DNA的生物合成課件

DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)

1.DNA復(fù)制（DNA→DNA）2.逆轉(zhuǎn)錄(RNA→DNA)復(fù)制(replication)以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。親代DNA復(fù)制子代DNADNA復(fù)制的基本特征BasicRulesofDNAReplication

第一節(jié)半保留復(fù)制semi-conservativereplication半不連續(xù)復(fù)制semi-discontinuousreplication雙向復(fù)制bidirectionalreplication復(fù)制的基本特征

DNA復(fù)制時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全重新合成，兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。半保留復(fù)制的概念一、DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制含15N-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液(14N)

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液第二代

——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。15N-DNA14N-DNA實(shí)驗(yàn)證據(jù)（同位素標(biāo)記技術(shù)、密度梯度離心）1958年MatthewMesselson和FranklinStahl遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。半保留復(fù)制的意義按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性

。

原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。二、DNA復(fù)制從起點(diǎn)向兩個(gè)方向延伸真核生物的多復(fù)制子復(fù)制5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’3’復(fù)制子已完成復(fù)制的復(fù)制子復(fù)制進(jìn)程復(fù)制起始點(diǎn)、復(fù)制子與復(fù)制叉3

5

3

5

3′5′3′5′解鏈方向領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)3′5′三、DNA復(fù)制反應(yīng)呈半不連續(xù)特征子鏈沿母鏈模板復(fù)制，只能從5’向3’延伸。同一個(gè)復(fù)制叉上只能有一個(gè)解鏈方向。半不延續(xù)復(fù)制順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈（leadingstrand）。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈（laggingstrand）。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性(semi-discontinuousReplication)。

DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓樸學(xué)變化TheEnzymologyandTopologyofDNAReplication第二節(jié)參與DNA復(fù)制的物質(zhì)參與DNA復(fù)制的物質(zhì)底物dNTP聚合酶DNA-pol模板解成單鏈的DNA母鏈引物與模板互補(bǔ)的RNA片段其它酶和蛋白質(zhì)因子底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依賴DNA的DNA聚合酶簡寫為DNA-pol模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合解螺旋酶引物酶單鏈DNA結(jié)合蛋白DNA連接酶等復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)特點(diǎn)：需要引物和模板；新鏈的延長5→3

方向PPiHOPPPG5′端3′端CGA聚合反應(yīng)機(jī)理一、DNA聚合酶催化脫氧核苷酸之間聚合全稱：依賴DNA的DNA聚合酶

(DNA-dependentDNApolymerase)(DNA-directedDNApolymerase)縮寫：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性DNA聚合酶接切1959年獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

奧喬亞科恩伯格

SeveroOchoaArthurKornberg（一）原核生物有3種DNA聚合酶２個(gè)核心酶1個(gè)

-復(fù)合物（

、

、

、

、

、

6種亞基）1對(duì)

-亞基（可滑動(dòng)的DNA夾子）DNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)包括：

亞基（130000）主要功能是合成DNA

亞基具有3

5

外切酶活性（復(fù)制保真性所必需）

亞基可增強(qiáng)其活性

亞基可能起組裝作用核心酶由

、

和

亞基組成：兩側(cè)的β亞基發(fā)揮夾穩(wěn)DNA模板鏈，并使酶沿模板滑動(dòng)的作用2個(gè)

-亞基分別和1個(gè)核心酶相互作用，其柔性連接區(qū)可以確保在復(fù)制叉1個(gè)全酶分子的2個(gè)核心酶能夠相對(duì)獨(dú)立運(yùn)動(dòng)，分別負(fù)責(zé)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈。功能：有促進(jìn)全酶組裝至模板上及增強(qiáng)核心酶活性的作用

-復(fù)合物由6種亞基組成：

、

、

、

、

、

小片段大片段/Klenow片段

N端C端木瓜蛋白酶Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

聚合酶NC小片段大片段（Klenow片段）3'—5'外切酶5'—3'外切酶DNA-polⅠ（109kD）DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。DNA-polⅡ?qū)δ０宓奶禺愋圆桓?，即使在已發(fā)生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認(rèn)為，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。真核生物和原核生物DNA聚合酶的比較E.Coli真核細(xì)胞

功能Ⅰ填補(bǔ)復(fù)制中的DNA空隙，DNA修復(fù)和重組Ⅱ復(fù)制中的校對(duì)，DNA修復(fù)

DNA修復(fù)

線粒體DNA合成Ⅲ

錯(cuò)配修復(fù)

引物酶

前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成，錯(cuò)配修復(fù)2.酶在復(fù)制延長時(shí)對(duì)堿基的選擇功能1.遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律3.復(fù)制出錯(cuò)時(shí)酶的及時(shí)校讀功能DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制

