重組蛋白的分離純化

關于重組蛋白的分離純化基因表達體系1.

原核體系2.

真核體系第2頁,共105頁，星期六，2024年，5月大腸桿菌(Escherichiacoli)遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表達載體種類齊全，表達效率高；基本不分泌，易形成包含體(無正確折疊的立體結(jié)構(gòu))，無加糖等修飾第3頁,共105頁，星期六，2024年，5月枯草桿菌(Bacillussubtilis)分泌蛋白質(zhì)能力強，一般有天然立體結(jié)構(gòu)；無加糖修飾功能，培養(yǎng)液中蛋白酶活性高，重組蛋白易受蛋白酶的水解；質(zhì)粒不穩(wěn)定，尚無商品化的表達載體第4頁,共105頁，星期六，2024年，5月其他乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)蘇云金桿(Bacillusthuringiensis)第5頁,共105頁，星期六，2024年，5月真核細胞表達體系酵母細胞昆蟲細胞哺乳動物細胞/組織植物細胞/組織第6頁,共105頁，星期六，2024年，5月酵母細胞可生產(chǎn)分泌型蛋白；有天然立體結(jié)構(gòu)，有加糖修飾功能；可進行染色體整合型基因表達;糖鏈與哺乳動物加工的不一致，培養(yǎng)上清多糖濃度高;商品化表達體系：

釀酒酵母（Saccharomycecerevisiae）;

畢赤酵母(Pichiapastoris);

裂殖酵母（Schizosaccharomycepombe）第7頁,共105頁，星期六，2024年，5月昆蟲細胞可以病毒感染的型式在成蟲中生產(chǎn)，也可在體外培養(yǎng)細胞中生產(chǎn)蛋白;適合分泌型和膜蛋白的表達，有加糖修飾；糖鏈有所區(qū)別，表達量有限；作為藥物宿主細胞未被FDA認可第8頁,共105頁，星期六，2024年，5月CHO細胞可進行分泌表達，有天然立體結(jié)構(gòu)，加糖方式與人體蛋白質(zhì)完全一致；表達量不夠高，培養(yǎng)成本較高第9頁,共105頁，星期六，2024年，5月動物乳腺組織分泌生產(chǎn)有天然立體結(jié)構(gòu)和活性的蛋白質(zhì)至乳汁，產(chǎn)量高，分離純化方便，特別適合藥用蛋白的生產(chǎn)；轉(zhuǎn)基因動物制作花費巨大，實驗周期長第10頁,共105頁，星期六，2024年，5月鳥類輸卵管組織分泌生產(chǎn)有天然立體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)到蛋清，產(chǎn)量高，容易貯存和運輸，分離純化方便；實驗成本低，飼養(yǎng)費用低；加糖方式可能與人有所不同第11頁,共105頁，星期六，2024年，5月植物組織植物可大面積種植，可以廉價大規(guī)模生產(chǎn)；轉(zhuǎn)基因植物制作費時，表達的組織特異性較難控制；表達量較難提高，分離純化不方便第12頁,共105頁，星期六，2024年，5月體系選擇研究基因功能:

大腸桿菌,裂殖酵母,昆蟲細胞,CHO細胞多肽藥物生產(chǎn):

大腸桿菌,畢氏酵母,CHO細胞,乳腺組織疫苗:

大腸桿菌,酵母,

大多數(shù)沿用細胞培養(yǎng)產(chǎn)物進行滅毒單抗生產(chǎn):

雜交瘤細胞工業(yè)酶生產(chǎn):

各種微生物

第13頁,共105頁，星期六，2024年，5月重組蛋白的分離純化策略

重組蛋白分離純化方法選擇的基因原則針對不同的產(chǎn)物表達形式采取不同的策略針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型多種分離純化技術的聯(lián)合運用合適分離純化介質(zhì)的選擇第14頁,共105頁，星期六，2024年，5月針對不同的產(chǎn)物表達形式采取不同的策略

采用分泌型戰(zhàn)略表達重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進行濃縮處理；采用包涵體型戰(zhàn)略表達重組蛋白，應先離心回收包涵體；采用融合型戰(zhàn)略表達重組蛋白，一般是胞內(nèi)可溶性的，擬首先選用親和層析進行純化表達在細胞膜和細胞壁之間的間隙中的蛋白質(zhì)，應用低濃度的溶菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。第15頁,共105頁，星期六，2024年，5月針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型

