第二章 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)課件

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

Basisofbiopharmaceuticaltechnology基因工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)細(xì)胞工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)酶工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)發(fā)酵工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)基因工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)back第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

基因工程(geneticengineering)：外源DNA，通過具有復(fù)制能力的載體分子形成重組DNA分子，導(dǎo)入受體細(xì)胞，進(jìn)行持久穩(wěn)定的復(fù)制和表達(dá)，使受體細(xì)胞產(chǎn)生外源DNA或蛋白質(zhì)。

基因工程操作過程：（1）獲得目的基因；（2）構(gòu)建DNA重組體；（3）將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；（4）工程菌的克隆與鑒定；（5）目的基因擴(kuò)增與蛋白表達(dá)。

P72第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)基因工程技術(shù)的應(yīng)用特點(diǎn)：為癌癥、病毒性疾病、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病的預(yù)防、治療和診斷提供新型疫苗、藥物和診斷試劑?；蚬こ碳夹g(shù)的最大好處在于它能從極端復(fù)雜的機(jī)體細(xì)胞內(nèi)取出所需要的基因，將其在體外進(jìn)行剪切拼接、重新組合，然后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞進(jìn)行表達(dá)，從而生產(chǎn)出比原來多數(shù)百、數(shù)千倍的相應(yīng)的蛋白質(zhì)。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)：可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性多肽和蛋白質(zhì)，為臨床使用提供有效的保障；可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍；利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處，可以通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造；利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)獲得目的基因構(gòu)建DNA重組體將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞鑒定篩選陽性

克隆基因工程藥物制造過程上游階段P72第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)培養(yǎng)工程菌分離純化表

達(dá)產(chǎn)物除菌過濾半成品檢定制劑成品檢定包裝基因工程藥物制造過程下游階段P72第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)一目的基因的制備（一）構(gòu)建cDNA文庫，篩選目的cDNA（二）PCR技術(shù)（三）化學(xué)合成法：較小的蛋白質(zhì)和多肽的編碼基因可以用人工化學(xué)合成法獲得。目的基因的獲取途徑：P74第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

克隆蛋白質(zhì)藥物基因的一個(gè)主要目的是為了高效的表達(dá)該基因，從而大量地生產(chǎn)原本難以獲得的藥物。

基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程?；蚋咝П磉_(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)，即剪切下一個(gè)外源基因片段，拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。進(jìn)行基因表達(dá)研究的主要問題是目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。因此，建立最佳的基因表達(dá)體系，是基因表達(dá)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。三基因表達(dá)系統(tǒng)第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)宿主細(xì)胞的基本要求：

①容易獲得較高濃度的細(xì)胞；②能利用易得廉價(jià)原料；③不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；④發(fā)熱量低，需氧低；⑤容易進(jìn)行代謝調(diào)控；⑥容易進(jìn)行DNA技術(shù)操作；⑦產(chǎn)物的產(chǎn)量高，且易提取純化。（一）宿主細(xì)胞的選擇第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)原核細(xì)胞：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等；真核細(xì)胞：酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞的分類：P83第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（1）大腸桿菌Escherichiacoli優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清楚、技術(shù)操作簡單，所需的成本相對較低和高表達(dá)量。缺點(diǎn)：目的蛋白常以包涵體(inclusionbody)形式表達(dá)，純化提取困難。1、原核細(xì)胞P83第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（2）芽孢桿菌Bacillus：分泌能力強(qiáng)，不形成包含體。有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)對產(chǎn)物進(jìn)行不同程度的降解。（3）鏈霉菌Streptomyces：可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（1）酵母：表達(dá)產(chǎn)物能可進(jìn)行折疊和翻譯后修飾與糖基化，表達(dá)量高，產(chǎn)物易純化。（2）絲狀真菌：很強(qiáng)的分泌能力；有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。

