植物組織培養(yǎng)校本教材123

⑧高壓鍋在工作過程中，應有專人看守，如發(fā)現(xiàn)異常情況，應及時采取措施，以免發(fā)生安全事故。）為使培養(yǎng)基滅菌更加安全可靠，可采用操作方便的智能型蒸汽滅菌鍋，只需按要求設定所需滅菌的時間和溫度，就能自動完成整個滅菌程序。除了培養(yǎng)基外，外植體消毒處理所需的無菌水、玻璃器皿和接種器械也可采用高壓蒸汽滅菌，但滅絕時間比培養(yǎng)基稍長些。3.4外植體的選擇與消毒3.4.1外植體的選擇外植體的概念在植物組織培養(yǎng)中，用來進行培養(yǎng)的植物材料稱外植體（explant）。一般指初次接種，即在初代培養(yǎng)中用來接種的植物材料，包括各種植物器官、組織和細胞。將外植體經(jīng)過處理后接種到培養(yǎng)基上是植物組織培養(yǎng)的第一步，這一環(huán)節(jié)被稱初代培養(yǎng)。外植體的選擇外植體的選擇是進行組織培養(yǎng)建立無菌體系以及植株再生關鍵一步。盡管所有的植物細胞都具有全能性，即重新形成植株的能力，也就是植物的任何器官在理論上都可以用作外植體。但不是任何細胞都能表現(xiàn)出來，所以，接種時要選擇那些在培養(yǎng)時易起反應，容易進行再分化產(chǎn)生植株的部位作實驗材料。實際上，在同一植物的各個不同部位的組織，器官中，其形態(tài)發(fā)生的能力，可因植物的年齡、季節(jié)及生理狀態(tài)而有很大不同。這會影響到繁殖效果以及成本。因此，在決定選用一個合適的培養(yǎng)材料時應考慮到：1）植物的種類及品種的選擇：應考慮選擇具有良好表型的植物，如抗逆性強、產(chǎn)量高、產(chǎn)品質量高等植株，為育種選擇的外植體應選擇表型最優(yōu)的材料。理論上任何一種植物都能進行組織培養(yǎng)，實際上物種間、品種間或類型間差異很大。一般的選易于離體培養(yǎng)的種類、品種或類型；選生產(chǎn)上或研究意義比較大的種類、品種或類型。2）外植體的增殖能力：外植體必須有良好的增殖能力，并且應在培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選增殖能力最強的材料，同時需要考慮通過試驗篩選繁殖不同基因型植物所需要的特殊培養(yǎng)基。3）外植體的大小選擇：培養(yǎng)效果是一個外植體細胞總體對各種培養(yǎng)因子的綜合反應，因此外植體的表面積、體積、細胞數(shù)量等都會影響培養(yǎng)效果。一般選擇的外棋體大小可以在0.5～1cm。外植體太大容易污染，過小不容易啟動或啟動后僅僅產(chǎn)生愈傷組織或容易褐化死亡。在以植物脫素為培養(yǎng)目的時，應選用較小的外植體，一般在0.2～0.5cm。如果選擇的外植體過大，則達不到脫素的目的。對于莖尖、胚、胚乳等培養(yǎng)，則以器官或組織為單位切離即可。4）取外植體的季節(jié)和時間：選取外植體的季節(jié)和時間，對培養(yǎng)材料的啟動和培養(yǎng)至關重要。特別是進行離體培養(yǎng)快速繁殖時，顯得尤為突出。一般處于生長季，較幼嫩的外植體培養(yǎng)容易。春夏季取材滅菌容易，秋冬季取材難以存活，雨季濕熱季節(jié)取材不容易成功。3.4.2外植體滅菌作為植物組織培養(yǎng)中的外植體材料有葉、莖、器官、吸芽等，滅菌過程要求既能有效的殺死微生物，又不損失植物組織。操作步驟如下：1）將采來的植物材料去除不需要的部分。2）將外植體置于流水下沖洗數(shù)小時，必要時需在洗衣粉溶液中浸泡清洗。3）將清洗后的外植體用無菌水沖洗數(shù)次，置于70%的酒精中浸泡15-30秒。4）將浸泡過的外植體置于升汞（次氯酸鈉、漂白粉）中浸泡5-10分鐘，然后用無菌水清洗干凈，以防止消毒劑對外植體的傷害。藥用及花卉植物外植體常用消毒劑及效果，見表3-2.表3-2藥用植物外植體常用消毒劑及效果消毒劑使用濃度%消毒時間min去除難易效果升汞0.1-0.25-8易最好次氯酸鈉2-55-30易很好漂白粉9-105-30較難很好過氧化氫10-125-15中好硝酸銀15-30中好抗生素4-50mg/L30-60中較好3.4.3外植體的接種外植體的接種是把經(jīng)過表面消毒后的植物材料切割或分離出器官、組織、細胞，轉移到培養(yǎng)基上的過程。整個接種均需在無菌條件下進行操作，一切用具、材料、培養(yǎng)基、接種環(huán)境等都要無菌。接種前準備接種前30min應對接種室和超凈工作臺消毒，操作人員也應洗手，消毒并穿上工作服。組織培養(yǎng)中污染的主要來源是空氣中的細菌和真菌孢子，因此每次接種前均應進行地面清潔和環(huán)境消素，用70％酒精噴霧使空氣中的細菌和真菌孢子，隨灰塵的降落而沉降，并用紫外線燈照射20min。接種前超凈工作臺面要用新潔爾滅或70％的酒精擦拭。培養(yǎng)皿、酒精燈和其它工具也應預先放在超凈工作臺上，一起用紫外燈照射。由于工作人員的頭發(fā)、衣服、手指都不同程度地帶有雜菌，因此在接種時要穿上工作服，戴上帽子，也必須修剪指甲，并用肥皂洗手，最好在新潔爾滅溶液中浸泡10min，接種操作前則用70％酒精擦拭。工作人員呼吸也會產(chǎn)生污染，特別是在接種時談話或咳嗽更易引起污染，因此，在操作時應禁止談話并應戴上口罩。外植體接種切取外植體材料時，較大的材料用肉眼觀察即可操作分離，較小的材料需要在雙筒實體顯微鏡下放大操作。分離工具一定要預先放好，工具要鋒利，切割動作要穩(wěn)且快，防止擠壓，以免材料受損傷而導致培養(yǎng)失敗。材料的分割應在無菌培養(yǎng)皿中進行，為避免接種時發(fā)生交叉污染，通常在無菌濾紙上切取材料。刀和鑷子、剪刀等接種工具在每次使用之前，均應在酒精燈火焰上反復灼燒，但應放涼后再接種，以防燙傷外植體。也可先放入70％酒精中浸泡，再在酒精燈火焰上灼燒。

