heterogeneityerror)

指由于抽樣不均勻所致的誤差。醫(yī)學研究中，應按照隨機原則對每個觀察對象進行抽樣。若違反此原則，所獲實驗結果即易出現偏差。例如，研究兩種降壓藥物對高血壓病人的治療效果，選取某一時段門診和住院的高血壓患者作為受試對象，若將其任意分配到兩組，其中一組門診患者占多數，而另一組住院患者占多數。由于住院病人病情偏重，可能影響所在組的整體療效，則所獲治療效果很難反映真實療效。3．條件誤差(conditionalerror)

指實驗過程中由于組間或組內不同個體間實驗條件不同而引起的誤差。醫(yī)學實驗過程中除處理因素外，還常受許多非處理因素的影響，如時間、季節(jié)、室內溫度及濕度、儀器設置、操作用具、光照、營養(yǎng)、心理狀態(tài)、飼養(yǎng)動物的條件等。這些因素在組間或組內的不同均可引起條件誤差，若實驗過程中未正確控制、合理消除這些非處理因素的影響，則會導致實驗結果判斷偏差。例如，研究者為觀察不同劑量鏈脲佐菌素(STZ)對SD大鼠糖尿病腎病模型形成的影響，隨機將50只雄性SD大鼠分為5組，1組為對照組，另外4組為實驗組（模型組）；實驗組大鼠腹腔一次性注射不同劑量STZ，對照組未采取任何處理措施，然后檢測不同劑量STZ處理各組動物相應指標的變化，以此判斷STZ對SD大鼠糖尿病腎病模型形成的影響。此實驗中，在制備大鼠模型時僅考慮了給實驗組注射STZ，而忽視STZ系用枸櫞酸緩沖液配制。因此，在對實驗組施加處理因素的同時，應給對照組注射枸櫞酸緩沖液，消除枸櫞酸緩沖液對結果的干擾，由此得出的結論才具科學合理性。4．順序誤差(sequenceerror)

指總是按照固定的順序（時間／次序）進行實驗而引起的誤差。順序誤差易被人們忽視，但在某些情況下它也可對實驗結果造成一定影響。例如，采用刮痧治療A、B、C、D四組不同病的病人，檢測相關生理代謝指標變化。若研究者始終按A、B、C、D的順序，且操作者的手法始終由重到輕，則難以區(qū)分最終結果的差異是因疾病不同所致，還是因順序關系導致手法輕重不同所致。為控制順序誤差，研究者須在實驗時采用隨機方法決定各組順序。5．估計誤差(errorofestimate)

指研究者對實驗結果進行分析和評價時產生的誤差，主要由于研究者心理偏向性或對實驗結果的分析和評價能力不同所致。研究者往往具有使實驗結果與預期結果相符的傾向，故當研究結果和預期結果出現差異時，研究者會在心理上出現偏向性，從主觀上找出很多理由以維護自己期望的結果。另外，由于對實驗結果的分析和評價能力不同造成的估計誤差也普遍存在。6．感官誤差指通過視覺、嗅覺、觸覺和聽覺等感官來判定某項指標時所引起的誤差。例如，用pH試紙比色確定所配制緩沖溶液的pH值時，由于研究者視覺差異而致判斷pH值的大小可能不同。7．過失誤差(grosserror)

指由于研究者失誤所致的誤差。能導致過失誤差的原因很多，例如研究者未通過查閱文獻等方式充分了解實驗的背景，即可能導致實驗設計時主觀片面考慮不周；或由于實驗者進行數據記錄時馬虎大意，也會產生過失誤差。另外，還應區(qū)分實驗誤差和實驗中發(fā)生的錯誤，兩者是不同的。例如，由于儀器故障、操作錯誤等造成的實驗錯誤可通過認真檢查、仔細操作而得到完全控制和消除，但實驗誤差則不可避免，故實驗中應盡量采取有效措施以降低和控制誤差。三、誤差的控制1．嚴格按隨機化原則抽樣和分組

2．合理設置對照3．保持組間均衡

4.交叉的原則

進行實驗時，兩人應交叉進行，如各負責實驗組的一半和對照組的一半，避免由于個人注射技術的差異所致的實驗誤差。5．實驗結果的重復驗證

指通過在相同實驗條件下對同一實驗進行獨立的多次重復，以驗證所得結果的準確性和可重復性。由于實驗中的隨機誤差和系統(tǒng)誤差不可避免，若僅進行一次測量，則結果不能反映真實客觀情況，所產生誤差也較大。隨測量次數增多，有一部分誤差可相互抵消。6.選擇合適的樣本含量

實驗研究中應根據研究目的、檢測指標的性質等對所需的樣本含量進行準確估計。7．實驗方法和操作流程的標準化

實驗過程中，應對實驗涉及的方法和流程進行具體規(guī)定，制定明確標準。嚴格的納入、排除標準；處理因素在整個實驗過程中應保持不變；樣本收集和操作方法、實驗結果的分析和評價等，均應有具體規(guī)定，并在實驗全過程中嚴格遵守，不能自行更改。四、醫(yī)學實驗的質量控制廣義上，質量控制應貫穿于實驗的每一環(huán)節(jié)，包括實驗設計、實施、資料搜集和整理、結論獲得等各階段。狹義上，質量控制主要指對實驗效應測量階段的控制。五、病人的心理導向及臨床科研的質量控制1影響病人心理導向的主要因素：(1)研究者的主觀愿望：研究者在