2、真核細(xì)胞P86第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞：中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）和猴腎細(xì)胞（COS）。特點(diǎn)：產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物。但動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)慢，生產(chǎn)率低，而且培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度較稀。P87第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)工程菌的培養(yǎng)過程：搖瓶操作（溫度、pH、培養(yǎng)基組分、碳氮比）；培養(yǎng)罐操作（確定培養(yǎng)參數(shù)、控制方案、順序）（一）、基因工程菌的培養(yǎng)方式：1、分批培養(yǎng)（batchculture）2、補(bǔ)料分批培養(yǎng)（fed-batchculture）3、連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）4、透析培養(yǎng)（dialysisculture）

四基因工程菌的發(fā)酵P88-90第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（二）基因工程菌的發(fā)酵工藝

基因工程菌的發(fā)酵工藝

傳統(tǒng)微生物發(fā)酵工藝材料帶外源基因重組載體的微生物不含外源基因的微生物目的使外源基因高效表達(dá)，盡量減少宿主本身蛋白的污染

自身基因表達(dá)所產(chǎn)生的初級或次級代謝產(chǎn)物1、培養(yǎng)基的影響

2、接種量的影響3、溫度的影響4、溶解氧的影響5、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響6、pH的影響第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

基因工程藥物分離純化的一般流程發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包含體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步分離制劑產(chǎn)品高度純化五基因工程藥物的分離純化第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

六基因工程藥物的質(zhì)量控制（一）原材料的質(zhì)量控制確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。（二）培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（三）純化工藝中的質(zhì)量控制

1、產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA都控制在規(guī)定限度以下。

2、在精制過程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)，并有檢測方法。（四）目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制

1、產(chǎn)品的鑒定

2、純度分析

3、生物化學(xué)測定

4、穩(wěn)定性考察

5、產(chǎn)品一致性的保證

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

基因工程藥物應(yīng)用實(shí)例第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)治療糖尿病的胰島素，是一種51個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。1982年美國EliLilly公司推出基因工程制造的人胰島素，商品名為(Humulin)。干擾素用于治療肝炎等病毒感染性疾病，有良好療效。1升發(fā)酵液中所得的干擾素相當(dāng)于過去從1000升人血中所得。生產(chǎn)成本也大為降低。目前用基因工程生產(chǎn)的蛋白質(zhì)藥物已達(dá)數(shù)十種，許多以前原本不可能大量生產(chǎn)的生長因子，凝血因子等蛋白質(zhì)藥物，現(xiàn)在用基因工程辦法可大量生產(chǎn)。1.基因工程用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)2.基因工程用于疫苗生產(chǎn)常用的制備疫苗的方法，一種是減毒活疫苗，一種是滅活疫苗。兩種疫苗各有自身的弱點(diǎn)。減毒活疫苗隱含著感染的危險(xiǎn)性。滅活疫苗免疫活性不高，需加大注射量或多次接種。利用基因工程制備重組DNA疫苗，可以克服上述缺點(diǎn)，重組DNA疫苗就是利用基因工程的方法將編碼蛋白質(zhì)的基因重組到載體上，再導(dǎo)入細(xì)胞中大量生產(chǎn)，表達(dá)免疫原性較強(qiáng)、無感染毒性的多肽制成的疫苗。乙型肝炎基因工程疫苗就是由編碼HBsAg的基因插入到釀酒酵母基因組中表達(dá)的產(chǎn)物。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)3.基因工程用于基因治療基因治療：將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。復(fù)合免疫缺陷綜合征黑色素瘤血友病第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