外植體接種的具體操作如下：左手持培養(yǎng)容器（三角瓶、試管、果醬瓶等），右手輕輕取下封口紙或擰開瓶蓋，將容器口靠近酒精燈火焰，瓶口略傾斜，以防空氣中微生物落入瓶中造成污染，將容器口外部在火焰上灼燒數(shù)秒，以將灰塵雜質等固定在瓶口處。用滅過菌的鑷子夾取切割好的外植體送入容器中并置于培養(yǎng)基上，這一過程要輕緩，并避免外植體材料碰到容器口和容器壁。

外植體在培養(yǎng)容器內(nèi)要分布均勻，一方面保證培養(yǎng)基養(yǎng)分供應均勻，同時也保證出芽后小植株不會相互遮光。莖尖、莖段等外植體基部應插入培養(yǎng)基，但不宜過深，不能使芽陷入培養(yǎng)基中。葉片一般將葉背接觸培養(yǎng)基，因為中背氣孔較多，更容易吸收水分和養(yǎng)分。接種后，應及時封口或擰好瓶蓋，以防空氣中微生物落入瓶中。所有材料接好后，應做好標記，注明植物品種或品種代號、處理名稱、接種日期及接種人，然后統(tǒng)一放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。3.5材料的培養(yǎng)3.5.1培養(yǎng)方法1）固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)是用瓊脂固化的培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。這是現(xiàn)在最常用的方法。該方法設備簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐變中毒現(xiàn)象發(fā)生。2)液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)是用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。如細胞懸浮培養(yǎng)、原生質體培養(yǎng)等。液體培養(yǎng)需要通過攪動或振動培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，常采用往復式搖床或旋轉式搖床進行培養(yǎng)，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。3.5.2培養(yǎng)條件接種后的外植體應轉移到培養(yǎng)室進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件要根據(jù)植物對環(huán)境條件的不同需求進行調(diào)控。培養(yǎng)室控制的條件主要有溫度、光照、濕度和氣體。1）溫度溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素，在適宜的溫度下植物才能良好地生長、分化。多數(shù)植物適宜生長溫度為20-30℃，低于15℃時生長停止，高于35℃時會抑制正常生長和發(fā)育。2）光照光是植物進行光合作用必不可少的條件之一，對離體培養(yǎng)物的生長發(fā)育具有重要的作用。光照的影響主要表現(xiàn)在光照強度、光照時間和光質三個方面：（1）光照強度對大多數(shù)植物來說，1000-4000lx的光強就能滿足其生長的需要。器官的分化需要光照，并隨著試管苗的生長光照強度需要不斷的加強，才能使小苗生長健壯，并促進它從“異養(yǎng)”向“自養(yǎng)”轉化，以提高移栽后的成活率。而對愈傷組織的誘導來說，暗培養(yǎng)比光培養(yǎng)更合適，所以在前期可以適當?shù)膶庹者M行控制，以提高分化生長。（2）光照時間普通培養(yǎng)室要求每日光照12-16h，生產(chǎn)中，在不影響材料正常生長的情況下，盡量縮短光照時間，以減少能源消耗，降低生產(chǎn)成本。（3）光質光質對細胞分裂和器官分化有很大的影響，但目前尚無規(guī)律可循，可根據(jù)植物在生長中的具體現(xiàn)象加以調(diào)整和改善，以達到節(jié)約能源，提高產(chǎn)量的目的。3）濕度組織培養(yǎng)中濕度的影響主要有培養(yǎng)容器內(nèi)濕度和培養(yǎng)環(huán)境濕度兩方面。（1）培養(yǎng)容器內(nèi)濕度容器內(nèi)濕度通?？杀３衷?00%，之后隨著時間的推移，相對濕度也會相應下降，容器內(nèi)的濕度主要受瓊脂含量和封口材料的影響，在冬季應適當減少瓊脂用量，否則培養(yǎng)基干硬，不利于外植體接觸或插進培養(yǎng)基中，導致生長發(fā)育受阻。（2）培養(yǎng)室環(huán)境的濕度環(huán)境濕度變化隨季節(jié)和大氣而有很大的變動。濕度過高或過低對植物材料的生長都不利，過低會造成培養(yǎng)基失水干枯，影響培養(yǎng)物的分化合生在；過高會造成雜菌滋生，導致污染。通常培養(yǎng)室的濕度要保持在70%-80%。4）氣體環(huán)境植物組織培養(yǎng)中，植物的呼吸需要氧氣。在液體培養(yǎng)基中，需進行振蕩和旋轉以解決氧氣供應。在固體培養(yǎng)基中，接種時不要把培養(yǎng)物全部埋入培養(yǎng)基中，以避免氧氣不足。另外切割外植體后產(chǎn)生的乙烯和培養(yǎng)物產(chǎn)生的二氧化碳也會阻礙培養(yǎng)物的生長和分化。因此培養(yǎng)室要定期進行通風換氣，每次通風后要進行消毒以防止污染。3.5.3初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)是指接種外植體后最初的幾代培養(yǎng)，其目的是獲得無菌此材料和無性繁殖系。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。1）培養(yǎng)基的選擇初代培養(yǎng)基時常采用誘導或分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的生長素和細胞分裂素的配比和濃度最為重要，誘導不定芽時需要較高的細胞分裂素；誘導愈傷組織形成時，增加生長素的濃度并補充一定的細胞分裂素是十分必要的。2）外植體的生長和分化（1）頂芽和腋芽發(fā)育這種發(fā)育方式的特點是不經(jīng)過逾傷組織階段而直接再生繁殖。發(fā)育方式：莖尖、側芽、節(jié)等外植體→直接再生叢生芽→幼莖→生根→小植株（2）不定芽發(fā)育：經(jīng)過逾傷組織階段誘導產(chǎn)生小植株由不定芽產(chǎn)生的組織培養(yǎng)苗，比直接從頂芽或腋芽中產(chǎn)生的叢生芽苗，具有更大的性狀變異幾率。發(fā)育方式：根、莖、葉等外植體→逾傷組織→生長點→幼莖→生根→小植株（3）胚狀體發(fā)育：由植物的體細胞，經(jīng)過誘導產(chǎn)生的體細胞胚，其功能類似合子胚，但與合子胚不同。優(yōu)點是成苗數(shù)量多，速度快，結構完整。（4）原球莖發(fā)育：由莖尖或側芽的培養(yǎng)中產(chǎn)生原球莖并增殖、萌發(fā)出小植株。石斛屬的植物是常見的原球莖發(fā)育植物，其種子、莖段、莖尖、葉片、幼根都可以作為外植體誘導原球莖產(chǎn)生，但外植體的選取部位對誘導會產(chǎn)生一定的影響，如鐵皮石斛，基部莖段的增殖系數(shù)比上部莖段的增殖系數(shù)高，生長速度快。3.5.4繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)的目的植物在培養(yǎng)過程中，如長期在同一培養(yǎng)基上培養(yǎng)，會出現(xiàn)以下情況：1）培養(yǎng)基中成分不斷被消耗，無法滿足繼續(xù)生長的需要；2）試管苗生長旺盛，容器大小開始限制植物生長；3）培養(yǎng)過程中植物材料所分泌的有毒有害物質，積累過多對植物組織產(chǎn)生傷害。4）長期不轉接會產(chǎn)生污染。因此，當容器中植物材料持續(xù)培養(yǎng)一段時間后，必須轉接進行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)又稱增殖培養(yǎng)是指愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，營養(yǎng)物枯竭，水分散失，并已經(jīng)積累了一些代謝產(chǎn)物，此時需要將這些組織轉移到新的培養(yǎng)基上。繼代培養(yǎng)可采用無菌苗進行繼代，也可利用逾傷組織進行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)的方法繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁殖培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當數(shù)量的無根苗，最后能達到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程。如果以2株苗為基礎，那么經(jīng)10代將生成210株苗。

