飼料添加劑 屎腸球菌-編輯說明

1.任務(wù)來源

2014年全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會下達了制訂國家標準《飼料添加劑

屎腸球菌》的任務(wù)（項目編號：20140211-Q-469），由國家糧食局科學研究院提

出，全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口，國家糧食局科學研究院作為承擔單位

主持該標準的制訂工作。

本標準是按照GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)與編

寫規(guī)則》的要求進行編寫的。

2.標準的主要單位和起草人

本標準的起草單位為國家糧食局科學研究院、中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)

研究所。本標準的主要起草人為張曉琳、韓偉、李愛科、魏永剛、李曉敏、趙晨、

黃穎、郝淑紅。

3.標準制訂的必要性和意義

隨著人們生活質(zhì)量的提高以及全球經(jīng)濟一體化，動物性食品安全已成為一個

世界性的挑戰(zhàn)和全球重要的公共衛(wèi)生問題。其中，抗生素殘留問題是影響動物性

食品安全的重要因素之一。基于對抗生素危害性的認識，“安全、綠色、環(huán)?！?/p>

的新型飼用抗生素替代產(chǎn)品已成為飼料行業(yè)的重點發(fā)展方向。微生物飼料添加劑

由于不僅具有與抗生素飼料添加劑相似的有益作用，而且還具有無毒、無副作用、

無殘留、無抗藥性，同時也不污染環(huán)境等優(yōu)點，已逐步發(fā)展成為最具有應用前景

的抗生素替代產(chǎn)品。

屎腸球菌，是人體內(nèi)原著菌群、同樣是飼料工業(yè)中廣泛使用的乳酸菌菌種之

一；其自身的優(yōu)良性能在飼料添加劑中得以體現(xiàn)：大量的動物實驗表明，飼料中

加入屎腸球菌，具有促進動物生長、調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)、抑制有害病原菌生長、

減少疾病發(fā)生、降低仔豬腹瀉率、改善毛色光澤、減少糞臭等優(yōu)良特性。與此同

時，屎腸球菌類產(chǎn)品也存在著其它乳酸菌類似的問題，如菌株的純化與傳代、存

儲過程中抗逆性差、貨架期短、檢測方法不統(tǒng)一，導致產(chǎn)品穩(wěn)定性和益生特性差

異大。屎腸球菌還被認為是典型的條件致病菌，安全評價也是標準需要考慮的。

1

目前，在中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告2045號《飼料添加劑品種目錄（2013）》

中，允許添加的微生物共有34種，包括：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧

雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德式

乳桿菌乳酸亞種（原名：乳酸乳桿菌）、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、

產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、沼澤紅假單胞菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙

歧桿菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、羅伊氏乳桿菌、動物雙歧桿菌、黑曲霉、

米曲霉、遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、纖維二糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳

桿菌保加利亞亞種（原名：保加利亞乳桿菌）、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌、布氏乳桿菌、

副干酪乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌（原名：側(cè)孢芽孢桿菌）。然而，

涉及2045號公告中提及的微生物相關(guān)產(chǎn)品，尤其是單一微生物產(chǎn)品（包括屎腸

球菌），大多數(shù)尚未制訂國家標準。

近幾年，我國微生物飼料添加劑發(fā)展非常迅速，目前已形成年總產(chǎn)值超過

30-50億元的新興產(chǎn)業(yè)。但由于我國的微生物飼料添加劑市場起步較晚，還沒有

對其形成一個完善的管理機制，尤其是尚沒有針對每類具體產(chǎn)品的質(zhì)量標準。當

前國內(nèi)市場也存不規(guī)范之處，例如，從我們在標準研制的5年中采樣結(jié)果來看，

作為主要品質(zhì)檢測指標的有效活菌數(shù)，超過50%的樣品與產(chǎn)品標識不符；符合

產(chǎn)品中經(jīng)常標注“腸球菌”，并沒有明確具體種或?qū)W名。因此，相關(guān)國家標準的

制訂和實施，將促進微生物飼料添加劑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，加強微生物類產(chǎn)

品有效管理，提高動物食品安全水平具有重要意義。

4.確定國家標準主要內(nèi)容的論據(jù)和編制過程

根據(jù)全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會的文件要求及制標任務(wù)通知，國家糧食

局科學研究院隨即下達了關(guān)于啟動制訂國家標準項目的任務(wù)，組織科研攻關(guān)團

隊，并立項實施。

本標準立足于本行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，同時關(guān)注行業(yè)發(fā)展趨勢。首先在對我國歷年

微生物類國標、行標、地方標準及企標匯總分析的基礎(chǔ)上，又參考了ISO、歐盟、

臺灣等的有關(guān)產(chǎn)品和檢測標準，以使制訂的標準能與最先進標準接軌。另外，本

項標準制訂單位分別對山東、上海、河南等代表性廠家生產(chǎn)的屎腸球菌代表性產(chǎn)

品進行采樣，并對主要指標進行檢測及分析，同時我們也統(tǒng)計了相關(guān)質(zhì)量分析數(shù)