細(xì)胞工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)back第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)動(dòng)物細(xì)胞工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（一）動(dòng)物細(xì)胞的獲得1、原代細(xì)胞：直接取自動(dòng)物組織器官2、二倍體細(xì)胞：原代細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)化、篩選、克隆3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無限增殖能力。（二）P92-93第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（三）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)1、懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）讓細(xì)胞自由的懸浮于培養(yǎng)液中培養(yǎng)（操作簡便、但細(xì)胞小不適合灌流培養(yǎng)）2、貼壁培養(yǎng)（anchorageculture）讓細(xì)胞附在某種基質(zhì)上生長繁殖（應(yīng)用廣、可灌流培養(yǎng)、但需大面積，傳質(zhì)差）3、微載體培養(yǎng)（microcarrierculture）微載體培養(yǎng)是細(xì)胞附著和生長在微載體表面。P94-95第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)細(xì)胞A細(xì)胞B雜種細(xì)胞滅活的病毒物理法化學(xué)法仙臺病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒離心振動(dòng)電激聚乙二醇細(xì)胞融合(cellfusion)是指在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞或原生質(zhì)體融合形成一個(gè)雜種細(xì)胞。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)用滅活的病毒誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合過程細(xì)胞核病毒顆粒細(xì)胞核第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)蛙血細(xì)胞有多核現(xiàn)象，為什么？精子和卵子結(jié)合是細(xì)胞融合嗎？是否只有近緣或同種生物能夠進(jìn)行細(xì)胞融合？1958年崗田善雄用高濃度的水仙病毒和小鼠艾氏腹水瘤細(xì)胞得以融合，這一發(fā)現(xiàn)，打破了細(xì)胞融合只能在同種生物間進(jìn)行的枷鎖。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體1975年從事免疫學(xué)研究的Kohlor和Milstein利用仙臺病毒誘導(dǎo)經(jīng)過免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，并最終獲得了能分泌單一抗體的雜種細(xì)胞，該雜種細(xì)胞具有大量繁殖的能力，以及能長期分泌單克隆抗體。使免疫學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)了一場革命性的轉(zhuǎn)機(jī)。為此兩人獲得1984年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。P97第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

單克隆抗體制備過程

注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選雜交細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體P97第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)植物細(xì)胞工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)植物細(xì)胞工程通常采用的技術(shù)手段

植物組織培養(yǎng)

植物體細(xì)胞雜交所采用技術(shù)的理論基礎(chǔ)

植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞全能性（totipotency）：生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個(gè)體的潛能的特性。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)一、植物組織培養(yǎng)概念科學(xué)研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實(shí)現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)離體的植物器官、組織或細(xì)胞愈傷組織根芽植物體脫分化再分化脫分化由高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細(xì)胞的脫分化。再分化脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)又可以重新分化成根或芽等器官，這一過程稱為植物細(xì)胞的再分化。一、植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)過程第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)4.植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用：

（1）試管苗的快速繁殖（2）無病毒植物的培育（3）提取原料（4）人工種子（5）轉(zhuǎn)基因植物的培育含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的pH、適時(shí)光照等。一、植物組織培養(yǎng)3.植物組織培養(yǎng)條件：第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)離體植物細(xì)胞愈傷組織胚狀體根芽植物體脫分化再分化一、植物組織培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)應(yīng)用舉例（一）胚狀體（somaticembryo）：指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長成完整植株。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

紫草紫草素

愈傷組織一、植物組織培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)應(yīng)用舉例（二）第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)胚狀體人工種皮人工胚乳一、植物組織培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)應(yīng)用舉例（三）人工種子(artificalseeds)定義：指通過組織培養(yǎng)技術(shù)，把植物組織的細(xì)胞培養(yǎng)成在形態(tài)及生理上與天然種子胚相似的胚狀體，然后將它包埋于有一定營養(yǎng)成分和保護(hù)功能的介質(zhì)中，在適宜的條件下發(fā)芽出苗。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)1、定義：也稱原生質(zhì)體融合（Protoplastfusion），是指將植物不同種、屬，甚至科的原生質(zhì)體通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。2、優(yōu)勢：（與有性雜交方法比較）

打破了不同種生物間的生殖隔離限制，大大擴(kuò)展了可用于雜交的親本組合范圍。二、植物體細(xì)胞雜交

（Somatichybridization）

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)植物A細(xì)胞植物B細(xì)胞去壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合融合體再生壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂愈傷組織雜種植株去壁的常用方法：酶解法（纖維素酶、果膠酶等）

原生質(zhì)體融合方法：物理法：離心、振動(dòng)、電刺激等化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）二、植物體細(xì)胞雜交過程：第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(1)(1)(2)(3)(4)(5)二、植物體細(xì)胞雜交過程示意圖第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)白菜甘藍(lán)白菜－甘藍(lán)二、植物體細(xì)胞雜交植物體細(xì)胞雜交應(yīng)用第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)細(xì)胞工程的好處以植物細(xì)胞全能性為基礎(chǔ)的植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)獲得各種試管植物上千種，并可以獲得有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥物和其他產(chǎn)品。細(xì)胞器移植、體外受精、胚胎培養(yǎng)，為植物和家畜的品種改良提供了新的途徑。細(xì)胞融合技術(shù)，可以獲得前所未有的生物為人類造福。由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體，被稱為“生物導(dǎo)彈”，在治療癌癥方面發(fā)揮著巨大作用。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)酶工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)back第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