繼代培養(yǎng)中擴繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。1）切割莖段常用于有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡便易行，能保持母種特性。培養(yǎng)基常是MS基本培養(yǎng)基；2）分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培養(yǎng)基常是分化培養(yǎng)基。若芽叢的芽較小。可先切成芽叢小塊，放入MS培養(yǎng)基中，待到稍大時，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)。3）分離原球莖將原球莖切割成小塊，也可以給予針刺等損傷，或在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，來加快其增殖進程。4）胚狀體增殖

增殖使用的培養(yǎng)基對于一種植物來說每次幾乎完全相同，由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競爭，所以能夠按幾何級數(shù)增殖。

在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進行過程。但在達到相當數(shù)量之后，則應考慮使其中一部分轉入生根階段。從某種意義上講，增殖只是儲備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。繼代培養(yǎng)的影響因素（1）植物材料不同種類的植物，同種植物不同品種，同一植物不同器官和不同部位，繼代紡織能力也各不相同。一般是草本>木本；被子植物>裸子植物；年幼材料>老年材料；剛分離組織>已繼代的組織；胚>營養(yǎng)組織；芽>胚狀體>愈傷組織。在以腋芽或不定芽增殖繼代的植物中，在培養(yǎng)許多代之后仍然保持著旺盛的增殖能力，一般較少出現(xiàn)再生能力喪失。（2）培養(yǎng)基在規(guī)模化生產(chǎn)中，培養(yǎng)的植物品種一般比較多，而且來源也比較復雜，品種間的差異表現(xiàn)非常明顯。在培養(yǎng)基的配制和使用上，一定要多樣化，否則會造成一些品種因為生長調(diào)節(jié)劑過高或過低而嚴重影響繁殖和生長。另外，在同一品種上，適當調(diào)整培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的濃度也是非常重要的，其目的的主要是為了保證種苗的質量，同時又可以維持一定的繁殖基數(shù)。一些植物經(jīng)長期繼代培養(yǎng)，在開始繼代培養(yǎng)中需要加入生長調(diào)節(jié)劑，經(jīng)過幾次繼代后，加入少量或不加生長調(diào)節(jié)劑也可以生長。如在胡蘿卜搏壁組織初代培養(yǎng)中加入10-6mol/LIAA才能達到最大生長量，但在繼代培養(yǎng)10代以后，不加IAA的培養(yǎng)基上也可達到同樣生長量。在蘭科植物原球莖繼代培養(yǎng)中情況也相同。（3）培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度應大致與該植物原產(chǎn)地生長所需的最適溫度相似。喜歡冷涼的植物，以20℃左右較好，熱帶作物需在30℃左右的條件下才能獲得較好的生長。如香石竹在18-25℃隨溫度降低生長速度減慢，但苗的質量顯著提高，玻璃化現(xiàn)象減少，高于25℃時，引起苗徒長細弱，玻璃化或半玻璃化苗明顯增加。另在桉樹繼代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，如果總在23-25℃條件下培養(yǎng)，芽就會逐漸死亡，但如果每次繼代培養(yǎng)時，先在15℃下培養(yǎng)3d，再轉至25℃下培養(yǎng)，生長良好。（4）繼代周期對一些生長速度快或者繁殖系數(shù)高的種類如滿天星、非洲紫羅蘭等，繼代時間比較短，一般不超過15d。對生長速度比較慢的種類如非洲菊、紅掌等，繼代時間就要長一些；30-40d繼代1次。繼代時間也不是一成不變的，要根據(jù)培養(yǎng)目的、環(huán)境條件及所使用的培養(yǎng)基配方進行考慮。在前期擴繁階段，為了加快繁殖速度，當苗剛分化時就切割繼代，而無需待苗長到很大時才進行繼代。后期在保持一定繁殖基數(shù)的前提下，進行定量生產(chǎn)時，為了有更多的大苗可以用來生根，可以間隔較長的時間繼代，達到既可以維持一定的繁殖量，又可以提高組培苗質量的目的。（5）繼代次數(shù)繼代次數(shù)對繁殖率的影響因培養(yǎng)材料而異。有些植物如葡萄、黑穗醋栗、月季和倒掛金鐘等，長期繼代可保持原來的再生能力和增殖率。有些植物則隨繼代次數(shù)而增加變異頻率，如繼代5次的香蕉不定芽變異頻率為2.14%，繼代10次后為4.2%，因此香蕉組培苗繼代培養(yǎng)不能超過1年。還有一些植物長期繼代培養(yǎng)，會逐漸衰退，喪失形態(tài)發(fā)生能力。具體表現(xiàn)為生長不良，再生能力和增殖率下降等。3.5.4生根培養(yǎng)在試管苗增殖到一定數(shù)量后，就要使部分苗分流進入壯苗與生根階段。若不能將培養(yǎng)物大量轉移到生根培養(yǎng)基上，一方面就會使久不轉移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁擠而致使無效苗增多，最后被迫淘汰許多材料；另一方面，試管苗是在無菌、有營養(yǎng)供給、適宜光照、溫度和幾乎100%相對濕度的環(huán)境中生長的，一旦出瓶，移栽環(huán)境發(fā)生了劇烈的變化而不利于其生長；同時由于試管苗幼嫩，環(huán)境中的雜菌極易侵染，導致試管苗死亡。為了適應移栽后的較低的濕度以及較高的光強，完成試管苗從“異養(yǎng)”到“自養(yǎng)”的轉變，需要有一個適應過程。壯苗培養(yǎng)在繼代培養(yǎng)過程中，細胞分裂素濃度的增加有助于增殖系數(shù)的提高。但伴隨著增殖系數(shù)的提高，增殖的芽往往出現(xiàn)生長勢減弱，不定芽短小、細弱，無法進行生根培養(yǎng)的現(xiàn)象；即使能夠生根，移栽成活率也不高，必須經(jīng)過壯苗培養(yǎng)。壯苗培養(yǎng)時，可將生長較好的芽分成單株培養(yǎng)，而將一些尚未成型的芽分成幾個芽叢培養(yǎng)。通過選擇適宜的細胞分裂素和生長素的種類及不同濃度配比，可以同時滿足增殖和壯苗的不同要求。如在杜鵑快繁的研究中發(fā)現(xiàn)，ZT/IAA或ZT/IBA的比值升高，芽的繁殖系數(shù)也隨之增加，但壯苗效果卻降低。高濃度的生長素和低濃度的細胞分裂素的組合有利于形成壯苗。因此，在以叢生芽方式進行增殖時，適當降低培養(yǎng)基中BA等細胞分裂素的濃度，并增加NAA等生長素的濃度，就能達到壯苗培養(yǎng)的目的。在實際生產(chǎn)中，我們一般用較低濃度的細胞分裂素與生長素組成合理的比列，將有效增殖系數(shù)控制在3.0-5.0，以實現(xiàn)增殖和壯苗的雙重目的。