藥物電泳技術(shù)-聚丙烯酰胺凝膠電泳（制藥技術(shù)課件）

電泳技術(shù)--SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)大綱1.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理2.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)

SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。（一）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)SDS（十二烷基磺酸鈉）能打開蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和疏水鍵，破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)使其變性為松散的線狀。SDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，巰基乙醇使二硫鍵打開，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物形狀近似橢圓形，短軸相同，長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)（二）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。兩者關(guān)系：蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)（二）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理

將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)其相對遷移率，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)操作：即變性及非變性）1.制膠:（變性：buffer（電泳緩沖液）中加0.4%SDS）

a.分離膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小，選擇一定濃度的分離膠，配制分離膠溶液：（丙烯酰胺:亞甲基雙丙烯酰胺溶液）Acr:Bis=29:1，分離膠buffer,過硫酸銨（AP），四甲基乙二胺（TEMED），水。迅速倒膠，加水使液面平坦，室溫0.5h聚合完全。

b.濃縮膠：用濃縮膠buffer。插上梳子。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)2.樣品制備：

a.PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）:樣品＋樣品緩沖液（蔗糖或甘油＋指示劑溴酚藍(lán)）

b.SDS:樣品＋樣品緩沖液（SDS，甘油，巰基乙醇，溴酚藍(lán)），煮沸2~5min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳特點SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)3.加樣及電泳：

SDS:電極buffer（緩沖液）中加0.1%SDS，溴酚藍(lán)距下端1cm時停止電泳。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳特點SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)4.固定及染色a.固定

將凝膠浸于7％乙酸或12.5％TCA中固定蛋白質(zhì)組分。b.染色

常用方法有考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法（靈敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿爾辛藍(lán)，過碘酸－Schiff試劑。（三）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作高電壓SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳技術(shù)--聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)大綱1.聚丙烯酰胺凝膠電泳概念2.聚丙烯酰胺凝膠電泳特點3.聚丙烯酰胺凝膠電泳分類聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE是以丙稀酰胺為單體、亞甲基雙丙稀酰胺為交聯(lián)劑，通過自由基誘導(dǎo)聚合所形成的，具有一定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠為載體的電泳。（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳概念聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)

電泳過程中，樣品分子的遷移速率，除受自身電荷大小影響外，還與樣品分子的大小和形狀密切相關(guān)（即凝膠載體的分子篩效應(yīng)），具有很高的分辨率。

PAGE可用于蛋白、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量制備，還可用于測定分子量和等電點。（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳概念聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)（1）一定濃度范圍內(nèi)凝膠透明（易于電泳過程觀察監(jiān)測），且在270nm無吸收（便于蛋白及核酸電泳后的掃描檢測），有彈性，機(jī)械性能好；（2）化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不與被分離物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)，并在很多溶劑中不溶；（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳特點聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置及分離原理聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)（3）對pH和溫度變化穩(wěn)定，操作條件一致時，樣品分離重復(fù)性好；（4）對樣品吸附作用小，且聚合物不帶電荷，電滲作用??；（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳特點聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)（5）凝膠孔徑大小可調(diào)控，具有可控分子篩效應(yīng)；（6）分辨率高（不連續(xù)PAGE集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)一體）。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳特點聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)根據(jù)是否存在濃縮效應(yīng)可分為連續(xù)PAGE和不連續(xù)PAGE。（1）連續(xù)PAGE

電泳體系中緩沖溶液pH值及凝膠濃度相同，帶電分子在電場的作用下主要依靠電荷和分子篩效應(yīng)實現(xiàn)分離。（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳分類聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)（2）不連續(xù)PAGE

電泳體系中由于緩沖溶液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電分子在電場中涌動不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還有濃縮效應(yīng)，因此分離條帶的清楚度和分辨率均有所提高。（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳分類垂直板電泳裝置聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳技術(shù)不連續(xù)PAGE系統(tǒng)的組成：①電極緩沖液：pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液；②樣品膠：無需專門制備，只需在樣品液中加入等體積40%的蔗糖溶液即可；（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳分類聚丙烯酰胺電泳分離聚丙烯酰胺凝膠電泳—電泳