羊地方性流產(chǎn)診斷技術(shù)-編制說明

注：提交時(shí)黑色和藍(lán)色字均不可刪減。沒有的應(yīng)寫“無”。

一、工作簡(jiǎn)況

（一）任務(wù)來源

本項(xiàng)目由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局提出，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為2022年國家標(biāo)準(zhǔn)制

修訂項(xiàng)目計(jì)劃，任務(wù)編號(hào)20220275-T-326。

羊地方性流產(chǎn)又稱羊衣原體病，是由流產(chǎn)衣原體引起的一種傳染病，以發(fā)熱、

流產(chǎn)、死產(chǎn)和產(chǎn)下生命力不強(qiáng)的弱羔為主要特征。人可能通過接觸感染性流產(chǎn)物

或分娩物或在實(shí)驗(yàn)室處理衣原體培養(yǎng)物時(shí)不小心受到感染，從而導(dǎo)致亞臨床感染，

甚至發(fā)生急性流感樣疾病。懷孕后期羊的地方性流產(chǎn)已在世界上許多養(yǎng)羊地區(qū)引

起嚴(yán)重的繁殖損失。

WOAH將該病列為法定報(bào)告疫病，我國將其列為三類動(dòng)物疫病。我國還沒

有羊地方性流產(chǎn)診斷技術(shù)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)的制定，將規(guī)范羊地方性流產(chǎn)的診

斷，及時(shí)確診羊地方性流產(chǎn)，提出人間流產(chǎn)衣原體的預(yù)警，抵制境外勢(shì)力生物武

器的襲擊，保障我國的國防安全。

（二）起草單位和主要起草人及其所做的工作

中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心接到此任務(wù)后，成立了項(xiàng)目組并開展國家標(biāo)準(zhǔn)

的制定工作，在項(xiàng)目實(shí)施過程中，山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院、安徽科技學(xué)院、

廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心作為合作單位參與了標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)。參

與制定本標(biāo)準(zhǔn)的人員如下：

孫翔翔中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心項(xiàng)目主持、標(biāo)準(zhǔn)起草；

孫淑芳中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心技術(shù)指導(dǎo)、征求意見；

孫明軍中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心樣品檢測(cè)、方法復(fù)核；

樊曉旭中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心樣品檢測(cè)、方法復(fù)核；

劉蒙達(dá)中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心方法復(fù)核、征求意見；

張皓博中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心方法復(fù)核、征求意見；

焉鑫中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心方法復(fù)核、征求意見；

1

田莉莉中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心方法復(fù)核、征求意見；

孫世雄中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心方法復(fù)核、征求意見；

王金良山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院方法復(fù)核、征求意見；

張訓(xùn)海安徽科技學(xué)院方法復(fù)核、征求意見；

熊毅廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心方法復(fù)核、征求意見；

何奇松廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心方法復(fù)核、征求意見；

邵衛(wèi)星中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心技術(shù)指導(dǎo)；

范偉興中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心技術(shù)指導(dǎo)。

（三）主要工作過程

1.起草階段

標(biāo)準(zhǔn)起草階段得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“重大動(dòng)物源性病原體傳入風(fēng)險(xiǎn)

評(píng)估和預(yù)警技術(shù)研究(2017YFC1200500)”的支持，項(xiàng)目組在前期查閱資料的

基礎(chǔ)之上，啟動(dòng)本標(biāo)準(zhǔn)的起草工作。編寫過程中主要參考了世界動(dòng)物衛(wèi)生組

織（WOAH）發(fā)布的《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》關(guān)于羊地方性流產(chǎn)

（ManualofDiagnosticTestsandVaccineforTerrestrialAnimals，part3section

3.8chapter3.8.5ENZOOTICABORTIONOFEWES(OVINE

CHLAMYDIOSIS)(INFECTIONWITHCHLAMYDIOSISABORTUS）和中

國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所發(fā)布的《動(dòng)物衣原體病診斷技術(shù)》（N/T

562-2015）等國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)法規(guī)。

起草人與德國細(xì)菌感染和人獸共患病研究所衣原體病實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人聯(lián)

系，就羊地方性流產(chǎn)的診斷技術(shù)征求意見，得到的反饋是德國的技術(shù)與

WOAH推薦的診斷技術(shù)基本一致，在實(shí)驗(yàn)室中目前應(yīng)用最多的方法是熒光

定量PCR方法和ELISA方法。結(jié)合國際專家的意見，同時(shí)綜合考慮WOAH

手冊(cè)規(guī)定和我國的實(shí)際情況，最終在標(biāo)準(zhǔn)的起草過程中，加入了常規(guī)PCR、

熒光定量PCR和ELISA等方法。

起草標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，項(xiàng)目組就羊地方性流產(chǎn)試驗(yàn)方法的適用性在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)