2

據(jù)，從有關(guān)文獻及部分飼料廠匯集了一批近年的屎腸球菌產(chǎn)品衛(wèi)生指標及動物應

用效果分析結(jié)果，以使我們制訂的標準具有實用性。在此基礎(chǔ)上形成了《飼料添

加劑屎腸球菌》國家標準征求意見稿。

在編制過程中，我們遵循以下原則：

（1）一致性原則

本標準在編制過程中采用或參考與《微生物飼料添加劑技術(shù)通則》（NY/T

1444-2007）、《Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—Protocolforthe

validationofalternativemethods》（ISO16140）、《食品微生物指標制定和應用

的原則》（GB/T23784-2009）、《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》（GB

4789.35-2010）等標準中就有關(guān)術(shù)語和定義、技術(shù)要求、試驗方法和檢驗原則等

相一致的原則和方法，并參考了大量國標、國外標準、行標及企標中的規(guī)定；以

保證本標準既吸收國內(nèi)外先進經(jīng)驗，又便于采標單位將標準中的要求納入已建立

的質(zhì)量管理體系中來。同時，在充分研究和分析基礎(chǔ)上，綜合考慮我國企業(yè)、市

場、消費者及監(jiān)管機構(gòu)的實際情況，科學、合理地編制本標準的內(nèi)容。

（2）科學實用原則

科學性體現(xiàn)在，系統(tǒng)地分析代表性產(chǎn)品的有效技術(shù)指標，結(jié)合生產(chǎn)應用實際，

凝練問題及產(chǎn)生原因、表現(xiàn)形式、預防措施等，明確產(chǎn)品在試驗方法、檢驗規(guī)則、

判定規(guī)則、包裝、運輸、儲存、保質(zhì)期等方面的要求，為該類產(chǎn)品設(shè)置具有適當

“門檻”或“標桿”。實用性體現(xiàn)在，研制標準過程考慮到產(chǎn)品生產(chǎn)、儲運、流

通、銷售和應用各個環(huán)節(jié)的實際狀況，不同行業(yè)同類技術(shù)成熟程度，消費者心理

預期，標準涉及的檢測成本等，最終體現(xiàn)在本標準的征求意見稿當中。

標準研制過程所處階段和進度如下：

申報階段立項階段起草階段

批準階段審查階段征求意見階段

出版階段復審階段廢止階段

表1標準研制工作-進度表

3

時間區(qū)段工作內(nèi)容備注

2011.8.1-201收集、查閱國內(nèi)外相關(guān)資料、標準信息。部分工作與國

6.1.30標《飼料添加

2012.2.1-201走訪企業(yè)、消費者、相關(guān)專家學者，初步確定重劑屎腸球菌》

5.8.30點指標和研究思路，并重點確定標準采用的新方研制過程同時

法及涉及新儀器，組織實驗。進行。

2011.8.1-201采樣階段，采國內(nèi)外的乳酸菌產(chǎn)品，并抽取國內(nèi)

6.3.30.有代表性的生產(chǎn)企業(yè)的樣品。

2012.2.1-201試驗論證和驗證階段。結(jié)合試驗驗證、數(shù)據(jù)分析

5.11.30和專家意見，逐步確定標準重點考量指標。

2014.7成立工作小組：張曉琳、李愛科、韓偉、趙晨等，

進行具體分工。

2012.11.5-20廣泛征求科研、生產(chǎn)、經(jīng)營、質(zhì)檢及消費者的意

16.6.30見。

2015.6.15-20修改標準文本草稿，形成征求意見稿。

16.3.15

2016.7.15-修改征求意見稿。專家論證會。函審等。

4.1飼料添加劑屎腸球菌-采樣和檢測依據(jù)

根據(jù)農(nóng)業(yè)部批準的獲得（屎腸球菌）飼料添加劑生產(chǎn)許可證的企業(yè)名單聯(lián)系

廠家、或直接購買市場上銷售產(chǎn)品等方式、收集采樣。采集樣品經(jīng)登記、編號、

取/留樣、盲樣跟蹤等步驟后、進行初步篩選，篩選原則為：①信息有追溯性；

②樣品標簽上明確標識“腸球菌”并在實物中確實含有屎腸球菌；③活菌數(shù)量≥

產(chǎn)品標識活菌數(shù)；④市場上有售，并具一定代表性。經(jīng)過樣品的初步檢驗，確定

11個樣品為跟蹤檢測和評價的樣品。

表2（屎腸球菌）飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)名錄

編號廠家

1思科福（北京）生物科技有限公司

2大連三億動物藥品有限公司

3臺灣亞芯公司

4

4滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所

5北京好實沃生物技術(shù)有限公司

6江蘇綠科生物技術(shù)有限公司

7北京中農(nóng)穎泰生物技術(shù)有限公司

8瑞士百福微生物公司

9上海嘉楚生物工程有限公司

10宜春強微生物科技有限公司

11山東省樂陵市集大生物科技有限公司

4.2飼料添加劑屎腸球菌-術(shù)語和定義的編制依據(jù)

主要參考《伯杰細菌鑒定手冊（第八版）》（R.E.布坎南，N.E.吉本斯等）、

《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠、蔡妙英等）相關(guān)屎腸球菌的鑒定部分。

4.3飼料添加劑屎腸球菌-微生物形態(tài)的編制依據(jù)

4.3.1菌體形態(tài)

參考《伯杰細菌鑒定手冊（第八版）》（R.E.布坎南，N.E.吉本斯等）、《乳

酸細菌分類鑒定及實驗方法》（凌代文），并經(jīng)過對屎腸球菌標準菌株和樣品的

革蘭氏染色和顯微觀察，確定屎腸球菌的菌體形態(tài)為：菌體細胞呈卵圓形，直徑

0.6～2.0μm×0.6～2.5μm，多數(shù)成對或成短鏈。無芽孢，無明顯莢膜，通常不運

動。

表3跟蹤檢測和評價的樣品-特征描述

編號形態(tài)革氏染色a芽孢莢膜運動性

1卵圓、短鏈陽性無無無

2卵圓、短鏈陽性無無無

3卵圓、成對陽性無無無

4卵圓、短鏈陽性無無無

5卵圓、短鏈陽性無無無

6卵圓、成對陽性無無無

7卵圓、成對陽性無無無

8卵圓、成對陽性無無無

9卵圓、短鏈陽性無無無

5

10卵圓、成對陽性無無無

11卵圓、短鏈陽性無無無

a:革蘭氏染色部分為生理生化特征，放在標準中4.1.3。

圖1樣品典型顯微形態(tài)