等電點處于極端區(qū)域（pI≤5

或

pI≥8）的重組蛋白應首選離子交換法進行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白；

重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親和層析純化方法的重要條件，原則是它們與目標蛋白之間的解離常數(shù)應在合適的范圍內(nèi)（10-8-10-4

mol/L）；疏水層析和反相層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異進行分離的；凝膠過濾層析是根據(jù)蛋白的分子量和體積差異進行分離的；徑向?qū)游鍪墙陙戆l(fā)展起來的集層析分離和膜分離于一體的一種復合技術，在流量、負荷量等參數(shù)方面顯示出極大的優(yōu)越性。第16頁,共105頁，星期六，2024年，5月多種分離純化技術的聯(lián)合運用

在進行重組蛋白的純化時，通常需要綜合使用多種技術，一般來說，在選擇分離純化方法時應遵循下列原則：應選擇不同分離純化機理的方法聯(lián)合使用應首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法應盡量選擇高效的分離方法應將最費時、成本最高的分離純化方法安排在最后階段第17頁,共105頁，星期六，2024年，5月合適分離純化介質(zhì)的選擇

常用的蛋白質(zhì)分離純化介質(zhì)有Sephadex和Seperose。理想的分離純化介質(zhì)應具有下列性質(zhì)：對目標蛋白具有較高的分離效率對目標蛋白不會造成變性化學性能和機械性能穩(wěn)定，重復性好價格低廉第18頁,共105頁，星期六，2024年，5月ProteinpurificationPreparationofthebacteriallysateItisacriticalstep.Optimalconditionsmaximizecelllysisandthefractionoftherecombinantproteinthatisextractedwhileminimizingproteinoxidation,unwantedproteolysisandsamplecontaminationwithgenomicDNA.Thelysisbuffershouldcontainastrongbuffertoovercomethecontributionofthebacteriallysate,highionicstrengthtoenhanceproteinsolubility,proteaseinhibitorsandareducingagentsuchasTECPtopreventoxidationoftheprotein.第19頁,共105頁，星期六，2024年，5月AboutgelfiltrationThechoiceofgelfiltrationasthenextstepafterIMACmaybesurprising,consideringitslowerresolvingpowercomparedwithionexchangeorotheradsorptionchromatographymethods,butthisstepisoftensufficientafterIMACiftheproteinwasabundantinthelysate.Moreover,gelfiltrationismoregeneric,canbeperformedinanybuffercondition,andcanbeusedtoresolvetheoligomerizationstateofthetargetprotein.Superdex75andSuperdex200prepgrade,XK16/60columnsaremostusefulfor1-30mgofproteininasamplevolumeofupto7.5ml.第20頁,共105頁，星期六，2024年，5月第21頁,共105頁，星期六，2024年，5月分泌型戰(zhàn)略表達重組蛋白的分離純化策略要分泌的多肽有一個疏水的氨基突出，它負責向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運這個末端突出通常由大約20個氨基酸組成，并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中從成熟蛋白上剪切下來。人們已經(jīng)利用含有合適重組質(zhì)粒的酵母細胞分泌了大量的非酵母多肽，而且絕大多數(shù)情況下都用到了a-因子信號序列。第22頁,共105頁，星期六，2024年，5月外源基因的表達產(chǎn)物，通過運輸或分泌的方式穿過細胞的外膜進入培養(yǎng)基中，即為分泌型外源蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表達時，須在N端加入15～30個氨基酸組成的信號肽（signalpeptides）序列。信號肽N端的最初幾個氨基酸為極性氨基酸，中間和后部為疏水氨基酸，它們對蛋白質(zhì)分泌到細胞膜外起決定性作用。當?shù)鞍踪|(zhì)分泌到位于大腸桿菌細胞內(nèi)膜與外膜之間的外周質(zhì)時，信號肽被信號肽酶所切割。以分泌型蛋白的形式表達外源基因的優(yōu)點：①分泌型可能使蛋白質(zhì)按適當?shù)姆绞秸郫B，有利于形成正確的空間構(gòu)相，獲得有較好生物學活性或免疫原性的蛋白質(zhì)。甚至有些在細胞內(nèi)表達時無活性的蛋白質(zhì)分泌后則有活性。第23頁,共105頁，星期六，2024年，5月②分泌到細胞外周質(zhì)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物較穩(wěn)定，不易被細胞內(nèi)蛋白酶所降解。③簡化了發(fā)酵后處理的純化工藝。缺點：外源蛋白分泌型表達通常產(chǎn)量不高，有時信號肽不被切割或在不適當?shù)奈恢冒l(fā)生切割。第24頁,共105頁，星期六，2024年，5月人肝再生增強因子在畢赤酵母中的表達、純化和生物學活性的研究1、重組載體的構(gòu)建特導引物設計，以pBV220-ALR質(zhì)粒為模板擴增目的條帶構(gòu)建酵母表達重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115重組蛋白的表達及鑒定rhALR的純化第25頁,共105頁，星期六，2024年，5月rhALR的純化菌液上清經(jīng)低鹽透析后，超過DEAE-SepharoseFF柱的飽和吸附量上樣，洗脫組分脫鹽后再上DEAE-SepharoseFF柱，然后再用SephadesG-75柱進一步純化。第26頁,共105頁，星期六，2024年，5月離子交換瓊脂糖：離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團的SepharoseCL-6B