二、DNA聚合酶的堿基選擇和

校對(duì)功能實(shí)現(xiàn)復(fù)制的保真性三、復(fù)制中的解鏈伴有DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈后，它才能起模板作用。理順DNA鏈拓?fù)洚悩?gòu)酶(gyrA,B)穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)運(yùn)送和協(xié)同DnaBDnaC(dnaC)解開DNA雙鏈解螺旋酶DnaB(dnaB)辨認(rèn)起始點(diǎn)DnaA(dnaA)蛋白質(zhì)（基因）通用名功能原核生物復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)——利用ATP供能，在復(fù)制叉前解開一小段DNA1.解螺旋酶(helicase)：解螺旋酶(DnaB)3

5

3

5

引物3'HO5'引物酶該酶以DNA為模板，以核苷三磷酸（NTP）為底物催化合成RNA引物，為DNA的合成提供游離的3’-OH末端。2.引物酶(primerase)3

5

3

5

3.單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)

單鏈DNA結(jié)合蛋白對(duì)單鏈DNA有高親和力，能特異地結(jié)合到分開的單鏈DNA上。在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整解鏈過程中，在解開的兩條單鏈DNA分子的前方會(huì)出現(xiàn)過度擰緊、打結(jié)、纏繞和連環(huán)等現(xiàn)象。正超螺旋負(fù)超螺旋（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA超螺旋狀態(tài)拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用：切接作用水解連接切開一股DNA鏈封閉切口不需ATP切開雙股DNA鏈封閉切口需ATP拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅠⅡ?qū)β菪淖饔盟沙诳朔そY(jié)

斷端沿螺旋軸松解的方向移動(dòng)斷端沿螺旋軸松解的方向移動(dòng)有ATP進(jìn)入負(fù)超螺旋作用機(jī)制解螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的聯(lián)合作用：DNA雙鏈解成單鏈。

催化二段DNA鏈之間3’,5’磷酸二酯鍵的形成3’OH5’5’3’

OO-POO-有缺口的DNA鏈DNA連接酶ATPAMP+PPi

OO

POO-5’3’缺口封閉四.DNA連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的單鏈缺口DNA連接酶原核生物DNA復(fù)制過程TheProcessofDNAReplicationinProkaryotes第三節(jié)需要解決兩個(gè)問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。一、復(fù)制的起始

E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC--特殊的序列約245bp

GATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···

11317293244

···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串聯(lián)重復(fù)序列反向重復(fù)序列5

3

5

3

（一）DNA解鏈解鏈過程

DnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

（二）引物合成和引發(fā)體形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。解螺旋酶3

5

3

5

引物3'HO5'引物酶引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。在領(lǐng)頭鏈（模板）上，引物酶（DnaG）與解螺旋酶（DnaB）結(jié)合成復(fù)合物——解鏈及引物合成引物酶引物的生成

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polIII復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

二、DNA鏈的延長復(fù)制的延長復(fù)制過程簡圖5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATP

AMP+PPi5

5

DNA連接酶隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接3

三、復(fù)制的終止岡崎片段的連接哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM第四節(jié)真核生物DNA生物合成過程TheProcessofDNABiosynthesisineukaryotes

?真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步啟動(dòng)。一、真核生物復(fù)制的起始與原核生物基本相似?復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和DNA-polδ（解螺旋酶活性）參與。?還需拓?fù)洚悩?gòu)酶和復(fù)制因子(RF)。二、真核生物復(fù)制的延長發(fā)生DNA聚合酶α/δ轉(zhuǎn)換前導(dǎo)鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期后隨鏈：發(fā)生于每個(gè)岡崎片段合成之際發(fā)生DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換的原因是Pol

不具備持續(xù)合成能力。DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白是RFC。DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換3'領(lǐng)頭鏈隨從鏈引物核小體三、真核生物DNA合成后立即組裝成核小體親代DNA真核生物DNA復(fù)制與核小體組裝同步進(jìn)行，復(fù)制完成后隨即組裝成染色體真核生物DNA復(fù)制完成后，子鏈末端留下空隙，母鏈成單鏈四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問題1、端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。功能?維持染色體的穩(wěn)定性?維持DNA復(fù)制的完整性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?由富含TG的重復(fù)序列組成;?人的端粒重復(fù)序列為5’-(TnGn)x-3’。TTTTGGGGTTTTGGGG…2、端粒酶(telomerase)

?特點(diǎn)：

1.

由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合物

2.

為特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，能以自身的RNA為

模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA

?功能：合成端粒DNA，維持端粒的長度端粒酶端粒酶的RNA端粒DNA末端1、端粒酶靠AnCn與母鏈DNA端粒結(jié)合內(nèi)在模板RNA2、以端粒酶RNA為模版，逆轉(zhuǎn)錄，延長DNA母鏈3、端粒酶移位、空出RNA模板，再次延長母鏈，同時(shí)DNA母鏈反摺利于下游復(fù)制延伸。端粒酶的RNA4、延伸足夠長度后端粒酶脫離母鏈，代之以DNA-Pol。此時(shí)母鏈3′-OH反折，同時(shí)作為引物和模板，完成末端雙鏈復(fù)制。端粒酶的RNADNA-Pol端粒酶的催化延長作用

——爬行模型逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWay