酵母菌雜交育種

關(guān)于酵母菌雜交育種12目錄一酵母菌雜交特點1酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和菌落形態(tài)2酵母菌的生活史和繁殖方式3酵母菌的雜交二酵母菌雜交育種的方法標(biāo)記菌株的選擇酵母菌雜交拓展：酵母群體雜交育種方法第2頁,共32頁，星期六，2024年，5月3一酵母菌雜交特點第3頁,共32頁，星期六，2024年，5月41酵母菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和菌落形態(tài)

酵母菌（yeast）是低等真核微生物，分屬于子囊菌綱、半知菌綱和擔(dān)子菌綱。大多數(shù)酵母菌為單細(xì)胞，一般呈卵圓形、圓形或圓柱形。細(xì)胞結(jié)構(gòu)類似于高等生物，細(xì)胞壁的主要成分為葡聚糖和甘露糖，此外還有蛋白質(zhì)和脂類等。酵母細(xì)胞除細(xì)胞壁之外還有細(xì)胞核、核膜、核仁等結(jié)構(gòu)。大多數(shù)酵母的菌落和細(xì)菌相似，第4頁,共32頁，星期六，2024年，5月5

酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與細(xì)菌相似，但比細(xì)菌細(xì)胞大得多。一個橢圓形的酵母菌細(xì)胞長約7.2um，寬5.6nm(圓形直徑1—5um).

菌落大而厚，菌落表面濕潤、粘稠并多呈乳白色，少數(shù)為紅色。

菌落特征表面濕潤、粘稠，大多數(shù)是乳白色，少數(shù)紅色（紅酵母），在固體培養(yǎng)基上生長時間長了，顏色變暗，呈縐縮狀。

第5頁,共32頁，星期六，2024年，5月62酵母菌生活史和繁殖方式酵母菌是真核生物中最簡單的單細(xì)胞微生物，具有真核生物所有的共性，染色體結(jié)構(gòu)、功能和高等生物細(xì)胞相類似。存在單倍體和二倍體的生活史，二倍體生活力強(qiáng)，生產(chǎn)能力高，可通過雜交得二倍體來育種。第6頁,共32頁，星期六，2024年，5月7酵母菌的生殖方式酵母菌可以進(jìn)行無性生殖，也可以進(jìn)行有性生殖。無性繁殖包括芽殖、裂殖(即少數(shù)種類的酵母菌與細(xì)菌一樣，借細(xì)胞橫分裂而繁殖)、芽裂(這種方式很少)三種。其中最主要還是出芽生殖(簡稱芽殖)，即成熟的酵母菌細(xì)胞先長出一個小芽體，芽體細(xì)胞長到一定程度脫離母細(xì)胞繼續(xù)生長，而后形成一個新個體。有性生殖是以形成子囊孢子的方式進(jìn)行。第7頁,共32頁，星期六，2024年，5月83酵母菌的雜交酵母菌的雜交最主要通過有性雜交，利用兩種不同結(jié)合型的單倍體菌株或子囊孢子進(jìn)行的。有的酵母如假絲酵母等不具有性生殖，即不產(chǎn)生子囊孢子，它們的雜交與霉菌一樣，是通過準(zhǔn)性生殖進(jìn)行的。酵母菌雜交一般是指異接合型菌株雜交。雜交過程包括子囊孢子接觸，結(jié)合，合子形成，直至二倍體細(xì)胞出牙為止的一系列過程。雜交步驟包括遺傳標(biāo)記菌株的選擇和不同遺傳標(biāo)記的異接合型細(xì)胞雜交。第8頁,共32頁，星期六，2024年，5月9二酵母菌雜交育種的法第9頁,共32頁，星期六，2024年，5月101標(biāo)記菌株的選擇常用的標(biāo)記是營養(yǎng)缺陷型或抗性突變基因

1．營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記2．抗性標(biāo)記3．溫度敏感性標(biāo)記4．其他性狀標(biāo)記如孢子顏色、菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)、可溶性色素舍量、代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高低和代謝返速度快慢等，以及利用的碳、氮原種類、殺傷力等其他性狀都可以作為重組體檢出的輔助性標(biāo)記。第10頁,共32頁，星期六，2024年，5月11營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選過程營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選一般要經(jīng)過誘變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型和確定生長譜四個環(huán)節(jié)。１誘變劑處理誘變劑處理時與其它誘變處理基本相同。在誘變處理后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之幾至千分之幾，采用抗菌素法或菌絲過濾法，可以淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株，從而達(dá)到濃縮營養(yǎng)缺陷型的目的。２