酶的特性定義：酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊催化功能的一類蛋白質(zhì)。

催化效率高專一性強(qiáng)反應(yīng)條件溫和催化活性受到調(diào)節(jié)和控制第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（一）、酶工程(enzymeengineering)酶工程是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合發(fā)展而形成一門新的技術(shù)學(xué)科。它是從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異性催化功能或者藥用功效，并通過工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。主要包括藥用酶的生產(chǎn)和酶法制藥兩方面的技術(shù)。P102第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

藥用酶的生產(chǎn)藥用酶是指可用于預(yù)防和治療疾病的酶。例如：蛋白酶治療消化不良；L-天冬酰胺酶治療白血??；超氧化物歧化酶防護(hù)輻射損傷；溶菌酶抗菌消炎；尿激酶治療心肌梗塞等等。藥用酶的生產(chǎn)主要包括發(fā)酵生產(chǎn)，藥用酶的分離純化，藥用酶的分子修飾等。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)酶法制藥酶法制藥是指利用酶的催化作用而制造出具有藥用功效的物質(zhì)的技術(shù)過程。例如：青霉素?；干a(chǎn)半合成抗生素；β-酪氨酸酶生產(chǎn)多巴；核苷磷酸化酶催化阿糖尿苷生成阿糖腺苷等等。酶法制藥主要包括酶的催化反應(yīng)，酶的固定化，酶的非水相催化等。第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(二)、固定化酶(immobilizedenzyme)

定義：是指借助于物理和化學(xué)的方法把酶束縛在一定空間內(nèi)并具有催化活性的酶制劑。廣義的固定化酶包括固定化酶和固定化細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：（1）固定化穩(wěn)定性提高（2）可重復(fù)使用、提高使用效率、降低成本（3）提高強(qiáng)度，便于連續(xù)、自動(dòng)、規(guī)?；a(chǎn)（4）便于產(chǎn)物的分離、純化缺點(diǎn)：固定化過程中往往會(huì)引起酶的失活P102第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（三）、酶的固定化方法

(1)吸附法：可分為物理吸附法和離子吸附法。離子吸附法是將酶與含有離子交換劑的水溶性載體相結(jié)合。(2)包埋法：凝膠包埋法和微囊化包埋法。是將酶或細(xì)胞定位在高聚物網(wǎng)格或不同構(gòu)型膜外殼內(nèi)。EEEEEEEEP103第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(4)交聯(lián)法：使用雙功能或多功能試劑與酶分子之間進(jìn)行分子間的交聯(lián)反應(yīng)的固定化方法。EEEEEEEEEEE(3)共價(jià)結(jié)合法：通過化學(xué)偶聯(lián)使酶的活性基團(tuán)與載體表面活潑基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。P105第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)1.固定化細(xì)胞：將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞。

三、固定化細(xì)胞的制備2.固定化細(xì)胞的特點(diǎn)有細(xì)胞特性，生物催化劑功能，固相催化劑特點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)：①無須進(jìn)行酶的分離純化②保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高③比固定化酶穩(wěn)定性高④細(xì)胞內(nèi)酶附助因子可再生⑤細(xì)胞本身含多酶體系⑥抗污染能力強(qiáng)P106第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)3.固定化細(xì)胞的制備技術(shù)

(1)載體結(jié)合法是將細(xì)胞懸液直接與水不溶性的載體相結(jié)合的固定化方法。

(2)包埋法

將細(xì)胞定位于凝膠網(wǎng)格內(nèi)的技術(shù)。

(3)交聯(lián)法

用多功能試劑對細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)的固定化方法。

(4)無載體法靠細(xì)胞自身的絮凝作用制備固定化細(xì)胞的技術(shù)。P106第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)第五節(jié)酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸（6-APA）培養(yǎng)固定轉(zhuǎn)化過濾抽提E.Coli

