青霉素類藥物工業(yè)分析與檢測方法

關于青霉素類藥物工業(yè)分析與檢測方法第一部分：青霉素類藥物生產(chǎn)工藝第2頁,共42頁，星期六，2024年，5月菌種優(yōu)化抗生素發(fā)酵及提取精制工業(yè)生產(chǎn)方法及總的工藝抗生素生產(chǎn)菌的菌種菌種來源抗生素工業(yè)生產(chǎn)

內容速覽第3頁,共42頁，星期六，2024年，5月抗生素總的生產(chǎn)工藝過程菌種孢子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預處理及過濾出廠檢驗提取過程成品包裝精制過程成品檢驗第4頁,共42頁，星期六，2024年，5月微生物合成抗生素下游：提取預處理過濾進一步提取菌種保存、選育、孢子及種子制備發(fā)酵——適宜的培養(yǎng)基碳源氮源無機鹽（微量元素）前體上游：結晶干燥純品成品:制劑工作第5頁,共42頁，星期六，2024年，5月第6頁,共42頁，星期六，2024年，5月★發(fā)酵控制1）發(fā)酵時間：視抗生素品種和發(fā)酵工藝而定。2）溶氧：在整個發(fā)酵過程中，需不斷通無菌空氣和攪拌，以維持一定罐壓或溶氧。3）控制灌溫：在罐的夾層或蛇管中需通冷卻水以維持一定罐溫。4）消泡：加泡沫劑以控制泡沫，必要時還加入酸、堿以調節(jié)發(fā)酵液的pH。第7頁,共42頁，星期六，2024年，5月成品檢驗《中華人民共和國藥典》抗生素成品常規(guī)檢驗的主要項目有：①鑒別實驗：用化學或生物方法證明是何種抗生素；②效價測定：測定有效成分的含量；③毒性試驗：限制產(chǎn)品中的致毒雜質⑤水分測定：限制過高水分以免影響穩(wěn)定性；④無菌實驗：檢查有無雜菌污染；⑥pH測定：規(guī)定水溶液的酸堿度，保證產(chǎn)品穩(wěn)定和臨床的安全應用；第8頁,共42頁，星期六，2024年，5月第二部分：青霉素類藥物的分析與檢測第9頁,共42頁，星期六，2024年，5月（一）、鑒別實驗一、化學結構與性質1、化學結構①

青霉素類結構NSRCONHCH3CH3COOHO1234567青霉素類:氫化噻唑環(huán)或氫化噻嗪環(huán)與β-內酰胺并合的雜環(huán)，分別構成二者的母體：6-APA、7-ACA。母核:由

-內酰胺環(huán)和氫化噻唑環(huán)組成的雙雜環(huán)。

6-APA6-AminopenicillanicAcid

側鏈:RCO-

第10頁,共42頁，星期六，2024年，5月2、性質青霉素類和頭孢菌素類結構共同特點具有

-內酰胺環(huán)。青霉素分子中都有一個游離羧基和酰胺側鏈。①

酸性

有羧基，具有酸性pKa值在2.5~2.8之間與堿成鹽如：青霉素G鈉、青霉素G鉀等分子中游離羧基具有相當強的酸性，能與無機堿或某些有機堿形成鹽。其堿金屬鹽易溶于水，而有機堿鹽難溶于水，易溶于甲醇等有機溶劑。第11頁,共42頁，星期六，2024年，5月②

旋光性青霉素分子中含有三個手性碳原子(C3，、C5、C6)有手性碳原子，具有旋光性，根據(jù)此性質，可用于青霉素藥物的定性和定量分析第12頁,共42頁，星期六，2024年，5月③紫外吸收特性青霉素類母核無明顯UV多數(shù)有苯環(huán)取代基