4.3.2菌落形態(tài)

參考數(shù)十篇屎腸球菌文獻及屎腸球菌的特性，選用適合腸球菌選擇性培養(yǎng)

基，即膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂，為國標草案中分離用培養(yǎng)基。跟蹤檢測的樣品在

下述培養(yǎng)基上培養(yǎng)（37℃±2℃，24-48h），菌落形態(tài)均符合典型特征，即帶有

棕紫色環(huán)的黑色或棕黑色菌落，邊緣整齊、表面光滑、圓形。如圖2。

6

圖2樣品典型菌落形態(tài)

4.3.3生理生化特征

主要參考《伯杰細菌鑒定手冊（第八版）》（R.E.布坎南，N.E.吉本斯等），

《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》（凌代文）。凡在膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂斜面

上，于36±1℃,24h～48h培養(yǎng)，刮取菌苔，進行表4中試驗，以驗證屎腸球菌

生理生化特征；包括革蘭氏染色、碲酸鹽、疊氮化鈉等耐受試驗及利用不同碳源

實驗。生理生化試驗的選擇具有鑒別性，例如，疊氮化鈉耐受和七葉苷利用與否，

可區(qū)別多數(shù)常見乳酸菌；0.04%碲酸鹽耐受和丙酮酸發(fā)酵，可區(qū)別屎腸球菌和糞

腸球菌；6.5%NaCl中生長與否，可區(qū)別屎腸球菌和乳酸腸球菌。

表4屎腸球菌生理生化特征

特征結(jié)果特征結(jié)果

革蘭氏染色+碳水化合物反應

6.5%NaCl+麥芽糖+

pH9.6+七葉苷+

0.04%碲酸鹽-丙酮酸-

0.02%疊氮化鈉+L-阿拉伯糖+

注：+為陽性反應；-為陰性反應。

表5跟蹤檢測樣品的生理生化結(jié)果描述

7

麥芽糖七葉苷丙酮酸阿拉伯6.5%pH0.04%0.02%

疊氮化鈉

編號糖NaCl9.6碲酸鹽

1++-+++-+

2++-+++-+

3++-+++-+

4++-+++-+

5++-+++-+

6++-+++-+

7++-+++-+

8++-+++-+

9++-+++-+

10++-+++-+

11++-+++-+

4.4飼料添加劑屎腸球菌-感官特征的編制依據(jù)

目前，市場在售的乳酸菌類飼料添加劑大多為固態(tài)產(chǎn)品，在我們收集的屎腸

球菌樣品中，全部為固態(tài)產(chǎn)品。從溶解性分析，水溶性產(chǎn)品居多，不乏腸溶性產(chǎn)

品。從形態(tài)分析，存在、多層微囊、凍干菌粉、濕法造粒、載體吸附菌粉等，且

粒度在20-100目范圍，顏色都很均一。在標準草案中的表述為：“產(chǎn)品性狀應

符合包裝上標明的產(chǎn)品固有的形狀、色澤、氣味、均勻程度、雜質(zhì)等，無異臭味”。

4.5飼料添加劑屎腸球菌-水分的編制依據(jù)

對收集的所有完整包裝的固態(tài)樣品的水分含量的測定：稱取2.00～10.0g切

碎或磨細的樣品，精密稱量后放入置95～105℃干燥箱中，瓶蓋斜支于瓶邊，干

燥2～4h后，蓋好取出，放入干燥器內(nèi)冷卻0.5h后稱量。然后再放入95～105℃

干燥箱中干燥1h左右，取出，放干燥器內(nèi)冷卻0.5h后再稱量。至前后兩次質(zhì)量

差不超過2mg，即為恒量。結(jié)果表明：所收集的完整包裝的固態(tài)樣品的水分含量

在5.6%-8.0%區(qū)間內(nèi)。另外，隨機挑選1個樣品，調(diào)節(jié)不同水分（6%和12%），

貯存不同時間（3、6、12月），結(jié)果發(fā)現(xiàn)高水分樣品中，隨水分提高和時間延

長，霉菌總量也顯著增加?？紤]到商品加工、流通、儲藏、使用過程中可能帶來

的誤差和水分增加，標準草案中的表述為：“不高于8.0%?！?/p>

8

表6跟蹤檢測樣品水分檢測結(jié)果

編號樣品1/%樣品2/%樣品3/%平均值/%標準差

15.315.305.285.300.02

26.006.006.006.000.00

35.605.605.625.610.01

46.806.826.806.810.01

57.016.826.986.940.10

66.576.576.576.570.00

76.896.806.856.850.05

87.217.207.327.240.07

97.357.357.347.350.01

107.917.907.917.910.01

117.657.607.607.620.03

4.6飼料添加劑屎腸球菌-活菌數(shù)的編制依據(jù)

活菌數(shù)，是益生菌在最重要的功能性指標之一；在FAO/WHO和歐盟對益生

菌的定義中，均強調(diào)“足夠數(shù)量”的必要性。所以說，活菌數(shù)的高低關(guān)系到產(chǎn)品

的質(zhì)量。目前，針對屎腸球菌的活菌數(shù)在ISO標準、國標、行標中尚無強制規(guī)定，

但乳酸菌在食品、保健食品中相關(guān)規(guī)定、及微生物飼料添加劑產(chǎn)品的文獻中數(shù)據(jù)