細(xì)胞

青霉素

轉(zhuǎn)化液

濾液

6-APA粗品

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)發(fā)酵工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)back第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)微生物發(fā)酵技術(shù)1857年法國化學(xué)家、微生物家巴斯德提出了著名的發(fā)酵理論：“一切發(fā)酵過程都是微生物作用的結(jié)果?！卑退沟抡J(rèn)為：釀酒是發(fā)酵，是微生物在起作用；酒變質(zhì)也是發(fā)酵，是另一類微生物在作祟。同時(shí)，把發(fā)酵的微生物分離出來，通過人工培養(yǎng)，根據(jù)不同的要求去誘發(fā)各種類型的發(fā)酵，獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)品。

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)發(fā)酵工程FermentationEngineering：采用現(xiàn)代工程技術(shù)手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程中的一種新技術(shù)。

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)發(fā)酵工程的內(nèi)容包括以下的基本步驟：菌種的選育培養(yǎng)基的配置滅菌擴(kuò)大培養(yǎng)和接種發(fā)酵過程分離提純第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)發(fā)酵工程Continuouscentrifuges第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（1）自然選育依據(jù)自發(fā)突變原理，通過不斷分離篩選，去衰變菌落，選擇高產(chǎn)菌，達(dá)到純化、復(fù)壯、穩(wěn)定生產(chǎn)目的。方法：a平板劃線法b稀釋平板法1．菌種的選育P52第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

（2）誘變育種

①出發(fā)菌株的選擇

a穩(wěn)定性b具備某種優(yōu)良性狀的菌株

c對誘變劑敏感d生理狀態(tài)及生長時(shí)間②誘變處理

a化學(xué)誘變b物理誘變c生物誘變

③篩選

a隨機(jī)篩選b半理性化篩選

（3）現(xiàn)代菌種選育技術(shù)①雜交育種②原生質(zhì)體融合③基因工程技術(shù)P52-55第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)2培養(yǎng)基的配置培養(yǎng)基配置的原則：根據(jù)不同的菌種，選擇不同的材料配制培養(yǎng)基

配制的培養(yǎng)基應(yīng)滿足微生物在碳源、氮源、生長因子、水、無機(jī)鹽等方面的營養(yǎng)要求，并為微生物提供適宜的pH。培養(yǎng)基的營養(yǎng)要協(xié)調(diào)，以利于產(chǎn)物的合成。培養(yǎng)基在滿足微生物的營養(yǎng)需求的基礎(chǔ)上應(yīng)盡量降低生產(chǎn)成本，以得到更高的經(jīng)濟(jì)效益。舉例：發(fā)酵生產(chǎn)常采用天然成分的液體培養(yǎng)基。而且，經(jīng)常用野生的植物淀粉、甘蔗渣、秸稈，以及乙醇、醋酸等石化產(chǎn)品代替糧食來配制培養(yǎng)基。

P58-61第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)3滅菌滅菌與除菌方法加熱滅菌、輻射滅菌、介質(zhì)過濾滅菌、化學(xué)滅菌滅菌的原因：在發(fā)酵過程中如混入其他微生物，將與菌種形成競爭關(guān)系，對發(fā)酵過程造成不良影響。舉例：如果在谷氨酸發(fā)酵過程中混入放線菌，則放線菌分泌的抗生素就會(huì)使大量的谷氨酸棒狀桿菌死亡。如果在青霉素生產(chǎn)過程中污染了雜菌，這些雜菌則會(huì)分泌青霉素酶，將合成的青霉素分解掉。P61-63第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（1）染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響對過濾的影響：發(fā)酵液的粘度加大由于發(fā)酵不徹底，基質(zhì)的殘留濃度增加造成的后果：過濾時(shí)間拉長，影響設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞生產(chǎn)平衡大幅度降低過濾收率3滅菌第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)對提取的影響有機(jī)溶劑萃取工藝：染菌的發(fā)酵液含有更多的水溶性蛋白質(zhì)，易發(fā)生乳化，使水相和溶劑相難以分開離子交換工藝：雜菌易粘附在離子交換樹脂表面或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換量3滅菌（1）染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)對產(chǎn)品質(zhì)量的影響對內(nèi)在質(zhì)量的影響：染菌的發(fā)酵液含有較多的蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。對產(chǎn)品的純度有較大影響。對產(chǎn)品外觀的影響：一些染菌的發(fā)酵液經(jīng)處理過濾后得到澄清的發(fā)酵液，放置后會(huì)出現(xiàn)混濁，影響產(chǎn)品的外觀。3滅菌（1）染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（2）發(fā)酵過程中染菌的檢查判斷雜菌的檢查方法