＊但青霉素類藥物在弱酸性下水解，可以產(chǎn)生具有共軛雙鍵的青霉烯酸，在紫外光區(qū)有吸收。＊側鏈中有苯環(huán)等取代基的藥物，在紫外光區(qū)也有吸收。像芐青霉素。第13頁,共42頁，星期六，2024年，5月頭孢菌素類分子中有共軛體系（O＝C－N－C＝C）在260nm處有最大吸收。第14頁,共42頁，星期六，2024年，5月④不穩(wěn)定性干燥條件下青霉素鹽穩(wěn)定。青霉素水溶液在pH6-6.8時較穩(wěn)定。β-內酰胺環(huán)是該類抗生素結構最不穩(wěn)定的部分。不穩(wěn)定性因素：四元環(huán)張力大，酰胺鍵易水解青霉素類藥物遇到某些氧化劑（酸、堿、青霉素酶，或某些金屬離子）或遭遇某種溫度，藥物將降解失效。第15頁,共42頁，星期六，2024年，5月二、青霉素類藥物的鑒別反應（一）官能團的呈色反應：1、羥肟酸鐵反應：堿性環(huán)境中與羥胺作用β-內酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸在稀酸中與高鐵離子呈色?！捐b別】（1）取本品約20mg，加水15ml溶解后，加鹽酸羥胺試液與氫氧化鈉試液各2ml，放置5分鐘后，加鹽酸溶液（1→100）3ml與三氯化鐵試液1ml，隨即振搖，即顯赤褐色。第16頁,共42頁，星期六，2024年，5月2、硫酸-硝酸呈色反應：頭孢菌素能與硫酸-硝酸反應后呈黃色。此顯色反應可區(qū)別某些頭孢菌素族抗生素，因此被一些國家藥典采用供鑒別。3、茚三酮反應：α-氨基酸的反應,如氨芐西林遇茚三酮顯藍紫色4、與斐林試劑反應：分子中具有(-CONH-)結構，可使堿性酒石酸銅還原顯紫色,5、變色酸-硫酸呈色反應：中國藥典(1995年版)采用本法鑒別。如阿莫西林林加變色酸-硫酸試劑混合后，于150℃加熱2-3min，因分解出甲醛與變色酸縮合而呈深褐色。6、各種鹽的反應：火焰反應在火焰下遇鉀顯紫色遇鈉顯淡黃色青霉素族、頭孢菌素族藥品中，許多制成鉀鹽或鈉鹽供臨床使用，因而可利用其火焰反應進行鑒別。第17頁,共42頁，星期六，2024年，5月（二）沉淀反應1、在稀鹽酸中生成白色沉淀：青霉素鉀(鈉)白色游離基沉淀2、有機胺鹽的特殊反應：側鏈含有苯羥基基團時，能與重氮苯磺酸試液產(chǎn)生偶合反應而呈色。如：第18頁,共42頁，星期六，2024年，5月（三）類似肽鍵的反應雙縮脲反應【鑒別】（2）取樣本約10mg，加水6ml溶解后，加堿性酒石酸銅試液0.5ml，即顯紫色。(四)生物學法（抑菌能力）如青霉素鈉鑒別取本品與已知含量的青霉素適量，分別加水制成每1ml中約含50μg的溶液，各取1ml，加入不少于200單位的青霉素酶溶液1ml,在37℃滅活1小時后，取滅菌濾紙片，分別用上述溶液浸濕后，用濾紙吸去多余的液體，置攤布金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)約16小時后均無抑菌作用，而用同一方法檢查未經(jīng)青霉素酶滅活的溶液均有抑菌作用。

第19頁,共42頁，星期六，2024年，5月第20頁,共42頁，星期六，2024年，5月二、藥物中有效物質含量測定（1）容量法：容量分析是依據(jù)已知濃度的標準試劑溶液與被測定的一定量供試品藥物完全作用所消耗的標準試劑的體積，來計算被測定藥物中有效物質含量的方法。在抗生素類藥物分析中，常用的有酸堿滴定法、碘量法。青霉素含量的測定,青霉素在水溶液中經(jīng)水解后，產(chǎn)生青霉噻唑酸，可用酸堿滴定法測定。或用直接滴定法，或用逆滴法進行測定，最后均以堿標準溶液的消耗量來計算青霉素的含量。第21頁,共42頁，星期六，2024年，5月終點觀察：用目視指示劑或電位滴定均可。溫度對指示劑的變色范圍有影響。堿性指示劑，溫度升高時，對氫離子的靈敏度降低，變色范圍偏向較低的pH值，如甲基橙在室溫時為pH3.1～4.4，在100℃時，移到2.5～3.7。酸性指示劑對溫度的影響不太敏感。指示劑的用量不宜多，過多時，因指示劑本身也消耗酸或堿，變色較慢。在水溶液中，大部分羧酸在pH約8.4時中和，一般可用酚酞指示劑（無色到紅色），也可采用百里酚酞（無色到藍色）或百里酚藍（黃色到藍色）等。滴定劑的選擇，一般選用氫氧化鈉或氫氧化鉀標準溶液作滴定劑。標準堿液一般采用新沸冷卻蒸餾水進行稀釋制備。貯存標準堿液的容器要密封，以免吸收二氧化碳而影響堿液質量。青霉素鈉的含量測定精密稱取本品約0.3～0.4g，加新沸過的蒸餾水20mL使其溶解，加0.01mol/L氫氧化鈉液中和后，精密加0.1mol/L氫氧化鈉液25mL，95℃左右水浴20min。冷卻后，加酚酞指示劑2滴，用0.1mol/L鹽酸滴定，從粉紅色至無色。不加供試樣品作為空白，重復以上操作。兩者滴定數(shù)的差即為所消耗氫氧化鈉的量。第22頁,共42頁，星期六，2024年，5月（2）光譜學測定法