DEAE-Sepharose（陰離子型）和CM-Sepharose（陽離子型）的離子交換介質(zhì)具有硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強等優(yōu)點尤其是介質(zhì)受pH和離子強度的影響所引起的膨脹和收縮效應較小，因此具有穩(wěn)定的外形體積。第27頁,共105頁，星期六，2024年，5月離子交換介質(zhì)的選擇原則對pI=5的某酸性蛋白質(zhì)當?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時，在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)，應首選DEAE纖維素；當?shù)鞍踪|(zhì)為陽離子時，在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)，應首選CM纖維素12346789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點吸附陰離子交換劑吸附陽離子交換劑pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）第28頁,共105頁，星期六，2024年，5月Whathappensinionexchange?sampleapplicationandwashelutionequilibrationregeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------anionexchangerbead第29頁,共105頁，星期六，2024年，5月++++++-------equilibrationanionexchangerbead第30頁,共105頁，星期六，2024年，5月-----------++++++----sampleapplicationandwash第31頁,共105頁，星期六，2024年，5月----------------------------------++++++++++++--elution第32頁,共105頁，星期六，2024年，5月-----------------------++++++regeneration第33頁,共105頁，星期六，2024年，5月離子交換層析的基本操作層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的2倍平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速平衡終點以流出液的離子濃度、導電性、pH值與緩沖液一致為準，其中pH值最重要第34頁,共105頁，星期六，2024年，5月離子交換層析的基本操作樣品進柱為了達到滿意的分離效果，進樣量一般為介質(zhì)交換容量的10-20%為了避免進樣溶液中的離子強度過高，樣品濃度不宜太高交換容量：離子交換劑中全部可交換的離子或功能基團的總數(shù)第35頁,共105頁，星期六，2024年，5月離子交換層析的基本操作樣品洗脫恒定洗脫階段洗脫梯度洗脫102030405060708090分子濃度離子強度pH值第36頁,共105頁，星期六，2024年，5月陰離子交換法色譜條件：DEAE-SepharoseFF陰離子交換填料；XK26/20色譜柱，體積89.32ml;8ml/min;0.2靈敏度A液：5ommol/LTris-Hcl(pH8.0)B液：50mmol/LTris-Hcl+1mol/NaCl(pH8.0)以A液為平衡液，B液為100%洗脫液，各洗脫濃度由PharmaciaFPLC系統(tǒng)自動將A液和B液混合產(chǎn)生。第37頁,共105頁，星期六，2024年，5月陰離子交換層析：透析上清超過飽和吸附量上樣后，目的蛋白主要集中在0.1mol/LNaCl洗脫峰，但還含有很多雜質(zhì)；在1mol/LNaCl洗脫峰中只存在少量目的蛋白超飽和上樣的0.1mol/LNaCl洗脫峰脫鹽后再上樣，目的蛋白集中在0.2mol/LNaCl洗脫峰，雜質(zhì)含量已較少。第38頁,共105頁，星期六，2024年，5月第39頁,共105頁，星期六，2024年，5月凝膠層析凝膠層析的基本原理凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)凝膠介質(zhì)的選用原則凝膠層析的基本操作第40頁,共105頁，星期六，2024年，5月凝膠層析的基本原理