生根培養(yǎng)（1）試管內(nèi)生根試管內(nèi)生根是將成叢的試管苗分離成單苗，轉接到生根培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)容器內(nèi)誘導生根的方法。試管苗生根的優(yōu)劣主要體現(xiàn)在根系質量（粗度、長度）和根系數(shù)量（條數(shù)）吸收方面。不僅要求不定根比較粗壯，更重要的是要有較多的毛細根，以擴大根系的吸收面積，增強根系的吸收能力，提高移栽成活率。根系的長度不宜太長，在粗而少與細而多之間，可能以后者較好。在生根階段對培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件可進行調(diào)整，減少試管苗對異養(yǎng)條件的依賴，逐步增強光合作用的能力。對于大多數(shù)物種來說，誘導生根需要有適當?shù)纳L素，其中最常用的是NAA和IBA，濃度一般為0.1-10.0mg/L。但唐菖蒲、水仙和草莓等組培苗很容易在無生長素的培養(yǎng)基上生根。一般情況下礦質元素濃度較高時有利于莖、葉生長，較低時有利于生根。生根培養(yǎng)基中無機鹽和蔗糖濃度減少一半，光照強度由原來的500-1000lx提高到1000-5000lx，能刺激小植株自身進行光合作用制造有機物，以便由異養(yǎng)型向自養(yǎng)型過渡。在這種條件下，植物能較好的生根，對水分脅迫和疾病的抗性也會有所增強，植株可能表現(xiàn)出生長遲緩和較輕微的失綠，但生產(chǎn)實踐證明，這樣的幼苗，要比在低光強條件下的較綠較高的幼苗移栽成活率高。生根階段采用自然光照比燈光照明所形成的試管苗更能適應外界環(huán)境條件。培養(yǎng)基中添加活性炭有利于提高生根苗質量。在櫻花生根培養(yǎng)基中加入0.1%-0.2%活性炭后，試管苗不僅生長健壯，無愈傷組織，而且根系較長、白色、有韌性，移栽后新根發(fā)生快，質量好，成活率高。（2）試管外生根有些植物種類在試管中難以生根，或有根但與莖的維管束不相通，或根與莖聯(lián)系差，或有根而無根毛，或吸收功能極弱，移栽后不宜成活，這就需要采用試管外生根法。試管外生根是將已經(jīng)完成壯苗培養(yǎng)的小苗，用一定濃度生長素或生根粉浸蘸處理，然后栽入疏松透氣的基質中。大花蕙蘭、非洲菊、蘋果、獼猴桃、葡萄和毛白楊等均有試管外生根成功的報道。試管外生根也是一種降低生產(chǎn)成本的有效措施，不僅可以減少無菌操作的工時消耗，而且減少了培養(yǎng)基制備材料與能源消耗。生根方法1）適當延長在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間，直至根系長出并達到一定長度。2）采用專門的生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，一般為1/2或1/4的基礎培養(yǎng)基。3）增大NAA或IAA等生長素的濃度來促進生根。4）切割健壯的試管苗在適宜的基質中進行扦插生根。5）控制初始的培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑濃度，一次性獲得生根試管苗（只適用于個別植物）。3.5.4煉苗和移栽移栽前將裝有健壯試管苗的培養(yǎng)瓶，從培養(yǎng)室中移到室外鍛煉1-2天后，把瓶子打開，用鑷子取出，清水洗去根部的培養(yǎng)基，轉入適宜的基質中。3.3.4移栽和管理經(jīng)過煉苗后，可以將試管苗移到先保濕后敞開的空間中去，移栽方式有大田移栽和容器移栽。大田移栽是對于一些木本藥用植物，煉苗后先經(jīng)過容器移栽，然后轉移到大田中。容器移栽時將馴化的試管苗移栽到穴盤等育苗容器中。具體方法：從瓶中取出試管苗，在20℃注意事項：①從瓶中取苗時，手要輕，不能用力過猛，防止扯斷苗根。②試管苗清洗時，一只手輕輕捏住苗的根莖上部，另一只手輕揉苗根，將附于其上的瓊脂塊和松散的愈傷組織清理掉；如果根過長，可以用鋒利的剪刀剪掉一段，蘸生長素（50mg/L的吲哚丁酸或萘乙酸）或生根粉后移入苗盤。清洗一定要干凈，否則殘留的培養(yǎng)基會導致霉菌污染。③移栽基質以疏松、排水性和透氣性良好都為宜，最好使用理化性狀良好的復合基質。但應當注意基質的徹底消毒。④已經(jīng)植入育苗盤的試管苗，應在清潔又能控溫的條件下生長，空氣濕度要大，如果光照強度過大應該進行適當遮蔭。⑤植苗入盤的時間，最好選在無風陰濕的天氣，對于一些移栽成活率低的植物，移栽時的空氣濕度和光照條件是重要的影響因子。⑥移栽時先在營養(yǎng)缽或穴盤中裝入基質至1/4處，左手輕拿試管苗，右手將苗根均勻地分布于營養(yǎng)缽中。移栽約1周后，應該進行適量的葉面追肥，最好使用1/4或1/2MS培養(yǎng)基大量元素的混合游，可以是按一定比例配制的稀磷酸二氫鉀和尿素溶液。第四章實訓項目實訓一組培室設備參觀及器皿的洗滌和滅菌一、目的要求：1．通過參觀，了解組織培養(yǎng)室的幾個主要組成部分和各部分應有的基本設備以及有關儀器的用途與功能。2．通過實際操作，學會洗滌劑的配制和各種器皿的清洗和滅菌方法。二、實驗內(nèi)容了解組培室的結構及主要設備的用途和性能是十分必要的，總體上的了解有利于以后各實驗的進行以及正確的使用各種儀器和設備。植物組織培養(yǎng)是一項十分細致的工作，為了保證植物外植體不受污染，第一關就是要對各種器皿進行清洗和消毒，使它們保持無菌狀態(tài)，做這些工作同樣有一套科學的方法和需要熟練的技巧，因此每個學生必須學好這套基本功。三、實驗原理實驗儀器的清洗、消毒和滅菌是組織培養(yǎng)成功的關鍵所在，是外植體免受污染的前提。由于滅菌劑的種類不同，所以選擇消毒劑既要考慮良好的消毒、殺菌作用，同時易被蒸餾水沖洗掉。四、實驗儀器與材料：高壓滅菌鍋、烘箱、超凈工作臺、酸度計、空調(diào)機、萬分之一天平、電爐、玻璃器皿（試管、三角瓶、移液管、漏斗、燒杯、容量瓶、試劑瓶、量筒酒精燈），以及鑷子、解剖刀、解剖針、手術剪，肥皂、洗衣粉、重鉻酸鉀、濃硫酸等。五、方法和步驟：首先在老師帶領下參觀組培室，并聽取講解，然后配制洗液，稱取工業(yè)用重鉻酸鉀40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制濃硫酸（或廢硫酸）配好的溶液呈紅色，鉻酸洗液是一種強氧化劑，去污能力強，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蠟等則用此液無效，鉻酸洗液可反復使用，直到溶液呈青褐色為止。此溶液腐蝕性強，洗滌時需注意。每人清洗部分玻璃器皿，方法：清水洗凈→泡入洗衣粉水溶液中進行洗刷→清水反復沖洗→蒸餾水淋一遍→烘干備用。然后清洗部分較臟的玻璃器皿，方法：采用先堿后酸，即用洗衣粉洗刷后沖洗干凈→晾干→侵入酪酸洗液，浸泡時間視器皿的骯臟程度而定→清水反復沖洗干凈→蒸餾水淋洗一遍→烘干備用。帶有石蠟或膠布的器皿：先將其除去，再用常規(guī)洗滌，石蠟用水煮沸數(shù)次即可去掉，膠布粘著物則需用洗衣粉液煮沸數(shù)小時，再用水沖洗，涼干后浸入洗液，以后的步驟同前。對器皿和用具進行高壓滅菌，使用高壓滅菌鍋，在121℃六、考核原則按學生分組情況，觀察各分組的操作情況以及完成情況。實訓二