①顯微鏡檢查：染色鏡檢②平板劃線檢查：倒平板空培養(yǎng)待測樣品劃線培養(yǎng)觀察③酚紅肉湯培養(yǎng)檢查：無菌肉湯培養(yǎng)基空培養(yǎng)接入樣品培養(yǎng)觀察3滅菌第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)各種檢查方法的比較顯微鏡檢查方法簡便、快速，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)雜菌，但由于鏡檢取樣少，視野的觀察面也小，因此不易檢出早期雜菌。平板劃線法和肉湯培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)是需經(jīng)較長時(shí)間培養(yǎng)(一般要過夜)才能判斷結(jié)果，且操作較繁瑣，但它要比顯微鏡能檢出更少的雜菌，而且結(jié)果也更為準(zhǔn)確。3滅菌（2）發(fā)酵過程中染菌的檢查判斷第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（3）發(fā)酵染菌的防止種子帶菌的原因及防止帶菌的原因無菌室的無菌條件不符合要求培養(yǎng)基滅菌不徹底操作不當(dāng)種子帶菌的防止

種子帶雜菌是發(fā)酵前期染菌的原因之一。在每次接種后應(yīng)留取少量的種子懸浮液進(jìn)行平板、肉湯培養(yǎng)，借以說明是否是種子中帶雜菌。種子培養(yǎng)的設(shè)備和裝置有無菌室、滅菌鍋和搖瓶機(jī)等。3滅菌第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（4）染菌后的挽救措施

發(fā)酵早期染菌可以適當(dāng)添加營養(yǎng)物質(zhì)，重新滅菌后再接種發(fā)酵。中后期染菌，如果雜菌的生長將影響發(fā)酵的正常進(jìn)行或影響產(chǎn)物的提取時(shí)，應(yīng)該提早放罐。有些發(fā)酵染菌后發(fā)酵液中的碳、氮源還較多，如果提早放罐，這些物質(zhì)會(huì)影響后處理提取使產(chǎn)品取不出，此時(shí)應(yīng)先設(shè)法使碳、氮源消耗，再放罐提取。3滅菌第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)有時(shí)發(fā)酵罐偶爾染菌，原因一時(shí)又找不出，一般可以采取以下措施：連續(xù)滅菌系統(tǒng)前的料液貯罐在每年4一10月份(雜菌較旺盛生長的時(shí)間)加入0.2%甲醛，加熱至80°C，存放處理4小時(shí)，以減少帶入培養(yǎng)液中的雜菌數(shù)。對染菌的罐，在培養(yǎng)液滅菌前先加甲醛進(jìn)行空消處理。甲醛用量每立方米罐的體積0.12~0.17升。對染菌的種子罐可在罐內(nèi)放水后進(jìn)行滅菌，滅菌后水量占罐體的三分之二以上。這是因?yàn)榧?xì)菌芽孢較耐干熱而不耐濕熱的緣故。

3滅菌（4）染菌后的挽救措施

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（1）微生物生長動(dòng)力學(xué)

微生物的發(fā)酵方式可分為分批培養(yǎng)（batchculture）、補(bǔ)料分批培養(yǎng)（fed-batchculture）、連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）、透析培養(yǎng)（dialysisculture）

分批發(fā)酵：在滅菌的培養(yǎng)基中接種相應(yīng)的微生物，然后不再加入新的培養(yǎng)基。

補(bǔ)料分批發(fā)酵：發(fā)酵過程中在不同時(shí)期加入越來越多的營養(yǎng)物，但不除去舊的營養(yǎng)物。

連續(xù)發(fā)酵：在發(fā)酵過程中不斷加入新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)放出等體積的舊的含懸浮的微生物的培養(yǎng)物。

