基因治療載體的研究現(xiàn)狀(一)

基因治療載體的研究現(xiàn)狀(一)【關鍵詞】基因；治療;載體

基因治療是一種新的治療手段，可用于多種疾病的治療，包括癌癥、遺傳性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等.基因治療通常是指將遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）引入到患者的細胞中，以達到治療疾病的目的的方法〔1～3〕.它是伴隨著DNA重組技術的成熟而發(fā)展起來的新型的分子學治療手段，是當今生物醫(yī)學發(fā)展中的重大突破.1968年，美國科學家邁克爾·布萊澤首次在醫(yī)學界提出了基因治療的概念.1990年，美國科學家Anderson等進行了首例真正意義上的基因治療臨床試驗，獲得了初步成功〔4〕.在基因治療過程中，基因?qū)胂到y(tǒng)是最關鍵的技術.目前，在基因?qū)胼d體方面出現(xiàn)了兩大主流，即病毒載體系統(tǒng)及非病毒載體系統(tǒng).本文對基因治療載體應用的原理、種類和研究現(xiàn)狀進行了綜述.

1病毒載體

外源基因進入細胞中通常需要運輸工具，而病毒是在漫長的自然進化過程中存活下來的無細胞結構的最小、最簡單的生命寄生形式.病毒通常可以高效率地進入特定的細胞，表達自身蛋白，產(chǎn)生新的病毒粒子，因此被改造的病毒首先成為了基因治療的載體.病毒載體在基因治療領域的應用廣泛，約70%的治療方案采用病毒載體〔5，6〕.病毒載體包括反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體及單純皰疹病毒載體等.

1.1反轉錄病毒載體反轉錄病毒屬于正鏈RNA病毒，可高效地感染許多類型的宿主細胞，并可穩(wěn)定地整合到宿主細胞基因組中，是最先被改造且應用最廣泛的基因治療載體.反轉錄病毒基因組長度約為10kb，含有3個最重要的基因，即gag（編碼核心蛋白），pol（編碼反轉錄酶），env（編碼病毒外膜蛋白）.基因排列順序是5＇gagpolenv3＇，兩端存在長末端重復區(qū)（LTRS），用于介導病毒的整合，env基因中含有病毒包裝所必需的序列.另外，一些反轉錄病毒中存在原癌基因，其突變會引發(fā)癌變，當被整合到宿主細胞的原癌基因附近或插入到宿主細胞的抑癌基因中時也可引發(fā)癌變.構建反轉錄病毒載體多采用鼠白血病病毒（MoMLV），其為嗜雙性病毒，既可感染鼠細胞，亦可感染人細胞.反轉錄病毒載體的基本成分包括：1）必需的病毒基因組分，如LTRS、病毒的包裝識別信號、翻譯所需的剪接識別位點及poly（A）尾等;2）高效的治療基因，如抑癌基因及自殺基因等;3）標記基因，用于篩選;4）其他質(zhì)粒必要成分.在應用上，攜帶外源目的基因的反轉錄病毒載體需要包裝細胞（如ProPak及PA317細胞系）才能成為成熟的重組假病毒粒子，其原因為在構建的復制缺陷型反轉錄病毒載體中，外源目的基因取代了病毒的必需基因，此時病毒只有借助包裝細胞提供的反式作用蛋白，才能包裝產(chǎn)生子代重組病毒.這種子代重組病毒僅具備一次感染性，避免了在人體細胞間擴散感染，亦降低了病毒本身的致癌性及致病性.作為基因治療載體，反轉錄病毒載體具有感染率高，可穩(wěn)定整合表達，宿主范圍廣泛及對宿主毒性小等優(yōu)點，但同時也存在僅感染正在分裂的細胞，可能致癌及包裝外源DNA?。ǎ?kb）等缺陷.目前，在基礎與臨床研究中此類病毒載體多適用于間接體內(nèi)基因治療，特別是腫瘤的基因治療.但重組反轉錄病毒的感染和轉導效率較低，外源基因隨機插入，可能導致突變.慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV1)為基礎發(fā)展起來的基因治療載體,區(qū)別于一般的反轉錄病毒載體，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，轉移基因片段容量較大，轉染所需的病毒滴度可達（1～10）7×MU/L，目的基因表達時間長，不易誘發(fā)宿主免疫反應，對淋巴細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞、心肌細胞、肌細胞和多種腫瘤細胞具有較高的轉導效率〔7～10〕.

1.2腺病毒載體腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛，至少存在100種以上的血清型.腺病毒基因組長度約為36kb，兩端各有1個反向末端重復區(qū)，其內(nèi)側為病毒包裝信號.腺病毒基因組上分布著4個早期轉錄元（E1,E2,E3,E4）承擔調(diào)節(jié)功能，和1個晚期轉錄元負責結構蛋白編碼.作為基因治療的載體，腺病毒載體具有如下優(yōu)點：1）基因包裝容量較大，因而可插入大片段外源基因，最多可達35kb；2）感染效率高，可高效地轉導不同類型的人組織細胞，體外實驗轉導效率接近100%轉導效率；3)可轉導非分裂細胞；4)在細胞培養(yǎng)物中有高滴度的重組病毒產(chǎn)量；5）進入細胞內(nèi)并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，因而安全性較高.第一代腺病毒載體為E1或E3基因缺失，缺失區(qū)插入外源治療基因，但此型載體可引發(fā)機體產(chǎn)生強烈的炎癥反應或免疫反應，且表達外源基因的時間較短.第二代腺病毒載體則另外讓E2a或E4基因缺失，產(chǎn)生較弱的免疫反應，在載體容量和安全性方面亦有較大改進.第三代腺病毒載體缺失了全部的（無病毒載體）或大部分腺病毒基因（微型腺病毒載體），僅保留反向末端重復區(qū)和包裝信號序列，最多可插入35kb的基因，且所引起的細胞免疫反應更弱，在它的載體中引入核基質(zhì)附著區(qū)基因可使外源基因保持長期表達，并可增加穩(wěn)定性.

1.3腺相關病毒載體腺相關病毒屬于非致病性的微小病毒科家族成員，只有依賴于輔助病毒才可能增殖.腺相關病毒基因組很小，如2型腺相關病毒是由4681個核苷酸組成的單鏈DNA，包含2個基因，即rep基因（編碼負責調(diào)節(jié)病毒復制、結構基因表達和整合到宿主基因組中的蛋白）及cap基因（編碼衣殼結構蛋白），基因組的1個末端存在1個145bp的末端重復區(qū).腺相關病毒可感染分裂期及靜止期細胞,能插入到宿主細胞染色體內(nèi),或以染色體外串聯(lián)體DNA的形式長期穩(wěn)定表達，可有效地轉導腦、骨骼肌及肝臟等類型的細胞，具有抗原性、毒性小及不致病等特點，被認為是目前最好