進(jìn)行了重復(fù)性試驗(yàn)，先后進(jìn)行了常規(guī)PCR、熒光定量PCR和ELISA等診斷

方法的驗(yàn)證工作，證實(shí)了這些試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性與可靠性。

2.征求意見階段

2

在上述資料收集分析、試驗(yàn)研究、驗(yàn)證試驗(yàn)的基礎(chǔ)上形成了標(biāo)準(zhǔn)征求意

見稿。并于2020年在國內(nèi)單位征求意見。征求意見的單位包括中國動(dòng)物衛(wèi)

生與流行病學(xué)中心、北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、中國動(dòng)物疫病預(yù)防

控制中心和安徽科技學(xué)院等4家單位，這些單位包括了科研院所、大專院校

和疫病控制機(jī)構(gòu)等有關(guān)方面。4家單位返回意見的有4家單位，4家單位對(duì)

征求意見稿共提出27條修改建議。這些修改建議主要集中在以下幾個(gè)方面：:

一是格式方面的建議，如數(shù)字與單位之間的空格不規(guī)范等，起草者對(duì)這類建

議全部接受，并利用國家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)提供的軟件重新對(duì)標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿進(jìn)

行修改，徹底消除標(biāo)準(zhǔn)文本格式不規(guī)范的問題；二是文字方面的建議，這類

建議起草者大部分接受，使本標(biāo)準(zhǔn)的文字?jǐn)⑹龈鼮闇?zhǔn)確和通俗易懂。

3.審查階段（此次不寫本部分）

4.報(bào)批階段（此次不寫本部分）

二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)

（一）標(biāo)準(zhǔn)的編寫原則

主要闡述標(biāo)準(zhǔn)制定或修訂過程遵循的基本原則。

本標(biāo)準(zhǔn)按照標(biāo)準(zhǔn)編制的有關(guān)要求，通過對(duì)大量臨床樣品的檢測(cè)應(yīng)用，對(duì)

標(biāo)準(zhǔn)所述方法進(jìn)行充分驗(yàn)證，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)征求國

內(nèi)各行業(yè)相關(guān)專家意見，力求所修定的標(biāo)準(zhǔn)符合以下原則：（1）科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、

符合行業(yè)實(shí)情和要求，比較成熟，便于應(yīng)用；（2）可操作性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果易

判斷，檢測(cè)效率較高；（3）易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，便于推廣。（4）制定

的國家標(biāo)準(zhǔn)既與國際接軌，又符合我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的實(shí)際情況。不強(qiáng)調(diào)所有檢

測(cè)方法一定是最先進(jìn)的技術(shù)和最先進(jìn)的方法。

（二）提出本標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)

主要內(nèi)容包括技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則等。

依據(jù)包括試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。尤其注意本條不要寫成任務(wù)來源。

本標(biāo)準(zhǔn)的提出是由于國際上擁有羊地方性流產(chǎn)診斷技術(shù)，我國農(nóng)業(yè)發(fā)展

現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)缺乏相關(guān)內(nèi)容。參考WOAH發(fā)布的《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗

手冊(cè)》和德國衣原體病參考實(shí)驗(yàn)室操作SOP，中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心

提出制定本標(biāo)準(zhǔn)。

3

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法。由于PCR方法具有較高的敏感性和特

異性，利用PCR擴(kuò)增衣原體DNA，是檢測(cè)生物樣品中衣原體的一種方法。

根據(jù)培養(yǎng)特性、流行病學(xué)特征和毒力，可將衣原體分為13個(gè)種，分別為流

產(chǎn)衣原體、鸚鵡熱衣原體、家畜衣原體、豚鼠衣原體、沙眼衣原體、肺炎衣

原體、貓屬衣原體、鼠衣原體、雞衣原體、豬衣原體和鳥衣原體等，其中能

引起羊地方性流產(chǎn)的主要是流產(chǎn)衣原體。該P(yáng)CR主要應(yīng)用CH1和CH2等2

條引物，其靶基因是衣原體外膜蛋白pmp基因特異性引物，能鑒定出流產(chǎn)