①旋光法:平面偏振光通過含有某些光學活性的化合物液體或溶液時，能引起旋光現(xiàn)象，使偏振光的平面向左或向右旋轉。偏振光平面旋轉的度數(shù)，稱為旋光度。使偏振光向右旋轉（順時針方向）為右旋，以“＋”符號表示；使偏振光向左旋（逆時針方向）為左旋，以“－”符號表示。偏振光透過長1dm并每1mL中含有旋光物質1g的溶液，在一定波長與溫度下測得的旋光度稱為比旋度。旋光法亦用于紅霉素、螺旋霉素等的效價測定。②分光光度法:紫外分光光度法多用于抗生素制劑中抗生素含量的測定。如測定奧格門?。◤秃现苿┲辛u氨芐青霉素和克拉維酸的含量；測定麥迪霉素膠囊中麥迪霉素的含量；用金屬離子絡合物測定土霉素制劑中的土霉素含量等等。比色法用于多種抗生素的效價測定。如青霉素和頭孢菌素的羥胺比色法測定抗生素效價；鏈霉素的麥芽酚法測定鏈霉素效價；三氯化鐵比色法測定土霉素效價等。第23頁,共42頁，星期六，2024年，5月③色譜法測定法色譜法在抗生素藥物分析中，主要用于鑒別定性及定量（如雜質、異構體的限度試驗和組分分析）。第24頁,共42頁，星期六，2024年，5月④高效液相測定法：在每種抗生素進行檢測前要求對儀器進行系統(tǒng)適應性試驗，即用規(guī)定的對照品對儀器進行試驗和調整，應達到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子。高效液相色譜在抗生素類藥物的定性、定量分析中應用的愈來愈多，如半合成青霉素的衍生物的含量測定。（3）碘量法（剩余碘量法）