凝膠層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對混合物中各組份按分子大小進行分離的層析技術，又稱為分子篩分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，會被全部排阻在凝膠顆粒之外，即全排阻；兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能分開；它們下行速度快分子直徑比凝膠最小孔隙直徑小的，能進入凝膠顆粒的全部孔隙即使大小不同也不能分開；它們的下行速度慢鑒于上述原理，凝膠層析可用于重組蛋白溶液脫鹽、分子量測定以及分離純化。第41頁,共105頁，星期六，2024年，5月凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)葡聚糖凝膠的種類有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150G200，G50即表示每克干凝膠的吸水量為5.0毫升葡聚糖凝膠對堿比較穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中其糖苷鍵易水解濕態(tài)的葡聚糖可加熱到110℃，干的則能耐受120℃高溫葡聚糖凝膠（Sephadex）SephadexLH是羥丙基化的Sephadex，這類層析介質(zhì)的流動相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機溶劑，因此適用于非水溶性溶

質(zhì)的凝膠過濾

第42頁,共105頁，星期六，2024年，5月凝膠介質(zhì)的選用原則將樣品中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開，稱為組別分離，其分離策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。組別分離一般選用SephadexG-25或G-50，對于小肽和低分子量的物質(zhì)（分子量范圍1000-5000）的脫鹽可選用SephadexG-10、G-組別分離15、Bio-GelP-2或P-4第43頁,共105頁，星期六，2024年，5月將樣品中一些分子量比較接近的物質(zhì)分開，這種分離叫分級分離該策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。分級分離一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠在層析過程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，但由分級分離于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。第44頁,共105頁，星期六，2024年，5月凝膠層析的基本操作平衡溶液的流速應低于層析時需要的流速注意凝膠的斷層和氣泡層析柱平衡操作壓控制平衡和洗脫時應維持流速恒定恒定的操作壓是恒流的先決條件第45頁,共105頁，星期六，2024年，5月上柱樣品溶液的體積根據(jù)分離要求來確定：進樣體積進行組別分離時，樣品溶液最大可為柱體積的10%進行分級分離時，樣品溶液的體積要小，使樣品層盡可能窄，這樣洗脫出的峰形好第46頁,共105頁，星期六，2024年，5月凝膠色譜層析色譜條件：SephadexG-75凝膠填料；XK16/80色譜柱，體積160.75ml;1ml/min;0.2靈敏度。洗脫液：0.9%NaCl(pH5.5)第47頁,共105頁，星期六，2024年，5月洗脫第1峰主要為rhALR四聚體；洗脫第2峰為目的蛋白峰，rhALR二聚體，純度大于95%，rhALR最后得率為52%。第48頁,共105頁，星期六，2024年，5月包涵體型戰(zhàn)略表達重組蛋白的分離純化策略包涵體：在一定條件下，外源基因的表達產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地集中在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱為包涵體。包涵體存在部位：細胞質(zhì)、細胞周質(zhì)第49頁,共105頁，星期六，2024年，5月包涵體的組成蛋白質(zhì)非蛋白質(zhì)外源基因的表達產(chǎn)物：占大部分，具有正確的氨基酸序列，但空間構(gòu)相錯誤，因而包涵體蛋白一般沒有生物學活性。受體細胞本身的表達產(chǎn)物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表達載體編碼的蛋白等。：包括DNA、RNA和脂多糖等。包涵體形成的本質(zhì)——是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集，主要包括三個方面：①折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；②非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；③蛋白質(zhì)折疊中間體的作用。第50頁,共105頁，星期六，2024年，5月當重組蛋白以包涵體形式存在時，可獲得高表達、高純度的重組蛋白，避免蛋白酶對外源蛋白的降解，但不具有生物活性。

要對其進行分離純化，就需要對包涵體進行變復性處理。然而不論以那種表達形式產(chǎn)生的重組蛋白。其純化的方法都與傳統(tǒng)的生物大分子分離方式相似。包涵體的分離純化也是利用其物理和化學性質(zhì)的差異。即以分子的大小、形狀、溶解度、等電點、親疏水性以及與其它分子的親和性等性質(zhì)建立起來的。由于包涵體難溶，必須首先將其溶解后才能進行蛋白純化，可以用變性劑(尿素或鹽酸胍)溶解包涵體，這樣獲得的重組蛋白產(chǎn)量雖高，卻會破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，需經(jīng)蛋白復性才可能恢復它的生物活性。包涵體的分離純化第51頁,共105頁，星期六，2024年，5月主要方法金屬親和層析凝膠過濾層析離子交換層析疏水層析雙水相萃取技術反膠團相轉(zhuǎn)移技術第52頁,共105頁，星期六，2024年，5月Interactionbetweenneighboringresiduesinthe6