衣原體、鸚鵡熱衣原體和家畜衣原體。經(jīng)94℃5min的初變性，經(jīng)94℃30

sec、50℃60sec、72℃30sec的30個(gè)循環(huán)，經(jīng)72℃2min延伸后，所有

流產(chǎn)衣原體成員可擴(kuò)增出約300bp片段。

熒光定量PCR方法。熒光定量PCR方法由于其高特異性、快速、高通

量和易于標(biāo)準(zhǔn)化，已成為診斷實(shí)驗(yàn)室的首選方法熒光定量PCR是流產(chǎn)衣原

體定性的重要方法。該熒光定量PCR方法目標(biāo)基因是流產(chǎn)衣原體外膜蛋白

ompA基因，引物為Cb上游和Cb下游，探針為Cb探針，經(jīng)50℃2min

的去污染、95℃2min的初變性，經(jīng)95℃15sec、60℃30sec的45個(gè)循

環(huán)，陽性樣品可見有正弦曲線形成。

ELISA方法?；贚PS或EB抗原的ELISA不能區(qū)分感染家畜衣原體

和流產(chǎn)衣原體的動(dòng)物，但也是羊地方性流產(chǎn)更敏感的初步篩查工具，而基于

合成的MOMP肽、重組的MOMP的ELISA可用來特異性地檢測(cè)抗流產(chǎn)衣

原體抗體。該ELISA方法，用純化的流產(chǎn)衣原體Momp抗原包被酶標(biāo)板，

制成固相抗原，與樣品中的流產(chǎn)衣原體抗體結(jié)合，洗滌后與辣根過氧化物酶

標(biāo)記的抗原結(jié)核，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，加入底物和終止液后，

陽性樣品可見顏色反應(yīng)。

（三）新舊標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比（適用于修訂標(biāo)準(zhǔn)的情況）

三、主要試驗(yàn)或驗(yàn)證的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的

經(jīng)濟(jì)效果

（一）主要試驗(yàn)或驗(yàn)證的分析

本次制定的羊地方性流產(chǎn)診斷技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)主要有兩大類，一類是基于病原的

4

分子生物學(xué)檢測(cè)方法，另一類是基于抗原-抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法。其中病原診

斷技術(shù)方面，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和熒光定量PCR是除了病原分離以外，

應(yīng)用最廣泛的方法，具有敏感性和特異性的特點(diǎn)，尤其適合低微含量樣品的快速

檢測(cè)；免疫學(xué)方法可以通過抗體的檢測(cè)，監(jiān)測(cè)病毒感染情況以及疾病在種群中的

流行趨勢(shì)。

1.基于病原的分子生物學(xué)檢測(cè)方法的建立

1.1主要試劑及耗材血液全核酸提取試劑含(HighPurePCRTemplate

PreparationKit，Roche公司，美國)；核酸提取試劑盒(QIAampDNAMini

Kit,Qiagen公司，美國)；探針（上海生工生物工程股份有限公司）；異丙醇（國

藥）；SuperRealPreMix(Probe)(天根生化科技（北京）有限公司)；2×PromixTaq

（帶染料）(Takara)；4SGreenNucleicAcidStain（上海生工生物工程股份有限公

司）；2000bpDNAMarker(Takara)；

1.2儀器設(shè)備水浴鍋、PCR儀、熒光定量PCR儀、移液器、離心機(jī)。

1.3DNA流產(chǎn)衣原體DNA由德國耶拿細(xì)菌感染和人獸共患病研究所提供

1.4引物由北京睿博興科生物有限公司合成，經(jīng)薄層層析純化。

表1合成的引物序列

名稱5'-3'序列片段長度（bp）特異性靶基因

CH1ATGTCCAAACTCATCAGACGAG

300衣原體科Pmp

CH2CCTTCTTTAAGAGGTTTTACC

Cb-上游GCAACTGACACTAAGTCGGCTACA

ACAAGCATGTTCAATCGATAAGAG

Cb-下游

A82流產(chǎn)衣原體ompA

FAM-TAAATACCACGAATGGCAAGT

Cb-探針

TGGTTTAGCG-TAMRA

1.5PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系如下：

2×PromixTaq（帶染料）12.5μl

DNA5μl

上下游引物（10pmol/μl）各1μl

ddH2O5.5μl

5

總反應(yīng)體系25μl

在PCR管中加入各組分，蓋緊蓋子，漩渦混勻，短暫離心。然后將PCR管

放入PCR儀中，按下列反應(yīng)條件進(jìn)行：

94℃5min

94℃30s

50℃60s30個(gè)循環(huán)

72℃30s

72℃2min

1.6熒光PCR反應(yīng)體系

熒光PCR反應(yīng)體系在PCR管中配制。如果有n個(gè)樣品，同時(shí)配制n＋1

個(gè)反應(yīng)體系，然后分裝于各管。配制時(shí)，依次加入反應(yīng)液12.5μL，引物，

（上游引物：0.5μL；下游引物0.5μL；探針0.25μL），加入DNA樣本3μL，

無菌水補(bǔ)足至25μL。充分混勻后，瞬時(shí)離心，確保所有反應(yīng)成分混勻并集

于管底。

加樣后，置于熒光定量PCR儀內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：50℃2min

預(yù)變性；95℃10min；95℃變性10s，60℃退火延伸60s），45個(gè)循環(huán)。

退火延伸步驟采集熒光。

1.7產(chǎn)物檢測(cè)