淘汰野生菌的方法1.抗生素法2.菌絲過濾法第11頁,共32頁，星期六，2024年，5月12２．１抗生素法：是利用野生型菌株能在MM中生長，而缺陷型不能生長，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于“休眠狀態(tài)”，這時，加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。在選擇抗生素時，細(xì)菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。第12頁,共32頁，星期六，2024年，5月132．２菌絲過濾法：只適用于絲狀真菌，其原理是在基本培養(yǎng)基中，野生型的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型則不能。因此將誘變處理后的孢子在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再進(jìn)行過濾。如此重復(fù)數(shù)次后，就可以除去大部分野生型菌株，同樣達(dá)到“濃縮”營養(yǎng)缺陷型的目的。

第13頁,共32頁，星期六，2024年，5月14具體方法：影印法、點種法、夾層法、限量補(bǔ)充培養(yǎng)法夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法影印接種法

逐個檢出法３營養(yǎng)缺陷型的檢出方法第14頁,共32頁，星期六，2024年，5月15酵母菌的雜交子囊孢子的制備：（以高產(chǎn)率釀酒酵母為例）誘導(dǎo)孢子形成的方法將釀酒酵母菌株于YPD固體斜面上28℃培養(yǎng)48h活化，活化兩次后接入產(chǎn)孢培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)3一7天，在顯微鏡下觀察子囊孢子形成情況，計算一個視野內(nèi)酵母總數(shù)和子囊孢子數(shù)，并計算產(chǎn)孢率。產(chǎn)孢率(%)=子囊孢子數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)注：YPD為酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基第15頁,共32頁，星期六，2024年，5月16子囊孢子分離和單倍體的獲得菌株活化后接入產(chǎn)孢培養(yǎng)基，3天后鏡檢觀察，無菌水(2ml)傾于斜面上，用接種環(huán)刮下菌體，收集菌懸液于7ml離心管中，6000rpm離心10min收集菌體。0.85%生理鹽水懸浮洗滌1~2次，分別加入0.7mlTris一Hcl(pH8.0，0.01M);200ul10%蝸牛酶(終濃度為0.02):l00ul10%琉基乙醇(終濃度為0.01)，120rpm(緩慢振蕩)培養(yǎng)16h破子囊壁，使孢子釋放。利用孢子比營養(yǎng)細(xì)胞耐熱特性，采用58℃高溫致死處理營養(yǎng)細(xì)胞，離心收集孢子，并用Tris一HCI(pH8.0，0.01M)洗滌兩次。取適當(dāng)稀釋倍數(shù)，涂布于YPD平板上，28℃培養(yǎng)2一3d。第16頁,共32頁，星期六，2024年，5月17單倍體的鑒定：培養(yǎng)后挑取小菌落，鏡檢觀察是否為單倍體。將獲得的疑是單倍體再接入產(chǎn)孢培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天左右觀察子囊形成，以確定是否為真正的單倍體。有子囊形成者基本確認(rèn)為二倍體，不形成子囊者基本確認(rèn)為單倍體。把確定為單倍體的菌株分別保種(YPD斜面、甘油管)。第17頁,共32頁，星期六，2024年，5月18單倍體交配型的確定單倍體菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株在YPD斜面活化后，分別接種到裝有10mlYPD液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中培養(yǎng)，30°C，200rpm/min，24h。取lml待測的單倍體菌株菌液和lml標(biāo)準(zhǔn)菌株菌液接種到新鮮的10mlYPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm/min鏡檢觀察啞鈴形細(xì)胞產(chǎn)生，混合菌液培養(yǎng)過夜后離心(300rpm/min，5min)，菌體沉淀后接種到產(chǎn)孢培養(yǎng)基中培養(yǎng)3一7天，鏡檢觀察有無子囊產(chǎn)生，確定交配型，能與a型標(biāo)準(zhǔn)菌株雜交并且產(chǎn)孢的菌株交配型為α；能與α型標(biāo)準(zhǔn)菌株雜交并且產(chǎn)孢的菌株交配型為a。有性雜交第18頁,共32頁，星期六，2024年，5月19單倍體雜交與二倍體的檢出將a型與α型單倍體菌株混合接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)，鏡檢觀察接合子的形成情況。鏡檢雜交完成后吸取適量菌液，涂布于基本培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)。挑取較大的單菌落，在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上鑒定菌株的產(chǎn)孢能力，能夠產(chǎn)孢的菌株確定是經(jīng)雜交形成的二倍體菌株，編號保存。第19頁,共32頁，星期六，2024年，5月20單倍體雜交與二倍體的檢出