HistagandNi-NTAmatrix第53頁,共105頁，星期六，2024年，5月第54頁,共105頁，星期六，2024年，5月第55頁,共105頁，星期六，2024年，5月PurificationmechanismofrecombinantHis-tagged

proteinsAdvantages:easytoidentifyandpurify第56頁,共105頁，星期六，2024年，5月人細胞周期蛋白D1在大腸桿菌BL21中的表達及純化1原核表達載體的構(gòu)建pUC118-cycDpET-28c(+)EcoRIT4DNA連接酶pET-28c-cycDDH5α,鑒定克隆子閱讀框架的正確性第57頁,共105頁，星期六，2024年，5月第58頁,共105頁，星期六，2024年，5月2融合基因在大腸桿菌中的誘導表達pET-28c-cycD提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入BL21表達宿主30μg/mlKan,LB37℃過夜培養(yǎng)，之后按1：100轉(zhuǎn)接OD600=0.6IPTG=0.1mmol/L誘導表達，每隔1小時取樣，確定最佳時間為4小時第59頁,共105頁，星期六，2024年，5月pET-28c-cycD轉(zhuǎn)化的菌株經(jīng)IPTG誘導后在分子量約43000處出現(xiàn)一條蛋白條帶。灰度掃描分析表明目的基因在IPTG誘導4h后表達量最大，約占菌體總蛋白的23％。分別對表達菌體的裂解上清和沉淀進行12％SDS分析，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要分布在裂解沉淀中，說明表達的CyclinD1蛋白以包涵體形式存在。第60頁,共105頁，星期六，2024年，5月3包涵體的洗滌與變性大量誘導表達后，離心收集菌體0.1倍培養(yǎng)物體積的溶液A懸浮超聲裂菌4000g于4℃

離心15min，回收的沉淀即為粗制包涵體0.5％TritonX-100和2mol／L尿素的磷酸緩沖液依次洗滌懸于溶液B攪拌溶解1h12500g，30min離心，收集上清第61頁,共105頁，星期六，2024年，5月溶液A：20mmol/L磷酸鈉，500mmol/LNaCl，10mmol/L咪唑，0.1mmol/LPMSF，1mmol/L巰基乙醇，pH=7.4磷酸緩沖液:20mmol/L磷酸鈉,500mmol/LNaCl，pH=7.4溶液B:8mol/L尿素，20mmol/L磷酸鈉500mmol/LNaCl，10mmol/L咪唑，0.1mmol/LPMSF，1mmol/L巰基乙醇，pH=7.4第62頁,共105頁，星期六，2024年，5月重組菌制備包涵體經(jīng)洗滌后，用8mol/L尿素變性，加到HisTrapHPNi螫合親和層析柱上，利用咪唑置換，洗脫下特異結(jié)合的蛋白。洗脫蛋白經(jīng)12％的SDS—PAGE分析表明，純化的表達產(chǎn)物在分子量430o0處顯示出一條蛋白帶，凝膠薄層掃描分析純度達98％以上。第63頁,共105頁，星期六，2024年，5月4目的蛋白的親和層析純化和復性變性上清微孔濾膜過濾預先用溶液B平衡過HisTrapHP柱l0倍柱體積的緩沖液Bl0倍柱體積的緩沖液C洗柱5倍柱體積緩沖液D特異性洗脫，分步收集，每管約1mL第64頁,共105頁，星期六，2024年，5月緩沖液C：緩沖液B中含20mmol/L咪唑緩沖液D:緩沖液B中含500mmol/L咪唑第65頁,共105頁，星期六，2024年，5月收集液進行12％的SDS檢測合并含有目的蛋白的各管樣品，適當稀釋，裝入透析袋復性含6mol／L尿素的磷酸緩沖液4℃透析過夜分別用4mol/L,3mol/L,2mol/L,1mol/L,0.5mol/L的梯度透析各4h以上PBS緩沖液透析過夜蛋白溶液在44℃下12500g離心20min上清即為可溶性復性蛋白，凍干后備用第66頁,共105頁，星期六，2024年，5月純化的目的蛋白采取逐步降低尿素濃度的分段透析復性方法，除去蛋白溶液中的尿素，使變性的蛋白在此過程中自然復性，獲得復性的重組CyclinD1蛋白的純度達-98％以上．第67頁,共105頁，星期六，2024年，5月Westernblot檢測表達產(chǎn)物BL21(DE3)菌裂解液,誘導4h的轉(zhuǎn)化菌裂解液,純化的融合蛋白SDS電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上封閉抗CyclinD1單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG進行孵育二氨基聯(lián)苯二胺(DAB)顯色第68頁,共105頁，星期六，2024年，5月第69頁,共105頁，星期六，2024年，5月融合表達蛋白的分離純化