PCR產(chǎn)物檢測(cè)取10μL產(chǎn)物加入到2%瓊脂凝膠孔中，以80V電壓進(jìn)行

電泳，電泳結(jié)束后，經(jīng)溴化乙錠(EB，終濃度為0.5μg/mL)染色后，在紫外

線臺(tái)上觀察并拍照，以標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量作參考，分析記錄結(jié)果。

熒光定量PCR產(chǎn)物用熒光定量PCR儀自帶分析軟件對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分

析。

1.8結(jié)果判定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)EB染色后，衣

原體在紫外線下均可見一條大小為300bp的特異性條帶（圖1）。

6

說明：M——DL2000TMMarker，從上往下依次為2000bp、1000bp、750bp、

500bp、250bp、100bp；

1——條帶為陽性對(duì)照；3——陰性對(duì)照；

2——樣本陽性擴(kuò)增結(jié)果；4——空白對(duì)照。

圖1PCR結(jié)果判定示意圖

熒光定量PCR產(chǎn)物陰性對(duì)照無擴(kuò)增曲線，陽性對(duì)照Ct值應(yīng)小于30.0，

并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線則視為該實(shí)驗(yàn)成立。否則此次試驗(yàn)視為無效。在實(shí)驗(yàn)

成立的前提下，若檢測(cè)樣品Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則熒光PCR

結(jié)果為陽性；若檢測(cè)樣品無Ct值且無擴(kuò)增曲線，則熒光PCR結(jié)果為陰性（圖

2）。

1、2—流產(chǎn)衣原體DNA；3—陰性對(duì)照

圖2熒光定量PCR結(jié)果判定示意圖

2.ELISA方法的建立

2.1抗原包被板和酶標(biāo)抗原可購置。

2.22種ELISA方法的比較

2.2.1IDVET試劑盒ELISA操作方法：參照試劑盒操作方法進(jìn)行。主要操作

7

包括將待檢血清使用血清稀釋液進(jìn)行稀釋，加入至酶標(biāo)板中，室溫作用45分鐘，

洗滌后加入酶標(biāo)抗體作用30分鐘；洗滌后加入TMB底物溶液，作用后終止反

應(yīng)，判定結(jié)果。

2.2.2其他品牌試劑盒ELISA操作方法：參照試劑盒操作方法進(jìn)行。主要操

作包括將待檢血清使用血清稀釋液進(jìn)行稀釋，混勻后室溫作用1h；將處理后的

血清加入至酶標(biāo)板中，室溫作用1h，洗滌后加入酶標(biāo)抗體作用1h；洗滌后加入

TMB底物溶液，作用后終止反應(yīng)，判定結(jié)果。

2.2.32種ELISA方法的比較結(jié)果

同時(shí)應(yīng)用2種ELISA方法，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，比較它們的P/N值，以P/N值的大小比較ELISA方

法的優(yōu)劣。結(jié)果IDVET試劑盒的P/N值最高達(dá)30.4，其他品牌P/N值小于IDVET

試劑盒（見表1）。

表1不同試劑盒比較表

標(biāo)準(zhǔn)陽性值（P）標(biāo)準(zhǔn)陰性值（N）P/N值

IDVET試劑盒1.460.04830.4

其他品牌試劑盒0.620.03418.2

2.2.42種ELISA方法檢測(cè)臨床樣品的比較

同時(shí)應(yīng)用2種ELISA方法，檢測(cè)臨床樣品，比較其敏感性和特異性。結(jié)果

IDVET試劑盒的陽性率達(dá)4.41%，其他品牌檢測(cè)陽性率高于IDVET試劑盒（見

表2）。分析判斷其他商品試劑盒適用于衣原體屬的檢測(cè)，敏感性較高；而IDVET

公司的試劑盒特異性較高，適用于篩選陽性個(gè)體。

表2不同試劑盒檢測(cè)臨床樣品表

檢測(cè)數(shù)（份）陽性數(shù)（份）陽性率（%）

IDVET試劑盒6834.41

其他品牌試劑盒685377.9

2.2.5IDVET公司流產(chǎn)衣原體ELISA試劑盒的初步應(yīng)用

應(yīng)用IDvet公司試劑盒對(duì)中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心儲(chǔ)備的部分臨床血清

進(jìn)行檢測(cè)。2020年從全國15個(gè)省份65個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集1784份血清，血清陽性52