都值得借鑒。在國標《發(fā)酵乳》（GB19302-2010）、《乳酸菌飲料衛(wèi)生標準》

（16321-2003）、《嬰兒配方食品》（GB10765–2010）、《較大嬰兒和幼兒配

方食品》（GB10767–2010）、《嬰幼兒谷類輔助食品》（GB10769–2012）等均

明確：產(chǎn)品中活性益生菌的活菌數(shù)應≥106CFU/g(ml)。而在大量代表性雜志文獻

中（包括《AnimalScience》、《動物學報》、《動物學雜志》、《動物營養(yǎng)學

報》等），微生物飼料添加劑的有效活菌濃度大多在107-1010范圍內(nèi)。從屎腸球

菌的菌種特征、發(fā)酵規(guī)律、工業(yè)成熟度分析，飼料添加劑從業(yè)者自微生物發(fā)酵、

離心收集、凍干處理或加載體復配、干燥等步驟后，得到大于1.0×1010CFU/g的

菌粉是完全可以達到的。同時，從收集樣品的標識和實際檢驗來看，85%的（乳

酸菌）樣品的初始活菌數(shù)大于1.0×109CFU/g，且使用濃度均要求或建議在1.0

9

×106CFU/g（飼料）以上。所以，考慮到行業(yè)平均加工水平、有效使用濃度、市場

實際情況，并本著促進行業(yè)發(fā)展、對從業(yè)者提高“適當門檻”的原則，標準草案

提出：屎腸球菌活菌數(shù)≥1.0×109CFU/g。

表7跟蹤檢測樣品的標識活菌數(shù)

編號標識活菌數(shù)，CFU/g初檢活菌數(shù)*，CFU/g

1010

11×10≥1×10

9

2≥1×10

1111

31×10≥1×10

46×1011和1×1010≥1×1010

51×1010≥2×1010

61×1010≥4×109

71×1010≥1×1010

81×1011和1×109≥1×1011和≥1×109

10≥1×109

11≥1×109

*：初檢活菌數(shù)為采樣即檢測的結(jié)果。樣品初檢均在產(chǎn)品標識保質(zhì)期的前2月內(nèi)。

4.7飼料添加劑屎腸球菌-衛(wèi)生標準的編制依據(jù)

主要參考《微生物飼料添加劑技術(shù)通則》（NY/T1444-2007）、《飼料微生

物添加劑地衣芽孢桿菌》（NY/T1461-2007）、《飼料添加劑枯草芽孢桿菌》

（2131-2012）中關(guān)于衛(wèi)生標準的相關(guān)規(guī)定。其中，考慮到霉菌及其產(chǎn)生的毒素

可能對人和動物的健康危害，我們認為在標準中應有更嚴格的上限控制；結(jié)合樣

品檢測結(jié)果，標準草案規(guī)定霉菌和酵母總數(shù)的允許量為1.0×104個/kg。標準草案表

述如表8。

在屎腸球菌類產(chǎn)品中混有雜菌是不可避免的。雜菌可能來自環(huán)境、用水、配

料、載體及包裝等，同時雜菌的種類又具有不可預知性，這給雜菌的鑒別及其定

量帶來了極大的難度。按照通常檢測雜菌的辦法：將樣品稀釋到合適濃度，傾注

平板培養(yǎng)，根據(jù)菌落的差異辨別雜菌，并同時定量。由于常用9cm平板空間有

限，勉強分辨菌落形態(tài)、須平板至多長100-300個菌落，所以依靠平板培養(yǎng)方法

的分辨率僅為1%。而嘗試的分子生物學定量方法的精確度和精密度較低。這種

10

情況下，將雜菌率的允許量仍設(shè)為為1.0%。

表8屎腸球菌飼料添加劑衛(wèi)生指標

項目指標

雜菌率，%≤1.0

黃曲霉素B1，g/kg≤10.0

砷的允許量，mg/kg≤2.0

鉛的允許量，mg/kg≤5.0

汞的允許量，mg/kg≤0.1

鎘的允許量，mg/kg≤0.5

大腸菌群的允許量，CFU/100g≤400

霉菌總數(shù)的允許量，CFU/g＜1.0×104

致病菌（志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）不得檢出

如表9和表10所示，所選樣品進行霉菌、大腸菌群、致病菌和重金屬的檢

測，結(jié)果表明有81%以上的樣品在標準草案規(guī)定范圍內(nèi)。

表9跟蹤檢測樣品的霉菌、致病菌的檢測結(jié)果

編霉菌總數(shù)，沙門氏菌,大腸菌群,金黃色葡萄球志賀氏菌,

號CFU/gCFU/gCFU/100g菌,CFU/gCFU/g

3

1≤5.0×10-≤200--

3

2≤7.75×10-≤300--

3

3≤2.5×10-≤150--

2

4≤5.0×10-≤350--

4

5≤2.0×10-≤300--

3

6≤5.0×10-≤350--

4

7≤1.0×10-≤300--

4

8≤1.0×10-≤300--

4

10≤1.5×10-≤300--

4

11≤1.0×10-407--

表10部分樣品的重金屬含量分析

樣品砷，mg/kg鉛，mg/kg鎘，mg/kg汞，mg/kg黃曲霉毒

11

素，μg/kg

10.27未檢出（＜未檢出（＜未檢出（＜未檢出

1）0.01）0.005）（＜0.5）

4未檢出（＜未檢出（＜未檢出（＜未檢出（＜未檢出

0.01）1）0.01）0.005）（＜0.5）

50.022未檢出（＜未檢出（＜未檢出（＜未檢出

1）0.01）0.005）（＜0.5）

81.59未檢出（＜未檢出（＜未檢出（＜未檢出

1）0.01）0.005）（＜0.5）

102.03未檢出（＜未檢出（＜未檢出（＜未檢出

1）0.01）0.005）（＜0.5）

4.8飼料添加劑屎腸球菌-試驗方法的編制依據(jù)

4.8.1抽樣、感官檢驗、水分的編制依據(jù)

抽樣、感官檢驗、水分均有專項國標及其它國標中方法作為依據(jù)。

4.8.2活菌計數(shù)試驗方法的編制依據(jù)