母液的制備及培養(yǎng)基的配制、滅菌一、

目的要求：通過掌握培養(yǎng)基對母液制備及常用培養(yǎng)基的配制和滅菌方法，為植物組織培養(yǎng)準備合適的營養(yǎng)條件。二、

實驗內(nèi)容學習母液和培養(yǎng)基的配制，滅菌的方法。三、

實驗原理植物材料培養(yǎng)要獲得成功，并正常生長，培養(yǎng)基的組成成分是一個決定性因素，不同植物要求不同的培養(yǎng)基，因此，在進行大量工作之前，對不同培養(yǎng)基應進行分析、比較、試驗，選擇一個符合試驗材料需要的適宜培養(yǎng)基。大多數(shù)植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基由無機營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質和有機附加物等五類物質組成。四、

實驗儀器與材料高壓滅菌鍋、冰箱、普通及精密天平、電爐、玻璃器皿（燒杯、容量瓶、移液管、試劑瓶、三角瓶、漏斗），化學試劑(CaCl2·2H2O，KNO3，MgSO4·7H2O，NH4NO3，KH2PO4，Na2—EDTA，F(xiàn)eSO4·7H2O，MgSO4·4H2O，ZnSO4·7H2O，H3BO3，KI，NaMoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，甘氨酸，鹽酸硫胺素，鹽酸吡哆醇，煙酸，肌醇，蔗糖，瓊脂，若干種生長調(diào)節(jié)物質及天然復合物，HCL,NaOH,酒精)，以及稱量紙、藥匙、玻璃棒、精密度紙，瓶蓋用紙，線繩或橡皮筋、鉛筆、標簽紙。五、