份，個(gè)體陽性率2.9%，群體陽性率32.3%；2021年從全國12個(gè)省份76個(gè)養(yǎng)殖

8

場(chǎng)采集2084份血清，血清陽性75份，個(gè)體陽性率3.6%，群體陽性率32.9%。

2.3關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)中ELISA結(jié)果的判定。不同的試劑盒，其判定標(biāo)準(zhǔn)是不一致的。

IDVET試劑盒為當(dāng)陽性對(duì)照OD值＞0.35且P/N值（陽性對(duì)照OD值/陰性對(duì)照

OD值）＞3時(shí)，計(jì)算樣品OD值/陽性對(duì)照OD值（S/P），當(dāng)S/P≥0.6時(shí)判為陽

性，0.5＜S/P＜0.6時(shí)判為可疑，S/P≤0.5時(shí)判為陰性。這種使用P/N值作為對(duì)照

成立的判定條件較少。但通過大量應(yīng)用證實(shí)ELISA的P/N值比單純的P值和N

值更為穩(wěn)定，因此最終在標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用P/N值作為對(duì)照成立的判定依據(jù)。

（二）綜述報(bào)告

衣原體（Chlamydiae）是一類嚴(yán)格真核細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌，具有獨(dú)特的發(fā)育周

期可觀察到兩種不同的形態(tài)：一種是原體（EB），具有較強(qiáng)感染力，無繁殖能力；

另一種是網(wǎng)狀體（亦稱為始體）（RB），RB不具有感染性，在空泡內(nèi)以二分裂方

式增殖成許多代EB。衣原體屬（Chlamydia）包含至少13個(gè)種：沙眼衣原體

（C.trachomatis）、肺炎衣原體（C.pneumoniae）、鸚鵡熱衣原體（C.psittaci）、

鼠衣原體（C.muridarum）、家畜衣原體（C.pecorum）、豬衣原體（C.suis）、鳥

衣原體（C.avium）、禽衣原體（C.gallinacea）、流產(chǎn)衣原體（C.abortus）、豚鼠

衣原體（C.caviae）、貓衣原體（C.felis）和其他未命名衣原體。

流產(chǎn)衣原體是小型反芻動(dòng)物（綿羊、山羊）地方性流產(chǎn)常見的病原，亦能引

起牛、豬等家畜流產(chǎn)。流產(chǎn)衣原體是一種重要人獸共患病的病原體，可以感染孕

婦，使其發(fā)生流產(chǎn)或其他疾病。全世界許多國家都有關(guān)于流產(chǎn)衣原體感染牛的報(bào)

道，如德國、埃及、中國、瑞典等，它也是衣原體中造成經(jīng)濟(jì)損失最大的種型。

目前，中國關(guān)于衣原體的血清學(xué)調(diào)查大多使用間接血凝試驗(yàn)（IHA），且有些血

清學(xué)調(diào)查樣本量太少，從而使這些研究所獲得的結(jié)果經(jīng)常有較大的偏差。

（三）技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證

為了提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)羊地方性流產(chǎn)診斷的水平，通過對(duì)各種引物條件和試劑的

優(yōu)化，先后建立了PCR和熒光定量PCR檢測(cè)方法，以滿足不同實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)條件

的需要。針對(duì)目前衣原體屬有至少13個(gè)種的情況，常規(guī)的流產(chǎn)衣原體DNA的

PCR檢測(cè)方法是以基因序列保守區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)，可以結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性

分析來鑒別擴(kuò)增的DNA序列；熒光定量PCR方法由于其具高特異性、快速、高

通量和易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，已成為診斷實(shí)驗(yàn)室的首選方法，建議首先針對(duì)流產(chǎn)衣

9

原體屬進(jìn)行PCR篩查，在陽性病例中再采用基于外膜蛋白序列的流產(chǎn)衣原體特

異性篩選引物。根據(jù)以上思路，設(shè)計(jì)、篩選并優(yōu)化了1對(duì)能特異性鑒定衣原體屬

的PCR引物和1對(duì)特異性鑒定流產(chǎn)衣原體的熒光定量PCR引物。特異性上與其

它臨床癥狀類似的疾病病原無交叉、無假陽性擴(kuò)增結(jié)果。PCR檢測(cè)出的陽性樣

品在瓊脂糖凝膠電泳300bp處可見明顯條帶，非常容易判定結(jié)果；熒光定量PCR

檢測(cè)到的陽性樣品在2個(gè)小時(shí)內(nèi)可見明顯熒光值，迅速、準(zhǔn)確。經(jīng)大量臨床試驗(yàn)