如圖3所示屎腸球菌檢驗結(jié)果流程圖。

12

產(chǎn)品樣品

樣品25g+225ml無菌生理鹽水

10倍系列稀釋

選擇2～3個適宜稀釋度，各以1ml加入平

皿，將45℃～50℃的改良TJA、改良MC

或MRS培養(yǎng)基傾注平板，搖勻培養(yǎng)

36℃±1℃

24h～48h

挑取5～10個菌落

菌體、菌落形態(tài)檢驗

生理生化特征檢驗

菌落計數(shù)

菌種鑒定

報告

圖3所示屎腸球菌檢驗結(jié)果流程圖

主要參考《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》（GB4789.35）、《食品微生物

學檢驗雙歧桿菌檢驗》（GB4789.34）、《飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌》

（NY/T1461-2007）、《飼料添加劑枯草芽孢桿菌》（2131-2012）等標準級方

法，通過定性和定量兩部分完成屎腸球菌的檢測。所以標準草案表述為：

“5.4.2菌種鑒定

5.4.2.1樣品制備

在按照GB/T14699.1進行采樣基礎(chǔ)上，稱取25.0g±0.01g或25.0ml±0.01ml樣品，加入

13

225ml無菌生理鹽水中均質(zhì)，待均勻后，再將樣品用無菌生理鹽水按十倍稀釋法制成不同濃

度稀釋液。取1.0ml合適濃度稀釋液，注入無菌平板，每個稀釋度做3次重復。將融化并冷

卻至45～50℃的腸球菌選擇性培養(yǎng)基，向每個培養(yǎng)皿中倒入約15～20ml，搖勻并凝固，

制成腸球菌瓊脂平板。37℃倒置培養(yǎng)24～48h。需要時對樣品進行延長均質(zhì)時間、研磨、超

聲波等預處理。如果腸溶性固態(tài)樣品具有非水溶性，應根據(jù)實際情況，用合適的腸溶性緩沖

液對樣品進行溶解并均質(zhì)。

5.4.2.2菌體形態(tài)檢驗：挑取菌體，涂片染色，用光學顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

5.4.2.3菌落形態(tài)檢驗：觀察菌落顏色、形態(tài)。

5.4.2.4菌落選擇：用接種針或接種環(huán)隨機挑取5～10個菌落。

5.4.2.5生理生化特征檢驗：接種并進行4.1.3表1中各項試驗。

5.4.3菌落計數(shù)

5.4.3.1按5.4.2.1中所述方法進行傾注平板培養(yǎng)，計數(shù)。

5.4.3.2選取適宜的稀釋度，菌落在30～300之間的平板進行計數(shù)。

5.4.3.3計算方法見公式（1）。

N=∑C/[V(n1+0.1n2)d]……………………（1）

式中：

∑C——兩個連續(xù)稀釋度全部平板上菌落數(shù)總和

V——每個平板上接種的體積，ml

n1——第1個稀釋度的平板數(shù)

n2——第2個稀釋度的平板數(shù)

d——相對第1稀釋度的稀釋因數(shù)

結(jié)果為每克或每毫升產(chǎn)品微生物菌落數(shù)，以科學計數(shù)法表示結(jié)果。

具體結(jié)果輸出實例可參考GB/T4789.2。

5.4.3.4允許差

兩次平行測定結(jié)果的相對偏差不大于2%?！?/p>

4.8.3雜菌允許量試驗方法的編制依據(jù)

因為雜菌來源多樣性和不可預知性，本標準草案重點關(guān)注了幾類菌群：a.致

病菌、霉菌和酵母；草案中均設(shè)定了明確限量，在衛(wèi)生指標中單獨列出；有相應

的國標方法檢測。b.形態(tài)明顯差別菌；通過菌落觀察排除。標準草案表述為：

14

“5.5.1雜菌率檢測

雜菌率=雜菌數(shù)/（屎腸球菌活菌數(shù)+雜菌數(shù)）×100%（2）

4.8.4其它試驗方法的編制依據(jù)

檢測項目所采用的檢測方法如表11。

表11檢測項目及檢測方法一覽表

檢測項目檢測方法

抽樣GB/T14699.1

水分GB6435

黃曲霉毒素B1GB/T17480

砷含量GB/T13079

汞含量GB/T13081

鉛含量GB/T13080

鎘含量GB/T13082

霉菌總數(shù)GB/T4789.15

大腸菌群GB/T4789.3

致病菌GB/T4789.5、GB/T4789.10、

GB/T13091

4.9飼料添加劑屎腸球菌-檢驗規(guī)則的編制依據(jù)

4.9.1出廠檢驗的編制依據(jù)

感官指標、水分、微生物含量（包括活菌數(shù)和雜菌）是出廠最必要的3組數(shù)

據(jù)，因為3項指標是產(chǎn)品表觀區(qū)分和質(zhì)量標準的直接體現(xiàn)。所以標準草案表述為：

“感官指標、水分、微生物含量（包括活菌數(shù)和雜菌）為出廠檢驗項目，由生產(chǎn)

廠或公司的質(zhì)檢部門進行檢驗，檢驗合格并簽發(fā)質(zhì)量合格證的產(chǎn)品方可出廠?！?/p>

4.9.2型式檢驗的編制依據(jù)

參考《微生物飼料添加劑通用要求》（GB/T23181-2008）中功能菌的菌種要

求和安全性要求、組織專家討論會中專家意見、及企業(yè)調(diào)研，草案強調(diào)了菌株的

唯一性、穩(wěn)定性和安全性，對目標菌的分子生物學特征、形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和