將a型與α型單倍體菌株混合接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)，鏡檢觀察接合子的形成情況。鏡檢雜交完成后吸取適量菌液，涂布于基本培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)。挑取較大的單菌落，在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上鑒定菌株的產(chǎn)孢能力，能夠產(chǎn)孢的菌株確定是經(jīng)雜交形成的二倍體菌株，編號保存。第20頁,共32頁，星期六，2024年，5月21酵母群體雜交育種方法第21頁,共32頁，星期六，2024年，5月22高耐性釀酒酵母的雜交育種1.單倍體的制備將釀酒酵母AY-15,M1分別于YEPD液體培養(yǎng)基（見表一）中于28℃培養(yǎng)48h,離心洗滌,棄上清液,將酵母泥接種于微量元素培養(yǎng)基平板上,于25℃培養(yǎng)5d,在顯微鏡下可以觀察到有子囊孢子的形成,收集平板培養(yǎng)基上的菌體。制備菌懸液(106),用2%的蝸牛酶于30℃水浴處理60min,然后于50℃水浴振蕩處理10min,殺死二倍體營養(yǎng)細(xì)胞,將粘連的孢子打散后第22頁,共32頁，星期六，2024年，5月23YEPD培養(yǎng)基（酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基，加入瓊脂的又叫酵母膏胨葡萄糖（YPD）瓊脂培養(yǎng)基）用于酵母菌的培養(yǎng)配方：表一

第23頁,共32頁，星期六，2024年，5月24涂布YEPD培養(yǎng)基平板,挑取小菌落點接在生孢培養(yǎng)基上,于25℃培養(yǎng)6d后鏡檢,不生孢子者為單倍體,將單倍體分別挑至斜面,統(tǒng)一編號,于4℃下保存。2.單倍體接合能力及接合型的鑒定將獲得的單倍體菌株分別與標(biāo)準(zhǔn)a型、α型菌株混合培養(yǎng),與a型菌株形成啞鈴形接合子的待測菌株為α型,與標(biāo)準(zhǔn)α型菌株接合的待測菌株為a型,與a型、α型菌株均不接合的為不育型菌株。第24頁,共32頁，星期六，2024年，5月253.單倍體菌株的篩選取裝有麥汁的試管(內(nèi)裝杜氏管),加入無水乙醇,使麥汁中酒精含量為16%,混勻。將AY-15的單倍體菌株分別接入麥汁中,于30℃培養(yǎng),根據(jù)產(chǎn)氣情況判斷酵母的耐酒精性能,選出耐性好的菌株。然后利用TTC平板進(jìn)行復(fù)篩。菌株點接到TTC平板下層培養(yǎng)基上,于30℃培養(yǎng)2～3d,待菌落長大后,倒入TTC上層培養(yǎng)基,覆蓋原有的菌落,在30℃下避光培養(yǎng)2～3h,由菌第25頁,共32頁，星期六，2024年，5月26

落呈色的深淺判斷酵母的產(chǎn)酒精能力,顏色較深的菌落為產(chǎn)酒精性能好的菌株。將M1的單倍體菌株分別接種到裝有麥汁的試管中(內(nèi)裝杜氏管,NaCl含量為13%),于30℃培養(yǎng),以親本菌株作對照,產(chǎn)氣速度快、產(chǎn)氣量多的酵母為耐滲性好的菌株。第26頁,共32頁，星期六，2024年，5月274.單倍體菌株發(fā)酵性能的篩選菌株活化后,進(jìn)行種子培養(yǎng),然后接入發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵一段時間后補(bǔ)加10%的葡萄糖。于30℃靜置培養(yǎng),每隔24h測CO2失重。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液的酒精度和殘?zhí)呛?。根?jù)產(chǎn)酒精能力選出發(fā)酵性能優(yōu)良的單倍體菌株。第27頁,共32頁，星期六，2024年，5月285.單倍體雜交及雜交株的檢出將a型與α型單倍體菌株混合接種于YEPD液體培養(yǎng)基中,于30℃搖床培養(yǎng),觀察接合子的形成情況,培養(yǎng)20h后收集菌體,涂布YEPD平板,挑取較大的單菌落,在微量元素培養(yǎng)基上鑒定菌株的產(chǎn)孢能力,能夠產(chǎn)孢的菌株為二倍體雜交株,編號保存。第28頁,共32頁，星期六，2024年，5月296.雜交菌株的篩選利用耐酒精和耐滲杜氏管試驗對雜交菌株進(jìn)行篩選。首先將菌株分別接入含有酒精的麥汁中,于30℃溫培養(yǎng),根據(jù)產(chǎn)氣情況判斷酵母的耐酒精性能,選出耐酒精性能良好的菌株。將選出的菌株接入含有氯化鈉的麥汁中,于30℃培養(yǎng),根據(jù)菌株的產(chǎn)氣情況判斷其耐滲性,選出耐滲性能較好的菌株。第29頁,共32頁，星期六，2024年，5月307.雜交菌株發(fā)酵性能檢測將篩選得到的菌株活化后,進(jìn)行種子培養(yǎng),轉(zhuǎn)入耐鹽發(fā)酵培養(yǎng)基,于30℃靜置培養(yǎng),每隔24h測CO2

失重,用CO2

失重來衡量酵母的發(fā)酵速度。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液的酒精度和殘?zhí)呛?