檢測(cè)，建立的常規(guī)PCR和熒光定量PCR方法，可以檢測(cè)包括綿羊流產(chǎn)胎兒脾臟、

胃液、胎衣和拭子樣品等材料，比涂片鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)方便、快捷。應(yīng)用建

立的方法對(duì)新疆、廣西和山東等地采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，

共檢測(cè)樣品168份，其中5份陽性，陽性率為2.98%。

羊地方性流產(chǎn)的血清學(xué)抗體檢測(cè)通常是用補(bǔ)體結(jié)合方法（CFT）或ELISA

試驗(yàn)，兩種方法的原理都是基于抗原-抗體反應(yīng)，當(dāng)這些檢測(cè)方法采用LPS或全

菌作為抗原時(shí)，對(duì)抗體水平的檢測(cè)往往出現(xiàn)較低的特異性和敏感性。根據(jù)以上思

路，考慮采取針對(duì)外膜蛋白（Momp）的ELISA抗體檢測(cè)。應(yīng)用IDvet公司試劑

盒對(duì)中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心儲(chǔ)備的部分臨床血清進(jìn)行檢測(cè)。2020年從全

國15個(gè)省份65個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集1784份血清，血清陽性52份，個(gè)體陽性率2.9%，

群體陽性率32.3%；2021年從全國12個(gè)省份76個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集2084份血清，血

清陽性75份，個(gè)體陽性率3.6%，群體陽性率32.9%。2021年用其他商品試劑盒

與IDVET公司生產(chǎn)的羊地方性流產(chǎn)診斷試劑盒進(jìn)行血清檢測(cè)，用已知陽性血清

和已知陰性血清比較不同試劑盒檢測(cè)的差異，共檢測(cè)血清68份，初步分析判斷

其他商品試劑盒適用于衣原體屬的檢測(cè)，敏感性較高；而IDVET公司的試劑盒

敏感性與其他試劑盒差別不大，但特異性較高，適用于篩選陽性個(gè)體。基于以上

研究進(jìn)展，我們推薦采用這種ELISA方法，為我國羊地方性流產(chǎn)的診斷防控提

供技術(shù)支持。

（四）預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果

羊地方性流產(chǎn)常規(guī)PCR、熒光定量PCR和ELISA等方法的應(yīng)用，將為羊地

方性流產(chǎn)的診斷提供科學(xué)的方法，有效監(jiān)測(cè)疫病的流行形勢(shì)，并通過流行病學(xué)調(diào)

查、監(jiān)測(cè)與淘汰病畜等綜合防治措施，防止羊地方性流產(chǎn)在我國的蔓延。本標(biāo)準(zhǔn)

涉及的試驗(yàn)必將為有效剔除病畜、減少繁殖損失提供技術(shù)支持，從而產(chǎn)生巨大的

經(jīng)濟(jì)效益。

10

四、采用國際標(biāo)準(zhǔn)和國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度，以及與國際、國內(nèi)同

類標(biāo)準(zhǔn)水平的對(duì)比情況，或與測(cè)試的國外樣品有關(guān)數(shù)據(jù)對(duì)比情況

本標(biāo)準(zhǔn)基本采用了國際標(biāo)準(zhǔn)。WOAH在線網(wǎng)站發(fā)布的《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)

和疫苗手冊(cè)》中，羊地方性流產(chǎn)的診斷方法包括病原分離、PCR、熒光定量PCR

等病原學(xué)檢測(cè)方法以及ELISA等免疫學(xué)檢測(cè)方法，本項(xiàng)目使用的方法，即是根

據(jù)WOAH陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)，參考引進(jìn)的德國耶拿細(xì)菌感染和人獸

共患病研究所國家衣原體病引進(jìn)的PCR方法、熒光定量PCR方法以及商品化的

ELISA診斷方法，在實(shí)驗(yàn)室建立了可以快速確診篩查衣原體科的PCR方法、可

以快速鑒定流產(chǎn)衣原體的熒光定量PCR方法以及用于流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的ELISA試

驗(yàn)方法。這些方法經(jīng)過了多年的應(yīng)用和實(shí)踐驗(yàn)證確實(shí)有效。本標(biāo)準(zhǔn)起草人員在廣

泛征求意見、充分吸收國內(nèi)外經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，本標(biāo)準(zhǔn)最終確定將PCR、熒光

定量PCR和ELISA試驗(yàn)列入標(biāo)準(zhǔn)，由項(xiàng)目參加單位開展了大量的檢測(cè)復(fù)核試驗(yàn)，

對(duì)其參數(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步的修正后引入到本標(biāo)準(zhǔn)中來。

五、與現(xiàn)行的法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系

主要說明標(biāo)準(zhǔn)與相應(yīng)法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)之間的銜接、協(xié)調(diào)情況。列出與