生理生化特征、生產(chǎn)情況調(diào)整作出年檢或半年檢驗。另外，在標準草案附錄中增

15

加了模式菌株ATCC19434的16SrRNA基因的全序列。

16SrRNA基因的全序列的檢測，作為目前常用的、成熟的鑒定細菌手段之一，

不存在技術(shù)難度，但沒有放在“菌種鑒定”部分的原因：考慮到不同用戶的檢測

可操作程度，多數(shù)企業(yè)和部分檢測機構(gòu)尚不能獨立完成從DNA提取、PCR、目的

基因轉(zhuǎn)入質(zhì)粒、到測序的全部過程。同時，我們認為，鑒定菌種對于微生物類飼

料添加劑產(chǎn)品的檢測工作非常必要，16SrRNA基因的檢測作為簡單、準確的鑒定

手段之一，在型式檢驗中最易實現(xiàn)。

標準表述為：

“a.菌種遺傳特征檢驗；與《Bergey’sManualofSystematicBacteriology》（《伯杰氏系統(tǒng)

細菌學手冊》）Vol.Ⅱ所列模式菌株ATCC19434或NCTC7171的16SrRNA(16S核

糖體核糖核酸)全序列進行比對，相似度在99%以上。

b.國家質(zhì)量監(jiān)督機構(gòu)要求的其它型式檢驗?！?/p>

“但有下列情況之一時，企業(yè)半年進行一次型式檢驗，下列檢驗項應包括：

a.更改主要原輔材料和關(guān)鍵生產(chǎn)工序；

b.新試制的產(chǎn)品或正常生產(chǎn)的產(chǎn)品停產(chǎn)3個月以上（或半年），重新恢復生產(chǎn)時；

c.國家質(zhì)量監(jiān)督機構(gòu)提出要求進行型式檢驗。”

4.9.3判定規(guī)則的編制依據(jù)

標準草案中涉及檢測指標或參數(shù)，都為強制性要求，所以要求每一項指標合

格才可以形成商品、進入流通環(huán)節(jié)。同時如有某項或某幾項指標檢測不合格，需

要復檢確認。標準草案表述為：“檢驗中有一項指標不符合本標準時，應重新抽

樣，進行復檢，復檢結(jié)果仍有一項指標不符合本標準時，則判定該批產(chǎn)品為不合

格?！?/p>

4.9.4標簽、包裝、運輸、儲存和保質(zhì)期的編制依據(jù)

4.9.4.1標簽、包裝、運輸?shù)木幹埔罁?jù)

參考同類飼料添加劑的國家標準和行業(yè)標準中相關(guān)規(guī)定。值得說明的是：本

標準草案尤其對標簽中應標明產(chǎn)品包含功能性微生物的學名和數(shù)量作出要求，這

是針對市場上一些產(chǎn)品標簽上使用“乳酸菌”或“微生物數(shù)量為××”，嚴重模

糊了種屬區(qū)分，同時增加了檢測難度。標準草案表述為：

“8.1.1采用鮮明的標簽貼于外包裝顯著位置；

8.1.2標簽內(nèi)容應符合GB10648的要求；

16

8.1.3標簽應標明所有添加微生物的學名和數(shù)量?！?/p>

4.9.4.2儲存和保質(zhì)期的編制依據(jù)

根據(jù)我們對屎腸球菌類產(chǎn)品為期一年（或其標明保質(zhì)期）的跟蹤檢測、溫度

梯度儲存試驗，又考慮到乳酸菌自身特性、飼料企業(yè)實際應用情況，我們發(fā)現(xiàn)：

a.所有收集產(chǎn)品中屎腸球菌的活菌數(shù)隨時間延長而降低，冷藏儲存效果顯著好于

常溫儲存，在6月周期內(nèi)常溫儲存的屎腸球菌活菌數(shù)呈數(shù)量級降低（約81%的產(chǎn)

品）；b.飼料生產(chǎn)和應用企業(yè)及消費者幾乎不能滿足長周期冷藏儲存大量飼料添

加劑的條件，且飼料添加劑往往和其它大宗飼料原料混合好銷售，全部冷藏幾乎

不可能。

雖然可能由于菌種與保護工藝限制的原因，多數(shù)采集的乳酸菌類樣品在其貨

架期內(nèi)均出現(xiàn)不同程度的活菌數(shù)減少；但從保證產(chǎn)品的有效性與合理稀釋角度出

發(fā)，產(chǎn)品保質(zhì)期的嚴肅性應該被加以重視，標準草案提出的活菌數(shù)是指，在其保

質(zhì)期內(nèi)不得低于1.0×109CFU/g。所以，（在保證標準草案規(guī)定的屎腸球菌活菌數(shù)

前提下）標準草案表述為“保質(zhì)期為6個月。”但同時，在對儲存的要求中，標

準草案仍提出：“建議使用10℃以下的冷藏條件?！?/p>

表12檢測樣品常溫儲存期內(nèi)活菌變化

接樣檢測活菌3月后活菌數(shù)/存6月后活菌數(shù)/9月后活菌數(shù)/存活12月后活菌數(shù)

數(shù)*活率存活率率存活率

1.0×10105.0×108-3.5×1093.0×107-1.0×1092.1×106-3.0×1087.0×105-5.6×107

*:單位：Log(CFU)/g；

4.10飼料添加劑屎腸球菌-資料性附錄的編制依據(jù)