與純化包涵體相比，細胞質(zhì)中以可溶性形式表達蛋白質(zhì)的分離純化過程比較復雜，一般要通過親合層析才能達到比較高的純度。目標蛋白與有親合配基的序列融合表達既可以提高分離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標蛋白。金黃色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白，His-tag等是目前常用的與目標基因融合表達的序列。第70頁,共105頁，星期六，2024年，5月第71頁,共105頁，星期六，2024年，5月第72頁,共105頁，星期六，2024年，5月表達融合蛋白的優(yōu)點(1)融合蛋白較穩(wěn)定，不易被細菌蛋白酶水解。(2)如果大腸桿菌的結(jié)構(gòu)基因是一段信號肽，可產(chǎn)生分泌型產(chǎn)物。(3)可利用針對原核部分的單抗進行親和層析，便于純化。(4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，釋放出天然的真核蛋白質(zhì)。(5)目的蛋白溶解性好，由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性。第73頁,共105頁，星期六，2024年，5月節(jié)桿菌乙內(nèi)酰脲水解酶與GST蛋白融合表達及純化GST結(jié)合位點第74頁,共105頁，星期六，2024年，5月GST-融合蛋白的表達和純化流程第75頁,共105頁，星期六，2024年，5月結(jié)核分枝桿菌16kDa與GST融合表達及純化1、16kDa基因的擴增與表達載體的構(gòu)建設計帶有酶切位點的上下游引物5’-TCAGAATTCATGAAGCTCACCACAATGA-3’(EcoRI)5’-TCACTCGACCTACGGCTCCCAAATCAGC-3’(SalI)擴增目的基因雙酶切產(chǎn)物及載體pGEX-6P-1連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a及JM109感受態(tài)細胞雙酶切及測序驗證第76頁,共105頁，星期六，2024年，5月第77頁,共105頁，星期六，2024年，5月第78頁,共105頁，星期六，2024年，5月2、融合蛋白在大腸桿菌中的表達挑取陽性克隆接種于LA培養(yǎng)基活化37℃，200r/min,6h分別取50