方法和步驟1、母液的配制母液的配制是按所使用藥品的類別，而分別配成大量元素、微量元素、維生素和鐵鹽等。配制母液時特別要注意無機鹽成分在一起，可能產(chǎn)生的化學反應，如Ca2+和SO2-4,Ca2+,Mg2+和PO3-4一起溶解后，會產(chǎn)生硫酸鈣或磷酸鈣的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液貯存，應分別配制和保存。配制母液時要用雙重蒸餾水等純度較高的水，藥品應采用化學純或分析純級，藥品的稱量及定容都要準確，各種藥品先以少量蒸餾水使其充分溶解，然后按培養(yǎng)基上的排列順序混合。現(xiàn)以MS培養(yǎng)基為例敘述如下：根據(jù)各種藥品的特點，母液可配成4種。母液Ⅰ：把大量元素按培養(yǎng)基配方的20倍濃度混合在一起。KNO3

38克NH4NO3

33克MgSO4/7H2O

7.4克KH2PO4

3.4克CaCl2/2H2O

8.8克加水定容至1000毫升，配1升培養(yǎng)基時，吸收50毫升，注意CaCl2應待其它度劑徹底溶解后再加入，否則易出現(xiàn)沉淀。母液Ⅱ：把硼、鋅、錳、銅、鈷、鉬等微量元素，接培養(yǎng)基配方濃度的1000倍濃縮配制在一起。

MnSO4*4H2O

22.3g

ZnSO4*7H2O

8.6g

H3BO3

6.2g

KI

0.83g

Na2MoO4*2H2O

0.25g

CuSO4*5H2O

0.025g

CoCL2*6H2O

0.025g加水定容至1000毫升，配一升培養(yǎng)基時，吸取1ml.母液Ⅲ：按培養(yǎng)基配方濃度的100倍液濃縮配制在一起。甘氨酸

0.20g鹽酸硫胺素

0.04g鹽酸吡哆素

0.05g煙酸

0.05g肌醇

10.0g加水定容至1000毫升，配一升培養(yǎng)基時，吸取10ml.為了配制不同培養(yǎng)基時使用方便，也可以將母液Ⅳ各維生素物質分別配制，一般配成濃度為：甘氨酸2mg/ml，鹽酸硫胺素1mg/ml，鹽酸吡哆素1mg/ml，煙酸1mg/ml，肌醇20mg/ml.母液Ⅳ：

Na2-EDTA

3.73g

FeSO4/7H2O

2.78g加水定容至500ml，配一升培養(yǎng)基時，吸取10ml.2．植物激素的配制：一般將植物激素配制成0.1~0.5mg/ml的溶液，由于多數(shù)植物激素難溶于水，可采用以下方法配制：6-BA、IAA、IBA:先溶于少量95%乙醇中，再加水定容。NAA:可溶于熱水中或用少量95%乙醇或少量1N的NOH溶解后，再加水定容。2，4-D不溶于水，可用95%的乙醇溶解后，再加水定容。以上配好的母液需貯存于2~4攝氏度的冰箱中，定期檢查有無沉淀或微生物的污染，如出現(xiàn)霉菌，渾濁或沉淀，則不可再用。3．培養(yǎng)基的配制：以配制1000ml為例，按每升培養(yǎng)基要求含量/每ml母液含量=母液吸取量公式，分別吸取母液1、母液Ⅱ、母液Ⅲ、母液Ⅳ各50ml、1ml、10ml、10ml及一定量的各種植物激素混合后，再加3%蔗糖及預先以一定量蒸餾水加熱熔化的瓊脂，然后加蒸餾水定容至于1000ml，最后用NaOH調(diào)節(jié)PH至要求值（5.4~6.0之間的一特定值），然后分裝入瓶，以100ml,三角瓶為例，每瓶裝培養(yǎng)基40ml，共裝25瓶，然后蓋上蓋瓶（4層），扎緊后滅菌。4．培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌法，即將分裝好的培養(yǎng)基放在高壓滅菌鍋中，加熱，待壓力上升到0.5kg/cm2時，打開放氣閥排凈冷空氣，關閉放氣閥繼續(xù)加熱使壓力穩(wěn)定在1.1~1.2kg/cm2，溫度為121攝氏度的條件下，維持15~20分鐘，培養(yǎng)基滅菌時間不宜過長，以防引起培養(yǎng)基成分的變化，滅菌后的培養(yǎng)基置于室溫下貯存（最適宜的溫度為10攝氏度），一般培養(yǎng)基在滅菌后二星期內(nèi)應用。六、考核按分組情況，觀察各分組的培養(yǎng)基配制情況，澄清度、配制的準確性、操作標準、滅菌效果以及實訓完成后的整理。實訓三植物組織培養(yǎng)整體方案設計操作一、目的要求通過前面項目的學習，通過查閱資料，選擇合適的植物材料進行植物組織培養(yǎng)方案設計，要求方案設計合理，可操作性強。二、實訓內(nèi)容1、選擇合適的植物材料2、根據(jù)選擇的材料查閱相關資料3、根據(jù)所查閱資料的情況選擇合適的培養(yǎng)基配方4、以組為單位進行方案的整體設計三、具體要求1、選擇的植物材料簡單常見、后續(xù)可操作性強2、要有完整的（包括植物培養(yǎng)的各個階段）培養(yǎng)基和生長調(diào)節(jié)劑配方3、各組所選擇的植物材料將作為后續(xù)項目操作的內(nèi)容4、要有合理的方案設計報告實訓四常見花卉植物的初代培養(yǎng)一、目的要求：1、掌握植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的配制、滅菌和配方的選擇2、掌握植物材料的消毒和滅菌處理方法3、掌握組織培養(yǎng)的無菌操作技術4、學會正交試驗方法二、材料用具:1、帶腋芽的植物莖段或葉片、莖尖等2、超凈工作臺、剪刀、鑷子、解剖針、解剖刀、廣口瓶、燒杯、培養(yǎng)皿、酒精燈、升汞、次氯酸鈉、酒精、無菌水、培養(yǎng)基、記號筆、紗布、酒精棉球、等材料。3、基礎培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑(根據(jù)不同植物材料選擇)、無菌水、70%的酒精、0.2%的次氯酸鈉、0.1%的升汞三、方法步驟1、培養(yǎng)基配制按照配方配制好培養(yǎng)基并及時滅菌備用；2、取材、選材選擇優(yōu)良健壯五病蟲害的植物植株，選取飽滿的植物材料，用自來水沖洗干凈，在洗衣粉水中浸泡30min,然后用流水沖洗干凈；3、消毒在超凈工作臺上用70%的酒精消毒20-30s，無菌水沖洗一次，在0.2%的次氯酸鈉中浸泡5-10min，用無菌水沖洗4-5次。4、接種根據(jù)所選擇的植物材料，按照無菌操作的要求，將植物材料接種到誘導培養(yǎng)基上。5、培養(yǎng)選擇合適的培養(yǎng)溫度24°，合理的光照強度，定期觀察生長情況。四、實訓報告每隔七天觀察一次試管苗的生長情況，并做好記錄（包括污染率、萌發(fā)時間、苗高、增殖系數(shù)、正交試驗的對比情況等）并寫出實訓報告萌發(fā)率=萌發(fā)的材料數(shù)/總接種的材料數(shù)*100%繁殖系數(shù)=每瓶形成的有效苗數(shù)/接種苗數(shù)*100%實訓五試管苗的繼代培養(yǎng)與轉接目的要求：熟練掌握培養(yǎng)基的制作過程，掌握試管苗的莖段轉接過程。