資料性附錄參考如下：

表16資料性附錄的參考源

資料性附錄名稱參考源

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基GB/T4789.2-2010

生理鹽水GB/T4789.35-2010

革蘭氏染液《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》

發(fā)酵管

模式菌株ATCC19434的16SNCBI數(shù)據(jù)庫資源

17

rRNA基因序列

5．與現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性國家標準的關(guān)系

本標準的制訂可為飼料添加劑屎腸球菌質(zhì)量安全的評價、相關(guān)質(zhì)量標準指

標的制訂和貫徹執(zhí)行提供直觀的指導。

與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性國家標準沒有沖突、矛盾和重復。

18

1.任務(wù)來源

2014年全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會下達了制訂國家標準《飼料添加劑

屎腸球菌》的任務(wù)（項目編號：20140211-Q-469），由國家糧食局科學研究院提

出，全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口，國家糧食局科學研究院作為承擔單位

主持該標準的制訂工作。

本標準是按照GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)與編

寫規(guī)則》的要求進行編寫的。

2.標準的主要單位和起草人

本標準的起草單位為國家糧食局科學研究院、中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)

研究所。本標準的主要起草人為張曉琳、韓偉、李愛科、魏永剛、李曉敏、趙晨、

黃穎、郝淑紅。

3.標準制訂的必要性和意義

隨著人們生活質(zhì)量的提高以及全球經(jīng)濟一體化，動物性食品安全已成為一個

世界性的挑戰(zhàn)和全球重要的公共衛(wèi)生問題。其中，抗生素殘留問題是影響動物性

食品安全的重要因素之一?；趯股匚：π缘恼J識，“安全、綠色、環(huán)?！?/p>

的新型飼用抗生素替代產(chǎn)品已成為飼料行業(yè)的重點發(fā)展方向。微生物飼料添加劑

由于不僅具有與抗生素飼料添加劑相似的有益作用，而且還具有無毒、無副作用、

無殘留、無抗藥性，同時也不污染環(huán)境等優(yōu)點，已逐步發(fā)展成為最具有應用前景

的抗生素替代產(chǎn)品。

屎腸球菌，是人體內(nèi)原著菌群、同樣是飼料工業(yè)中廣泛使用的乳酸菌菌種之

一；其自身的優(yōu)良性能在飼料添加劑中得以體現(xiàn)：大量的動物實驗表明，飼料中

加入屎腸球菌，具有促進動物生長、調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)、抑制有害病原菌生長、

減少疾病發(fā)生、降低仔豬腹瀉率、改善毛色光澤、減少糞臭等優(yōu)良特性。與此同

時，屎腸球菌類產(chǎn)品也存在著其它乳酸菌類似的問題，如菌株的純化與傳代、存

儲過程中抗逆性差、貨架期短、檢測方法不統(tǒng)一，導致產(chǎn)品穩(wěn)定性和益生特性差

異大。屎腸球菌還被認為是典型的條件致病菌，安全評價也是標準需要考慮的。

1

目前，在中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告2045號《飼料添加劑品種目錄（2013）》

中，允許添加的微生物共有34種，包括：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧

雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德式

乳桿菌乳酸亞種（原名：乳酸乳桿菌）、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、

產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、沼澤紅假單胞菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙

歧桿菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、羅伊氏乳桿菌、動物雙歧桿菌、黑曲霉、

米曲霉、遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、纖維二糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳

桿菌保加利亞亞種（原名：保加利亞乳桿菌）、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌、布氏乳桿菌、

副干酪乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌（原名：側(cè)孢芽孢桿菌）。然而，

涉及2045號公告中提及的微生物相關(guān)產(chǎn)品，尤其是單一微生物產(chǎn)品（包括屎腸

球菌），大多數(shù)尚未制訂國家標準。

近幾年，我國微生物飼料添加劑發(fā)展非常迅速，目前已形成年總產(chǎn)值超過

30-50億元的新興產(chǎn)業(yè)。但由于我國的微生物飼料添加劑市場起步較晚，還沒有

對其形成一個完善的管理機制，尤其是尚沒有針對每類具體產(chǎn)品的質(zhì)量標準。當

前國內(nèi)市場也存不規(guī)范之處，例如，從我們在標準研制的5年中采樣結(jié)果來看，

作為主要品質(zhì)檢測指標的有效活菌數(shù)，超過50%的樣品與產(chǎn)品標識不符；符合

產(chǎn)品中經(jīng)常標注“腸球菌”，并沒有明確具體種或?qū)W名。因此，相關(guān)國家標準的

制訂和實施，將促進微生物飼料添加劑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，加強微生物類產(chǎn)

品有效管理，提高動物食品安全水平具有重要意義。

4.確定國家標準主要內(nèi)容的論據(jù)和編制過程

根據(jù)全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會的文件要求及制標任務(wù)通知，國家糧食

局科學研究院隨即下達了關(guān)于啟動制訂國家標準項目的任務(wù)，組織科研攻關(guān)團

隊，并立項實施。

本標準立足于本行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，同時關(guān)注行業(yè)發(fā)展趨勢。首先在對我國歷年

微生物類國標、行標、地方標準及企標匯總分析的基礎(chǔ)上，又參考了ISO、歐盟、

臺灣等的有關(guān)產(chǎn)品和檢測標準，以使制訂的標準能與最先進標準接軌。另外，本

項標準制訂單位分別對山東、上海、河南等代表性廠家生產(chǎn)的屎腸球菌代表性產(chǎn)

品進行采樣，并對主要指標進行檢測及分析，同時我們也統(tǒng)計了相關(guān)質(zhì)量分析數(shù)