μL轉(zhuǎn)接于5mLLA37℃,OD6000.5-0.8加入IPTG1mmol/L

每隔1h收集菌體重懸菌體SDS檢測取少量培養(yǎng)物，離心收集沉淀（作為空白對照）37℃，230r/min,3h第79頁,共105頁，星期六，2024年，5月第80頁,共105頁，星期六，2024年，5月3、融合蛋白的純化收集菌體重懸于裂解液，超聲裂菌，離心取上清加入4mL谷胱甘肽樹脂顆粒4℃,230r/min結(jié)合3h離心去上清，加入PBS混勻，離心去上清洗滌5次沉淀中加入GST660μL4℃,230r/min,10min離心，上清即為純化蛋白裂解液：PBS,PMSF:5mg/mL，DTT:5mg/mL,Tween20:10mg/mL，溶菌酶:10mg/mL第81頁,共105頁，星期六，2024年，5月第82頁,共105頁，星期六，2024年，5月Astrategyforhigh-levelexpressionofsolubleandfunctionalhumaninterferonaasaGST-fusionproteininE.coliConstructionofrecombinantpGEX-hIFNa2bexpressionvectorhINFa2bcDNAwasclonedbyanRT–PCRapproachusingmRNApreparedfromhealthyindividualleukocytesexposedinvitrototheNewcastlediseasevirusThecDNAcorrespondingtotheIFNa2bpublishedsequencewasamplifiedusingaforwardprimerthatintroducedanEcoRIsiteatthe5’endofthegene(5’-TGGAATTCTGTGATCTGCCTCAAACCCA-3’)andareverseprimercontainingtheXhoIsiteatthe30endofthegene(5’-CGCTCGAGTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC-3’)purifiedPCRproductdigestedwithEcoRIandXhoIrestrictionenzymesinsertedintotheplasmidpGEX4T1第83頁,共105頁，星期六，2024年，5月ScreeningofpGEX4T1/IFNa2brecombinantplasmidscontainingthecDNAsequenceencodinghIFNa2bwasperformedbyarestrictionmappinganalysisusingBglIIrestrictionthenucleotidesequenceoftheselectedcloneswascheckedbyautomatedDNASequencingAnalysisusingthe‘ABI-PRISM377’DNAsequencer第84頁,共105頁，星期六，2024年，5月ConstructionofrecombinantpGEX-D-hIFNa2bexpressionvectorThepGEX-hIFNa2bexpressionvectorwasusedastheDNAtemplateforsite-directedmutagenesis?F(TGTGATCTGCCTCAAACCCAC)?R(GGAGCCACGCGGAACCAG)screeningofpGEX-D-hIFNa2bmutantclonesbyrestrictionanalysisusingEcoRIrestrictionenzyme第85頁,共105頁，星期六，2024年，5月AnalyticalexpressionofrecombinantGST-rhIFNa2bTheOrigamiBandBL21E.colicelllinesweretransformedwiththewild-typepGEX-rhIFNa2bplasmidandtheGST–IFNjunctionre-engineeredpGEX-D-hIFNa2bplasmid,usingtheTSSmethodfollowingstandardprotocols.Starterculturesof5mlLuria–Bertani(LB)mediumcontaining100mg/mlampicillinwereinoculated,eachwithasingleE.coliOrigamiBorBL21recombinantclone37℃，250r/min,overnightOnemilliliteroftheovernightculturewasaddedto100mlLBmediumsupplementedwith100mg/mlampicillin37℃,OD6000.5第86頁,共105頁，星期六，2024年，5月Monitoringofgrowthconditions(temperatureandIPTGconcentration)usingE.coliBL21andOrigamiBstrainseachhoststrainculturewasinducedwiththreeIPTGconcentrations(0.1,0.5and1mM)atanOD600of0.525℃and37℃OD600=2Tochecktheeffectsoftheinducer(IPTG)concentrationandculturegrowthtemperatureontheexpressionofsolubleGST-hIFNa2bwild-typeandGST-D-hIFNa2bmutantrecombinantproteins第87頁,共105頁，星期六，2024年，5月AnalysisoftherecombinantGST-rhIFNa2bexpressedintheE.coliBL21straingrown37℃.Bothintracellularsoluble(A)andinsoluble(B)proteinfractionswereloadedonSDS–PAGEgels,andproteinswerestainedwithCoomassieBrilliantBlueR250.LaneMshowsthemolecularweightstandards(RPN756MW)indicatedinkiloDaltons.Lanes1and3correspondtotheproteinsamplescollectedfromanun-inducedcultureofE.coliBL21transformedwithpGEX4T-1andE.coliBL21transformedwiththepGEX4T1/IFNa2brecombinantplasmid,respectively.Thoselinesserveasacontrolofproteinexpressioninnon-inducedcondition.Lane2correspondstotheproteinsamplecollectedfroma1mMIPTG-inducedcultureofE.coliBL21transformedwithpGEX4T-1.ThislaneservesasacontrolofGSTparentalproteinexpression.Lanes4–6correspondtotheproteinscollectedfromculturesofE.coliBL21transformedwiththepGEX4T1/IFNa2brecombinantplasmidinduced,respectively,with1,0.5and0.1mMIPTG.solubleinclusionbodiesfractions第88頁,共105頁，星期六，2024年，5月ThepresenceofGST-hIFNa2bfusionproteininboththesolubleandinclusionbodyfractionswasconfirmedbywesternblotanalysisusingtheanti-GSTantibody(Fig.3A).However,thesignalfromthesolublefractionwasmuchweakerasassessedbyanalysisofthewesternblotfilmusingtheImageJsoftware.Weobservedanexpressionratioof67.39%insoluble(presentininclusionbodies)andover32.61%soluble(presentinthesolublefraction)GST-hIFNa2bfusionprotein(Fig.3B).第89頁,共105頁，星期六，2024年，5月EnhancementofthelevelofsolubleGST-hIFNa2bexpressedinBL21strainatreducedtemperature第90頁,共105頁，星期六，2024年，5月ExtractionofGST-hIFNa2brecombinantproteinInducedandun-inducedcellwereharvestedbycentrifugation4000g,30min,4℃WashedwithbufferA4000g,30minProteinextractionwasperformedbyresuspendingthecellpelletinonefifthoftheoriginalculturevolumeofbufferBThecellsweredisturbedbysix30-ssonicationsteps4℃for30minat13500rpm第91頁,共105頁，星期六，2024年，5月cellpelletscorrespondingtoinsolubleproteinfractions(suchasinclusionbodies)werewashedseparatelywiththesamevolumeofbufferB.BufferA:10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,140mMNaCl,2.7mMKCl,pH7.3BufferB:10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,140mMNaCl,2.7mMKCl,pH7.3and1%TritonX-100)第92頁,共105頁，星期六，2024年，5月RecombinantproteinexpressionanalysisAnalyzetheintracellularexpressionofGST-D-hIFNa2brecombinantfusionproteininE.colihostcells,bySDS–PAGEElectrophoresis,using15%SDS-polyacrylamidegels.Therecombinantfusionproteinwasdetectedbywesternblot-ECLAssaysTheImageJsoftwarewasusedtocomparefusionproteinexpressionunderdifferentgrowthconditionsTheconcentrationofGST-D-hIFNa2binOrigamiBlysateversusrhIFNa2bobtainedafterthrombincleavageandthetwo-steppurificationwasalsodeterminedbyaquantitativein-housedevelopedELISAassay.ThepurityoftherecombinanthIFNa2bwascheckedbyanalysisof5-mgrecombinantproteinonCoomassieBlueandsilver-stainedSDS–PAGE15%gels.第93頁,共105頁，星期六，2024年，5月AffinitychromatographystepandthrombincleavageofGST-hIFNa2brecombinantproteinThesupernatantcontainingthesolubleGST-hIFNa2brecombinantproteinwasloadedonaGSTrapFFaffinitycolumnpre-equilibratedwithbufferA,