二、儀器及試劑：超凈工作臺及配套接種用具(無菌接種工具、酒精燈、酒精

棉球、70%酒精瓶，無菌培養(yǎng)皿、打火機等)

三、試驗材料：取培養(yǎng)的試管苗。選擇長勢好，高度達5cm以上的莖梢種苗或芽叢種苗。每個超凈臺配給2瓶種苗?？瞻着囵B(yǎng)基：準備事先做好的10瓶空白培養(yǎng)基。

四、操作步驟1、配制繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基并做好滅菌備用2.接種前4小時對接種室進行熏蒸，每個超凈臺取10ml左右甲醛液裝入

瓶中，在超凈臺邊加入5克左右高錳酸鉀，立即放入超凈臺里；接種前20-30分鐘接通電源，打開紫外燈和風機。

3．洗凈雙手，穿好專用實驗服進入接種室，用酒精棉球擦試雙手，臺面及

接種工具等。

4．將酒精燈放在距超凈臺邊緣約30cm，正對胸前處，注意以后的操作都要

在酒精燈的10cm半徑范圍內(nèi)完成。點燃酒精燈，對剪子和鑷子過火，先從頭至尾過火，然后對尖端反復過火；將種苗瓶放在燈前偏左處；將空白培養(yǎng)基瓶放在燈前偏右處；將接種用培養(yǎng)皿放在距超凈臺邊緣約15cm，正對胸前處，以利操作的方便進行。

5．打開原種瓶，對瓶口先外壁，后內(nèi)壁過火。然后準備接種：先將種苗移到

培養(yǎng)皿里。對香石竹等莖梢可切割莖段，剪時要莖節(jié)上部少留，節(jié)下部多留。對草莓等沒有莖、只有基生葉的種苗分離芽叢，最后均分離為1-2個芽，最好為1個芽。

每瓶接4—5個莖段或小芽，若放4株呈正方形分布。若放5株最后一株要放在正方形對角線交點處。接好后，瓶口和封口膜均要過火，扎口。每接完一瓶，

接種工具要放回酒精消毒瓶。

如果技能熟練的話，可用懸接法，用鑷子夾住試管苗的頂端一節(jié)，拔出瓶口，

剪斷這一節(jié)，將莖段插入空白培養(yǎng)基中。對芽叢可提起一個芽叢的一個芽，用剪刀剪去其它部分，將單芽插入培養(yǎng)基里。

6.接完一瓶原種后，可用酒精棉球擦拭雙手，棄去含廢棄物的培養(yǎng)皿，換用新的無菌培養(yǎng)皿，以防交叉感染。

7.接完10瓶種苗后，寫好標簽，移出超凈臺，置于塑料筐里，再接下一批。

8.接種完畢，熄滅酒精燈，蓋上酒精瓶，收拾凈超凈臺面，先把種苗瓶移出，

然后將廢物皿、空原種瓶、培養(yǎng)皿、接種工具等移出放到塑料筐里，帶出接種室，清洗干凈。

9.接后的培養(yǎng)物轉移到培養(yǎng)室進行培養(yǎng)。3天后，經(jīng)常檢查污染情況，及時清除培養(yǎng)瓶。五、實訓報告觀察并記錄轉接后植物的生長情況、污染率等。實訓六植物的生根培養(yǎng)一、實訓目的

熟練掌握生根培養(yǎng)的各個技術環(huán)節(jié)，包括生根試管的接種，培養(yǎng)觀察與對策等。二、實訓材料轉接后試管苗、空白生根培養(yǎng)基：準備事先做好的10瓶空白培養(yǎng)基。三、試驗儀器試劑超凈工作臺及配套接種用具(無菌接種工具、酒精燈、酒精

棉球、70%酒精瓶，無菌培養(yǎng)皿、打火機等)。

四、實訓內(nèi)容及步驟

1.生根培養(yǎng)基的制作

2.生根試管苗的接種和培養(yǎng)。3、實訓步驟

生根培養(yǎng)基基配制時可配制1/2MS，另加NAA1－2，不要加入細胞分裂素類生

長調(diào)節(jié)物質。打開種苗瓶，對瓶口先外壁，后內(nèi)壁過火。然后準備接種：先將種苗移到培養(yǎng)皿里。對植物材料等莖梢可切割莖段，剪時要莖節(jié)上部少留，節(jié)下部多留。每瓶可接4—5個莖段或小芽，接好后，瓶口和封口膜均要過火，扎口。每接完一瓶，接種工具要放回酒精消毒瓶。