透析培養(yǎng)：利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。4擴(kuò)大培養(yǎng)和接種

P69-70第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)減速期加速期對數(shù)期延遲期停滯期死亡期時(shí)間圖6-2在罐批發(fā)酵過程中細(xì)胞數(shù)量與時(shí)間的關(guān)系示意圖Lg（細(xì)胞數(shù)）第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)1、延遲期：細(xì)胞接種到滅菌的培養(yǎng)基后，細(xì)胞的數(shù)目并不是立即增長，這一時(shí)期稱為延遲期。細(xì)胞進(jìn)入延遲期可能是由于某種底物的缺乏或產(chǎn)物的抑制，而細(xì)胞需要重新啟動(dòng)它們的代謝系統(tǒng)，以適應(yīng)新環(huán)境。2、加速期：延遲期后，對數(shù)期前，細(xì)胞生長速度逐漸加快的時(shí)期稱為加速期。3、對數(shù)期：在細(xì)胞生長的對數(shù)期，細(xì)胞總量幾次翻番，但是細(xì)胞的特定生長率保持不變。4、減速期：由于在對數(shù)期末期培養(yǎng)基中所含的細(xì)胞數(shù)目很大，底物可能被迅速吸收利用。所以減速期很短。5、停滯期：減速期后，由于某種關(guān)鍵底物被耗盡，或是一種或幾種抑制生長的代謝產(chǎn)物的積累，培養(yǎng)體系中細(xì)胞數(shù)量的增長逐漸停止。6、死亡期：細(xì)胞的能量耗盡，代謝停止。P69第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（2）補(bǔ)料分批發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)：在發(fā)酵的不同時(shí)期不斷加入培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基的量逐漸增大，這可以延長對數(shù)期與停滯期的持續(xù)時(shí)間，增加生物量的積累，也能增加停滯期的細(xì)胞代謝物的積累。缺點(diǎn)：停滯期的微生物常常會(huì)產(chǎn)生蛋白水解酶或蛋白酶，這些酶有可能降解重組微生物所產(chǎn)生的任何一種蛋白產(chǎn)物。解決方法：在用重組微生物生產(chǎn)蛋白時(shí)，必須阻止發(fā)酵進(jìn)行到停滯期。直接檢測發(fā)酵時(shí)的培養(yǎng)基濃度的變化比較困難，所以，人們一般采用與之相關(guān)的其它因素，如有機(jī)酸的產(chǎn)生、pH值的變化、CO2的產(chǎn)生等作為檢測的標(biāo)準(zhǔn)，來推斷應(yīng)在何時(shí)加入新的培養(yǎng)基。4擴(kuò)大培養(yǎng)和接種

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（3）連續(xù)發(fā)酵

在連續(xù)發(fā)酵時(shí)，如果生物反應(yīng)其中的細(xì)胞總數(shù)與總體積均保持不變，那么體系就達(dá)到了穩(wěn)態(tài)，即是說，取出的細(xì)胞與新生細(xì)胞的數(shù)目恰好處在平衡狀態(tài)。優(yōu)點(diǎn)：可以降低成本；易于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程的儀表化和自動(dòng)化；有利于對微生物生理、生態(tài)及反應(yīng)機(jī)制的研究等。缺點(diǎn)：在培養(yǎng)過程中某些細(xì)胞可能會(huì)丟失重組質(zhì)粒，從而成為反應(yīng)器中的優(yōu)勢菌群，降低產(chǎn)量，將外源基因整合到宿主染色體上可避免這一問題；長時(shí)間維持工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的無菌狀態(tài)很困難；工業(yè)發(fā)酵用的培養(yǎng)基質(zhì)量不如實(shí)驗(yàn)室用的培養(yǎng)基那樣有保證，不同批次的培養(yǎng)基質(zhì)量可能不同。4擴(kuò)大培養(yǎng)和接種