2

據(jù)，從有關(guān)文獻及部分飼料廠匯集了一批近年的屎腸球菌產(chǎn)品衛(wèi)生指標及動物應

用效果分析結(jié)果，以使我們制訂的標準具有實用性。在此基礎(chǔ)上形成了《飼料添

加劑屎腸球菌》國家標準征求意見稿。

在編制過程中，我們遵循以下原則：

（1）一致性原則

本標準在編制過程中采用或參考與《微生物飼料添加劑技術(shù)通則》（NY/T

1444-2007）、《Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—Protocolforthe

validationofalternativemethods》（ISO16140）、《食品微生物指標制定和應用

的原則》（GB/T23784-2009）、《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》（GB

4789.35-2010）等標準中就有關(guān)術(shù)語和定義、技術(shù)要求、試驗方法和檢驗原則等

相一致的原則和方法，并參考了大量國標、國外標準、行標及企標中的規(guī)定；以

保證本標準既吸收國內(nèi)外先進經(jīng)驗，又便于采標單位將標準中的要求納入已建立

的質(zhì)量管理體系中來。同時，在充分研究和分析基礎(chǔ)上，綜合考慮我國企業(yè)、市

場、消費者及監(jiān)管機構(gòu)的實際情況，科學、合理地編制本標準的內(nèi)容。

（2）科學實用原則

科學性體現(xiàn)在，系統(tǒng)地分析代表性產(chǎn)品的有效技術(shù)指標，結(jié)合生產(chǎn)應用實際，

凝練問題及產(chǎn)生原因、表現(xiàn)形式、預防措施等，明確產(chǎn)品在試驗方法、檢驗規(guī)則、

判定規(guī)則、包裝、運輸、儲存、保質(zhì)期等方面的要求，為該類產(chǎn)品設(shè)置具有適當

“門檻”或“標桿”。實用性體現(xiàn)在，研制標準過程考慮到產(chǎn)品生產(chǎn)、儲運、流

通、銷售和應用各個環(huán)節(jié)的實際狀況，不同行業(yè)同類技術(shù)成熟程度，消費者心理

預期，標準涉及的檢測成本等，最終體現(xiàn)在本標準的征求意見稿當中。

標準研制過程所處階段和進度如下：

申報階段立項階段起草階段

批準階段審查階段征求意見階段

出版階段復審階段廢止階段

表1標準研制工作-進度表

3

時間區(qū)段工作內(nèi)容備注

2011.8.1-201收集、查閱國內(nèi)外相關(guān)資料、標準信息。部分工作與國

6.1.30標《飼料添加

2012.2.1-201走訪企業(yè)、消費者、相關(guān)專家學者，初步確定重劑屎腸球菌》

5.8.30點指標和研究思路，并重點確定標準采用的新方研制過程同時

法及涉及新儀器，組織實驗。進行。

2011.8.1-201采樣階段，采國內(nèi)外的乳酸菌產(chǎn)品，并抽取國內(nèi)

6.3.30.有代表性的生產(chǎn)企業(yè)的樣品。

2012.2.1-201試驗論證和驗證階段。結(jié)合試驗驗證、數(shù)據(jù)分析

5.11.30和專家意見，逐步確定標準重點考量指標。

2014.7成立工作小組：張曉琳、李愛科、韓偉、趙晨等，

進行具體分工。

2012.11.5-20廣泛征求科研、生產(chǎn)、經(jīng)營、質(zhì)檢及消費者的意

16.6.30見。

2015.6.15-20修改標準文本草稿，形成征求意見稿。

16.3.15

2016.7.15-修改征求意見稿。專家論證會。函審等。

4.1飼料添加劑屎腸球菌-采樣和檢測依據(jù)

根據(jù)農(nóng)業(yè)部批準的獲得（屎腸球菌）飼料添加劑生產(chǎn)許可證的企業(yè)名單聯(lián)系

廠家、或直接購買市場上銷售產(chǎn)品等方式、收集采樣。采集樣品經(jīng)登記、編號、

取/留樣、盲樣跟蹤等步驟后、進行初步篩選，篩選原則為：①信息有追溯性；

②樣品標簽上明確標識“腸球菌”并在實物中確實含有屎腸球菌；③活菌數(shù)量≥

產(chǎn)品標識活菌數(shù)；④市場上有售，并具一定代表性。經(jīng)過樣品的初步檢驗，確定

11個樣品為跟蹤檢測和評價的樣品。

表2（屎腸球菌）飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)名錄

編號廠家

1思科福（北京）生物科技有限公司

2大連三億動物藥品有限公司

3臺灣亞芯公司

4

4滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所

5北京好實沃生物技術(shù)有限公司

6江蘇綠科生物技術(shù)有限公司

7北京中農(nóng)穎泰生物技術(shù)有限公司

8瑞士百福微生物公司

9上海嘉楚生物工程有限公司

10宜春強微生物科技有限公司

11山東省樂陵市集大生物科技有限公司

4.2飼料添加劑屎腸球菌-術(shù)語和定義的編制依據(jù)

主要參考《伯杰細菌鑒定手冊（第八版）》（R.E.布坎南，N.E.吉本斯等）、

《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠、蔡妙英等）相關(guān)屎腸球菌的鑒定部分。

4.3飼料添加劑屎腸球菌-微生物形態(tài)的編制依據(jù)

4.3.1菌體形態(tài)

參考《伯杰細菌鑒定手冊（第八版）》（R.E.布坎南，N.E.吉本斯等）、《乳

酸細菌分類鑒定及實驗方法》（凌代文），并經(jīng)過對屎腸球菌標準菌株和樣品的

革蘭氏染色和顯微觀察，確定屎腸球菌的菌體形態(tài)為：菌體細胞呈卵圓形，直徑

0.6～2.0μm×0.6～2.5μm，多數(shù)成對或成短鏈。無芽孢，無明顯莢膜，通常不運

動。

表3跟蹤檢測和評價的樣品-特征描述

編號形態(tài)革氏染色a芽孢莢膜運動性

1卵圓、短鏈陽性無無無

2卵圓、短鏈陽性無無無

3卵圓、成對陽性無無無

4卵圓、短鏈陽性無無無

5卵圓、短鏈陽性無無無

6卵圓、成對陽性無無無

7卵圓、成對陽性無無無

8卵圓、成對陽性無無無

9卵圓、短鏈陽性無無無

5

10卵圓、成對陽性無無無

11卵圓、短鏈陽性無