培養(yǎng)時，注意觀察生根情況，約20天后開始分化生根，以出現(xiàn)長度在1cm、潔白均勻整齊的不定根為佳。不要使根發(fā)生徒長現(xiàn)象。五、思考和作業(yè)

1．生根培養(yǎng)基和其它培養(yǎng)基有什么區(qū)別？

2．生出的不定根以什么標準較好？實訓七

藥用植物鐵皮石斛的組織培養(yǎng)一、目的要求：練習鐵皮石斛莖尖外植體的剝離、滅菌和接種等無菌的操作方法，熟悉鐵皮石斛快速繁殖和獲得無病毒植株的全過程。二、實驗內(nèi)容學習和掌握鐵皮石斛莖尖剝離、滅菌和接種等基本操作。三、實驗原理植物莖尖處于比較幼嫩的部位，其細胞具有旺盛的生命力，易于培養(yǎng)而獲得成功。莖尖培養(yǎng)根據(jù)其目的不同，取材的大小有較大的差異，較小的僅為十至幾十微米的莖尖分生組織，較大的可利用幾十毫米的莖尖甚至更大的芽，但一般講莖尖愈?。ㄐ〉?0——100微米的生長點）培養(yǎng)難度就越大，有的需要一年或更長的時間才能成苗，莖尖越大培養(yǎng)越易獲得成功。如果進行植物快速繁殖，則采用較大的莖尖，以帶有葉原基的生長為宜，這樣既能提高成活率，又能加快繁殖速度，如以脫毒為目的，則采用較小的莖尖，因為病毒在植株上的分布是不均勻，一般幼嫩的組織器官中病毒含量極低，以生長點含病毒最少，甚至不含病毒，所以進行脫毒種苗培養(yǎng)，應盡量采用極小的莖尖生長點進行培養(yǎng)，以獲得脫毒苗。四、實驗儀器與材料超凈工作臺、剪刀、鑷子、解剖針、解剖刀、廣口瓶、燒杯、培養(yǎng)皿、酒精燈、升汞、次氯酸鈉、酒精、無菌水、培養(yǎng)基、記號筆、紗布、酒精棉球、鐵皮石斛外植體等材料。五、方法和步驟1、選擇品種性狀典型的，生長健壯無病蟲的鐵皮石斛植株，取其已萌動的頂芽或腋芽，或剪下3~5cm生長的莖頂端，剝?nèi)ゴ笕~片，先在流水中沖流2~3小時，吸干水分，再在70%乙醇中浸半分鐘，然后放入2%的次氯酸鈉溶液中滅菌5分鐘，用無菌水沖洗3~5次。2、在超凈工作臺上把滅菌的莖尖放在雙筒解剖鏡下剝?nèi)ポ^小的葉片，根據(jù)不同目的，可取只帶2~3個葉原基的生長點甚至不帶葉原基的生長點，或帶2~3片幼葉的莖尖。生長點剝離方法：在解剖鏡下，一手用鑷子夾住無菌的莖尖，一手用較細的解剖針剝掉生長點外圍的葉片，直至達到晶瑩發(fā)亮的光滑頂為止，然后用解剖刀仔細切取所需莖尖，隨即接種在預先配制好的培養(yǎng)基上。3、培養(yǎng)基：莖尖分化培養(yǎng)基：MS+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖莖尖培養(yǎng)對培養(yǎng)容器無特殊要求，一般以15cm×20cm的試管，或50ml三角瓶為宜，每支試管裝10ml培養(yǎng)基，每只三角瓶裝25ml培養(yǎng)基，每管或每瓶接種一個莖尖。4、培養(yǎng)：接種的莖尖置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，溫度25攝氏度±2攝氏度，光照2000Lux,以日光燈為光源，每天照光10小時。六、任務及分析1、每人接種莖尖4個，要求二個剝至帶2～3個葉原基的生長點。2、定時觀察記錄：幼苗分化和生根情況。3、試述利用莖尖培養(yǎng)為什么能夠脫除病毒。實訓八

藥用植物的花藥培養(yǎng)一、目的要求學習藥用植物花藥的采集、滅菌、接種、培養(yǎng)等一整套花藥培養(yǎng)的具體方法。二、實驗內(nèi)容以藥用植物的花藥為外植體，掌握對花藥的滅菌、接種、培養(yǎng)等的方法。三、實驗原理花藥培養(yǎng)是植物育種的一種有效方法，即用離體花藥培養(yǎng)的方法，使其中的花粉發(fā)育成一個完整的植株，這種花粉植株的染色體數(shù)目為體細胞的一半，稱為單倍體植物。通過這一途徑獲得單倍體后再使之加倍，就能得到純合二倍體，從而為準確研究性狀遺傳規(guī)律和雜種優(yōu)勢的利用打下基礎。四、實驗儀器與材料不同藥用植物的花藥，紗布、塑料袋、三角瓶、70%酒精、冰箱、顯微鏡、醋酸洋紅、載玻片、蓋玻片、MS培養(yǎng)基的各種化學藥品。各種滅菌、接種、培養(yǎng)用具和器皿等。五、方法和步驟1、鏡檢確定花粉發(fā)育期：本實驗在培養(yǎng)前先采集處于適宜時期的花蕾利用醋酸洋紅壓片法進行鏡檢，選取適宜的花粉發(fā)育時期。2、預處理：采集花蕾，用濕紗布包好放入塑料袋，置于3~5攝氏度冰箱中處理7天左右。3、培養(yǎng)基準備采用MS培養(yǎng)基+2，4-D0.4mg/L+KIN0.2mg/L+IAA4mg/L+蔗糖3~8%。4、花藥滅菌及接種：接種前花蕾經(jīng)0.1%升汞滅菌10~15分鐘，然后用無菌水沖洗3~5次，在無菌條件下取出花藥進行接種，注意不要破壞花藥，每瓶接種20~30個花藥。5、誘導培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶置于溫度25~30%，光強1500~2000Lux,每天光照相館0小時的培養(yǎng)室中，誘導形成體胚或愈傷組織。6、分化