1ml/minTheboundmaterialwaswashedwithbufferAuntiltheabsorbanceatanODof280nmreturnedtobaselineGST-D-hIFNa2brecombinantproteinwascarriedoutusingsixcolumnvolumesofelutionbuffer(0.5ml/min)第94頁,共105頁，星期六，2024年，5月TheelutedfractionscontainingtheGST-hIFNa2brecombinantproteinwerepooled.ThepurificationstagesandaffinitychromatographicprofileswereanalyzedbyCoomassieBlue-stainedSDS–PAGEgelsandbywesternblotanalysisasdescribedearlierTwentyunitsofthrombinsolutionwereaddedto100μgofelutedfusionproteinandincubatedatroomtemperature(+22℃)for20h.BufferA:10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,140mMNaCl,2.7mMKCl,pH7.3Elutionbuffer:50mMTris–HCl,10mMreducedglutathione,pH8.0第95頁,共105頁，星期六，2024年，5月Fivethrombinconcentrations,10,20,50,100and200U,wereusedtocleave100mgofaffinity-purifiedGST-IFNa2bfusionprotein.ThecleavageoftheGST-hIFNa2bsamplesusingthefivethrombinconcentrationconditionswasanalyzedonSDS–PAGEfollowedbyawesternblotanalysisusinganti-hINFapolyclonalantibody.Thecleavageratewasnotcompleteanddidnotsignificantlyincreasewhenthrombinconcentrationwasincreased.Identicalresultsofincompletecleavagewereobservedusingdifferentsourcesofthrombin(i.e.differentmanufacturers).第96頁,共105頁，星期六，2024年，5月EngineeringoftheGST-hIFNa2bexpressioncassetteToenhancetheamountofthesolubleGST-hIFNa2bproteinexpressionandimprovethrombincleavagerate,wehaveengineeredthesequencecodingfortheGST–IFNjunctionthatincludesthethrombincuttingsite.Thisengineeringconsistedofdeletingthethreeextraresidues(Pro,GluandPhe)atpositions-1,-2and-3fromthefirstamino-terminalresidueofhIFN,andonoptimizingthecod