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)發(fā)酵產(chǎn)物：發(fā)酵產(chǎn)物主要在菌體生長的停滯期產(chǎn)生。發(fā)酵進(jìn)程在發(fā)酵過程中隨時(shí)取樣檢測培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)目、產(chǎn)物濃度以了解發(fā)酵進(jìn)程，及時(shí)添加必需的培養(yǎng)基成分來延長菌體生長停滯期的時(shí)間，以得到更多的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵條件發(fā)酵生產(chǎn)中溫度、pH、溶氧量等對發(fā)酵過程有重大影響。5發(fā)酵過程第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

發(fā)酵過程的優(yōu)化氧氣濃度：以無菌空氣的形式持續(xù)向培養(yǎng)基中通氣，達(dá)到細(xì)菌生長所需的氧氣濃度。培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的碳氮比(C/N)值是衡量一種培養(yǎng)基是否適用的重要指標(biāo)之一。充分混合：細(xì)胞的養(yǎng)分供應(yīng)充足，防止有毒代謝產(chǎn)物局部積累。溫度：微生物在低于最適溫度時(shí)生長緩慢，細(xì)胞的生產(chǎn)力降低；而如果溫度過高則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞熱休克，使細(xì)胞產(chǎn)生大量的胞內(nèi)蛋白酶，而降低目的蛋白的產(chǎn)量。pH值：絕大多數(shù)微生物在pH5.5-8.5時(shí)生長得最好。在發(fā)酵過程中必須對培養(yǎng)基的pH值監(jiān)測，并根據(jù)監(jiān)測結(jié)果適量加入酸和堿以維持恒定的pH值。5發(fā)酵過程P71-72第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（1）、雜蛋白質(zhì)的去除加入凝聚劑

凝聚作用(coagulation):在某些電解質(zhì)作用下，使膠體粒子的擴(kuò)散雙電層的排斥電位降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過程。加入絮凝劑凝絮作用(flocculation):當(dāng)往膠體懸浮液中加入絮凝劑時(shí)，膠體可強(qiáng)烈地吸附在凝絮劑表面的功能團(tuán)上，而且一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒表面上，產(chǎn)生架橋連接，形成粗大的凝絮團(tuán)沉淀出來，有助于過濾。6分離提純

細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理P117-119第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)絮凝劑的分子量

絮凝劑的用量

溶液pH值

攪拌速度和時(shí)間

影響絮凝效果的因素P118第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)變性沉淀等電點(diǎn)沉淀加各種沉淀劑沉淀吸附:四環(huán)素發(fā)酵液中加入黃血鹽和硫酸鋅，生成亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3[Fe(CN)6]2的膠狀沉淀，能將雜蛋白質(zhì)和菌體等黏附在其中而除去。（1）、雜蛋白質(zhì)的去除細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理6分離提純

P117-119第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)（2）多糖的去除可用酶將多糖轉(zhuǎn)化為單糖提高過濾速度。黏多糖可與一些陽離子表面活性劑如十六烷基溴化銨（CTAB）生成沉淀去除。（3）高價(jià)金屬離子的去除離子交換法沉淀法

Ca2+草酸

Mg2+

磷酸鹽,三聚磷酸鈉

Fe3+

黃血鹽細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理6分離提純

P118第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)細(xì)胞破碎

機(jī)械法物理法化學(xué)法1、勻漿法1、干燥1、化學(xué)試劑處理2、珠磨法2、凍融2、制成丙酮粉3、超聲波3、滲透壓沖擊3、酶解法6分離提純

P120第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

機(jī)械法方法原理特點(diǎn)勻漿法基于液相的剪切力適用面廣，處理量大，速度快，在工業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用，但不適用于某些高度分枝的微生物，另外產(chǎn)熱大，可能造成生物活性物質(zhì)失活珠磨法利用研磨作用破碎適用面廣，處理量大，在工業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用；產(chǎn)熱大，可能造成生物活性物質(zhì)失活超聲波利用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎產(chǎn)熱量大，且散熱不易，成本高，僅適用于小量樣品破碎選擇破碎方法的依據(jù)第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)物理法方法原理特點(diǎn)干燥法干燥后的菌體細(xì)胞膜滲