標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)密切相關(guān)的法律法規(guī)、強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的名稱和編號(hào)。

我國尚未出臺(tái)用于羊地方性流產(chǎn)診斷的法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)，本標(biāo)

準(zhǔn)的制定遵循GB/T1.1-2009、《中華人民共和國動(dòng)物防疫法》、《GB/T18088-2000》、

《國家動(dòng)物疫情測(cè)報(bào)體系管理規(guī)范》、《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》、

《動(dòng)物檢疫管理辦法》、《農(nóng)業(yè)部國家（行業(yè)）標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)劃編制、制定和審查管理

辦法》等相關(guān)法律、法規(guī)規(guī)定。

六、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)

說明各方面專家對(duì)標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容（如參數(shù)、指標(biāo)、試驗(yàn)方法）有哪些重大分

歧，以及標(biāo)準(zhǔn)起草單位在修改完善標(biāo)準(zhǔn)過程中，對(duì)專家分歧意見的處理主要依據(jù)

和處理結(jié)果。對(duì)同一方法或問題有不同解決方案的應(yīng)討論出最佳方案。

無。

七、標(biāo)準(zhǔn)性質(zhì)（強(qiáng)制性，推薦性）的建議，特別是對(duì)建議批為強(qiáng)

制性標(biāo)準(zhǔn)的理由應(yīng)充分說明

嚴(yán)格按照立項(xiàng)下達(dá)的性質(zhì)編寫。無需增加解釋文字。建議將本修訂標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)

11

為推薦性標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)批為推薦性標(biāo)準(zhǔn)。

八、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和建議措施（組織實(shí)施、技術(shù)措施、過渡辦

法等）

標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布后，為了有效貫徹實(shí)施之，建議農(nóng)業(yè)農(nóng)村部有關(guān)部門確定培訓(xùn)

對(duì)象，委托標(biāo)準(zhǔn)起草單位舉辦全國技術(shù)培訓(xùn)班，對(duì)有關(guān)技術(shù)人員進(jìn)行相關(guān)技

術(shù)強(qiáng)化操作培訓(xùn)，培訓(xùn)效果要達(dá)到：懂原理、操作熟練、判定準(zhǔn)確，回單位

基本能獨(dú)立工作。

九、廢止現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議；

無。

十、其他應(yīng)予說明的事項(xiàng)。

主要包括標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目任務(wù)完成中有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)名稱變更、對(duì)有爭(zhēng)議問題、遺留問題

處理、尚需探討的問題和制定或修訂配套標(biāo)準(zhǔn)的說明等。

無。

12

注：提交時(shí)黑色和藍(lán)色字均不可刪減。沒有的應(yīng)寫“無”。

一、工作簡(jiǎn)況

（一）任務(wù)來源

本項(xiàng)目由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局提出，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為2022年國家標(biāo)準(zhǔn)制

修訂項(xiàng)目計(jì)劃，任務(wù)編號(hào)20220275-T-326。

羊地方性流產(chǎn)又稱羊衣原體病，是由流產(chǎn)衣原體引起的一種傳染病，以發(fā)熱、

流產(chǎn)、死產(chǎn)和產(chǎn)下生命力不強(qiáng)的弱羔為主要特征。人可能通過接觸感染性流產(chǎn)物

或分娩物或在實(shí)驗(yàn)室處理衣原體培養(yǎng)物時(shí)不小心受到感染，從而導(dǎo)致亞臨床感染，

甚至發(fā)生急性流感樣疾病。懷孕后期羊的地方性流產(chǎn)已在世界上許多養(yǎng)羊地區(qū)引

起嚴(yán)重的繁殖損失。

WOAH將該病列為法定報(bào)告疫病，我國將其列為三類動(dòng)物疫病。我國還沒

有羊地方性流產(chǎn)診斷技術(shù)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)的制定，將規(guī)范羊地方性流產(chǎn)的診

斷，及時(shí)確診羊地方性流產(chǎn)，提出人間流產(chǎn)衣原體的預(yù)警，抵制境外勢(shì)力生物武

器的襲擊，保障我國的國防安全。

（二）起草單位和主要起草人及其所做的工作

中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心接到此任務(wù)后，成立了項(xiàng)目組并開展國家標(biāo)準(zhǔn)

的制定工作，在項(xiàng)目實(shí)施過程中，山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院、安徽科技學(xué)院、

廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心作為合作單位參與了標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)。參

與制定本標(biāo)準(zhǔn)的人員如下：

孫翔翔中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心項(xiàng)目主持、標(biāo)準(zhǔn)起草；