原理

*β－內酰胺類不直接與碘反應*β－內酰胺類水解產(chǎn)物可與碘發(fā)生定量反應：

第25頁,共42頁，星期六，2024年，5月取裝量差異項下的內容物，精密稱取約0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氫氧化鈉溶液1ml放置20分鐘，再加1mol/L鹽酸溶液1ml與醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）5ml,精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，搖勻，在20~25℃暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定，近終點時加淀粉指示液，繼續(xù)滴定并強力振搖，至藍色消失；另精密量取供試品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，搖勻，在暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定，作為空白。同時用青霉素對照品同法測定作對照，算出供試品的含量。第26頁,共42頁，星期六，2024年，5月（4）電位配位滴定法——汞量法1.原理*β－內酰胺類不直接與汞鹽反應*β－內酰胺類水解產(chǎn)物可與汞鹽2.青霉胺發(fā)生定量反應：青霉素藥物與硝酸汞發(fā)生絡合反應。先按2分子青霉胺與1分子汞離子的比例絡合，發(fā)生第一次滴定突躍，但突躍范圍很小，變化比較平緩，不宜用于做終點，繼續(xù)用硝酸汞滴定時，青霉胺分子與汞離子按1:1的比例絡合，生成穩(wěn)定的絡合物——青霉胺絡汞，發(fā)生第二次滴定突躍。其突躍范圍較大，變化較急劇，宜于確定終點。計算青霉素胺含量并進行結果討論：（1）電位法指示終點，以第二次滴定突躍為終點反應摩爾比1:1（2）空白試驗用未降解樣品測定（3）優(yōu)點不需標準品第27頁,共42頁，星期六，2024年，5月三、抗生素效價測定和微生物檢定法1、稀釋法：稀釋法是抗生素效價測定最簡單的方法之一。一般是在一系列的試管中用液體培養(yǎng)基逐管將抗生素做2倍稀釋，并于各個試管中加入同量的對該抗生素有高度敏感性的試驗菌液。將各個試管放置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察能抑制細菌生長的最低抗生素濃度作為測定終點。再與同法測得的抗生素標準品終點做比較，即可求得被測定抗生素的效價。第28頁,共42頁，星期六，2024年，5月2、比濁法：細菌生長產(chǎn)生的濁度與細菌數(shù)的增加、細菌群體質量的增加和細菌細胞容積的增加之間，存在著相關性，在一定的范圍內符合比耳定律。將抗生素標準品的稀釋液與供試品的稀釋液分別加入試管中，再加入已接種試驗菌的液體培養(yǎng)基，搖勻，置37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察試驗菌生長情況。由于抗生素濃度不同，試驗菌受抑制的程度也不同，因而產(chǎn)生不同程度的混濁。用分光光度計測定其透光率或吸收度，用標準曲線法可測定出供試品的效價。取每mL含24.0、26.8、29.9、33.5和37.5U的鏈霉素標準品溶液各1mL，分別加入15支試管中(3個平行)。另取試管3支，每管中各加入供試品溶液1mL。于18支試管中各加入已接種試驗菌的液體培養(yǎng)基9mL，搖勻。將標準品管和供試品管置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4h后，取出，分別于每管中各加入12％甲醛溶液0.5mL，搖勻，即可于分光光度計上530nm處以未接種試驗菌的液體培養(yǎng)基9mL，加蒸餾水1mL，12％甲醛溶液0.5mL，搖勻作為空白，測定各管內培養(yǎng)物的透光率。以透光度為縱坐標，鏈霉素濃度為橫坐標繪制標準曲線，則可在標準曲線上查出供試品的效價。第29頁,共42頁，星期六，2024年，5月3、瓊脂擴散法：（即管碟法)管碟法是目前國際上測定抗生素效價的通用方法。我國藥典收載的微生物檢定法也是管碟法。此法靈敏度高，但操作較麻煩，影響試驗結果的因素較多，需要從各個操作步驟嚴格控制試驗條件，盡可能減小試驗誤差，才能使試驗結果達到精密、準確。第30頁,共42頁，星期六，2024年，5月管碟法的原理：管碟法是利用抗生素在攤布特定試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基內擴散，形成含一定濃度抗生素的球型區(qū)，抑制了試驗菌的繁殖，通過透明瓊脂培養(yǎng)基，可觀察到透明的抑菌圈。在一定的抗生素濃度范圍內，對數(shù)濃度（劑量）與抑菌圈面積或直徑成正比。方法設計是在同樣條件下將已知效價的標準品溶液與未知效價的供試品溶液的劑量反應（抑菌圈）進行比較；當標準品和供試品是屬于同一性質的抗生素時，標準品溶液和供試品溶液，對一定試驗菌所得的劑量反應曲線，在一定劑量范圍內應互相平行。根據(jù)以上原理，可設計為一劑量法、二劑量法及三劑量法等，從而可以較為準確地測定供試品的效價。第31頁,共42頁，星期六，2024年，5月四、青霉素藥物雜質檢查高分子雜質——分子量大于青霉素藥物本身的雜質總稱。外源性雜質蛋白、多肽、多糖或抗生素與蛋白、多肽、多糖的結合物。主要來自于發(fā)酵工藝，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。雜質分類：基本特點－對青霉素而言,青霉噻唑多肽－外源性的（2400～3500）青霉素聚合物－內源性的（聚合度）母核參與的聚合反應－N型聚合反應,側鏈參與的聚合反應－L型聚合反應,特點：第32頁,共42頁，星期六，2024年，5月（1）生產(chǎn)過程中的任何蛋白或碎片都可帶入產(chǎn)品中，易與藥物形成多肽類雜質（2）形成的聚合物也可發(fā)生不同程度的降解（3）異構體之間可以相互聚合－L-L、D-D、L-D（4）高分子雜質與生產(chǎn)工藝密切相關第33頁,共42頁，星期六，2024年，5月高分子雜質的控制方法1、凝膠色譜－自身對照外標法*凝膠色譜法：利用凝膠的分子篩作用，讓藥物分子自由的進入到凝膠顆粒內部，而高分子雜質被排阻的原理進行的。故此大分子則先流出色譜柱，小分子后出峰而得以分離。*分析方法：1、HPLC系統(tǒng)2、簡單測定系統(tǒng)3、色譜適用性條件：（1）藍色葡聚糖在高分子分離中的N＞2500/m，拖尾因子0.75～1.5（2）峰面積的RSD＜5％第34頁,共42頁，星期六，2024年，5月2、分子排阻色譜法

【檢查】青霉素聚合物填充劑葡聚糖凝膠G-10（40~120μm）