孫淑芳中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心技術(shù)指導(dǎo)、征求意見；

孫明軍中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心樣品檢測(cè)、方法復(fù)核；

樊曉旭中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心樣品檢測(cè)、方法復(fù)核；

劉蒙達(dá)中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心方法復(fù)核、征求意見；

張皓博中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心方法復(fù)核、征求意見；

焉鑫中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心方法復(fù)核、征求意見；

1

田莉莉中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心方法復(fù)核、征求意見；

孫世雄中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心方法復(fù)核、征求意見；

王金良山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院方法復(fù)核、征求意見；

張訓(xùn)海安徽科技學(xué)院方法復(fù)核、征求意見；

熊毅廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心方法復(fù)核、征求意見；

何奇松廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心方法復(fù)核、征求意見；

邵衛(wèi)星中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心技術(shù)指導(dǎo)；

范偉興中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心技術(shù)指導(dǎo)。

（三）主要工作過程

1.起草階段

標(biāo)準(zhǔn)起草階段得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“重大動(dòng)物源性病原體傳入風(fēng)險(xiǎn)

評(píng)估和預(yù)警技術(shù)研究(2017YFC1200500)”的支持，項(xiàng)目組在前期查閱資料的

基礎(chǔ)之上，啟動(dòng)本標(biāo)準(zhǔn)的起草工作。編寫過程中主要參考了世界動(dòng)物衛(wèi)生組

織（WOAH）發(fā)布的《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》關(guān)于羊地方性流產(chǎn)

（ManualofDiagnosticTestsandVaccineforTerrestrialAnimals，part3section

3.8chapter3.8.5ENZOOTICABORTIONOFEWES(OVINE

CHLAMYDIOSIS)(INFECTIONWITHCHLAMYDIOSISABORTUS）和中

國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所發(fā)布的《動(dòng)物衣原體病診斷技術(shù)》（N/T

562-2015）等國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)法規(guī)。

起草人與德國細(xì)菌感染和人獸共患病研究所衣原體病實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人聯(lián)

系，就羊地方性流產(chǎn)的診斷技術(shù)征求意見，得到的反饋是德國的技術(shù)與

WOAH推薦的診斷技術(shù)基本一致，在實(shí)驗(yàn)室中目前應(yīng)用最多的方法是熒光

定量PCR方法和ELISA方法。結(jié)合國際專家的意見，同時(shí)綜合考慮WOAH

手冊(cè)規(guī)定和我國的實(shí)際情況，最終在標(biāo)準(zhǔn)的起草過程中，加入了常規(guī)PCR、

熒光定量PCR和ELISA等方法。

起草標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，項(xiàng)目組就羊地方性流產(chǎn)試驗(yàn)方法的適用性在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)

進(jìn)行了重復(fù)性試驗(yàn)，先后進(jìn)行了常規(guī)PCR、熒光定量PCR和ELISA等診斷

方法的驗(yàn)證工作，證實(shí)了這些試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性與可靠性。

2.征求意見階段

2

在上述資料收集分析、試驗(yàn)研究、驗(yàn)證試驗(yàn)的基礎(chǔ)上形成了標(biāo)準(zhǔn)征求意

見稿。并于2020年在國內(nèi)單位征求意見。征求意見的單位包括中國動(dòng)物衛(wèi)

生與流行病學(xué)中心、北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、中國動(dòng)物疫病預(yù)防

控制中心和安徽科技學(xué)院等4家單位，這些單位包括了科研院所、大專院校

和疫病控制機(jī)構(gòu)等有關(guān)方面。4家單位返回意見的有4家單位，4家單位對(duì)

征求意見稿共提出27條修改建議。這些修改建議主要集中在以下幾個(gè)方面：:

一是格式方面的建議，如數(shù)字與單位之間的空格不規(guī)范等，起草者對(duì)這類建

議全部接受，并利用國家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)提供的軟件重新對(duì)標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿進(jìn)

行修改，徹底消除標(biāo)準(zhǔn)文本格式不規(guī)范的問題；二是文字方面的建議，這類

建議起草者大部分接受，使本標(biāo)準(zhǔn)的文字?jǐn)⑹龈鼮闇?zhǔn)確和通俗易懂。

3.審查階段（此次不寫本部分）

4.報(bào)批階段（此次不寫本部分）

二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)

（一）標(biāo)準(zhǔn)的編寫原則

主要闡述標(biāo)準(zhǔn)制定或修訂過程遵循的基本原則。

本標(biāo)準(zhǔn)按照標(biāo)準(zhǔn)編制的有關(guān)要求，通過對(duì)大量臨床樣品的檢測(cè)應(yīng)用，對(duì)

標(biāo)準(zhǔn)所述方法進(jìn)行充分驗(yàn)證，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)