生物工程下游技術(shù)

生物工程下游技術(shù)

生物工程下游技術(shù)的定義

指從動(dòng)植物與微生物的有機(jī)體或器官、生物工程產(chǎn)物（發(fā)酵液、培

育液）與其生物化學(xué)產(chǎn)品中提取、分別、純化有用物質(zhì)的技術(shù)過(guò)程。

實(shí)質(zhì)：是探討如何從混合物中把一種或幾種物質(zhì)分別出來(lái)的科學(xué)技

術(shù)。

1.生化工程分別技術(shù)

預(yù)處理

結(jié)晶干燥

離心法：離心過(guò)濾、離心沉降、超離心

萃取法：有機(jī)溶劑、雙水相、液膜、反膠團(tuán)、超臨界

層析法：凝膠過(guò)濾層析、反相層析、親和、疏水相互作用、聚焦、離子交

換

膜分別：微濾、超濾、

反滲透、透析、電滲透

2.生物物質(zhì)常用的分別技術(shù)

氨基酸：結(jié)晶和離子交換法

蛋白質(zhì)和多肽：離子交換層析、電泳

糖類：吸附層析

脂質(zhì)：有機(jī)溶劑萃取、超臨界流體萃取和層析

抗生素：有機(jī)溶劑萃取、離子交換、結(jié)晶和吸附層析

3.生物分別方法的選擇與評(píng)價(jià)

原則:

步聚少，次序合理，產(chǎn)品規(guī)格(注射，非注射)，生產(chǎn)規(guī)模，物料組成,

產(chǎn)品形式，產(chǎn)品穩(wěn)定性，危害性，物性：溶解度、電荷、分子大小、功

能團(tuán)、穩(wěn)定性、揮發(fā)性，廢水處理

4.濃縮率：濃縮程度一般用濃縮率(concentrationfactor)表達(dá)，是一個(gè)以

濃縮為目的的分別過(guò)程的最重要指標(biāo)。濃縮率為m,mt=mx則目標(biāo)產(chǎn)物

未得到任何程度的分別純化。

濃縮程度一般用液縮率(concentrationfactor)表達(dá)

,是一個(gè)以濃縮為目的的分離過(guò)程的最重要指標(biāo)

0濃縮率為m

如果歷7=Wv,則目標(biāo)產(chǎn)物未得到任何程度的

分離純化。

5.分別因子：分別因子又稱分別系數(shù)。產(chǎn)品中目標(biāo)產(chǎn)物濃度越高，雜質(zhì)濃

度越低，則分別因子越大，分別效率越高。

目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化程度用分離因子

（separationfactor）。表達(dá):

_Cjp/C_m

cc-----------TC-------T-

CAP/CXCmx

分離因子又稱分離系數(shù)。產(chǎn)品中目標(biāo)產(chǎn)物濃度

越高，雜質(zhì)濃度越低，則分離因子越大，分離

效率越高。

如果a=l,則目標(biāo)產(chǎn)物未得到任何程度的分

離純化。

6.回收率：無(wú)論是以濃縮還是以分別為目的操作過(guò)程，目標(biāo)產(chǎn)物均應(yīng)以較

大的比例回收，回收率R：生物分別操作多為間歇過(guò)程（分批操作），若

原料液和產(chǎn)品溶液的體積分別為VC和VPO

無(wú)論是以濃縮還是以分離為目的操作過(guò)程，目標(biāo)

產(chǎn)物均應(yīng)以較大的比例回收，回收率R：

RFpCrpX100%

FcCK

生物分離操作多為間歇過(guò)程（分批操作），

若原料液和產(chǎn)品溶液的體積分別為Vc和Vp

則回收率為

火=〃vcHxl00%

VcCTC

1生物產(chǎn)品與一般化工產(chǎn)品分別過(guò)程有何不同？

2設(shè)計(jì)生物產(chǎn)品的分別工藝應(yīng)考慮哪些因素？

3分別純化的回收率與濃縮率如何計(jì)算？

4現(xiàn)代生物分別工程探討方向有哪些特點(diǎn)？

5分別純化指標(biāo)有哪些？

簡(jiǎn)述pH對(duì)發(fā)酵液過(guò)濾特性的影響，并舉例說(shuō)明。

答：（1）pH干脆影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離程度和電荷性質(zhì)，因此

適當(dāng)調(diào)整pH值可以改善發(fā)酵液的過(guò)濾特性。（2）氨基酸和蛋白質(zhì)在酸

性條件下帶正電，堿性條件下帶負(fù)電，等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零，兩性物質(zhì)在

等電點(diǎn)下的溶解度最小，等電點(diǎn)沉淀法在生物工業(yè)分別中廣泛運(yùn)用。（3）

如味精生產(chǎn)，利用等電點(diǎn)沉淀法提取谷氨酸，一般蛋白質(zhì)也在酸性范圍達(dá)

到等電點(diǎn)；膜分別中可通過(guò)調(diào)整pH值變更易吸附分子的電荷性質(zhì)，削減

膜堵塞和膜污染；此外，細(xì)胞、細(xì)胞碎片與某些膠體物質(zhì)等在特定pH下

也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過(guò)濾進(jìn)行。

其次章

1.預(yù)處理的目的：促進(jìn)從懸浮液中分別固形物的速度，提高固液分別的效

率：

⑴變更發(fā)酵液的物理性質(zhì)，包括增大懸浮液中固體粒子的尺寸，降低液體

黏度。

⑵相對(duì)純化，去除發(fā)酵液中的部分雜質(zhì)（高價(jià)無(wú)機(jī)離子和雜蛋白質(zhì)），以

利于后續(xù)各步操作。

⑶盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的一相中（多數(shù)是液相）；

2.預(yù)處理的方法

凝合和絮凝

加熱法

調(diào)整懸浮液的pH值

雜蛋白的去處

高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去處

助濾劑

反應(yīng)劑

3凝合與絮凝：.凝合與絮凝處理過(guò)程就是將化學(xué)藥劑預(yù)先投加到懸浮液

中，變更細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使

其聚集起來(lái)，增大體積以便固液分別。

凝合和絮凝技術(shù)常用于菌體細(xì)小而且黏度大的發(fā)酵液的預(yù)處理中。

凝合和絮凝是兩種方法，兩個(gè)概念。

凝合：指在投加的化學(xué)物質(zhì)（鋁、鐵的鹽類）作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子

相互聚集成1mm大小塊狀凝合體的過(guò)程。

機(jī)理：

1）中和粒子表面電荷

2）消退雙電層結(jié)構(gòu)

3）破壞水化膜

膠體雙電層結(jié)構(gòu)

發(fā)酵液中菌體表面帶有負(fù)電荷，由于靜電引力使溶液中反離子被吸附在其

四周，在界面上形成了雙電層。

正離子同時(shí)受到使它們勻稱分布的熱運(yùn)動(dòng)影響，具有離開(kāi)膠粒表面的趨

勢(shì)。兩種相反作用力下，雙電層分裂成兩部：

1）吸附層或stern層；2）擴(kuò)散層。

擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)模型(Gouy-Chapman-Sternmodel)。

兩種相反作用力下，雙電層分裂成兩部：

1)吸附層或steci層；2)擴(kuò)散層。

擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)模型(Gouy-Chapman-Sternmodel)。

絮凝：指運(yùn)用絮凝劑(自然的和合成的大分子量聚電解質(zhì))將膠體粒子交

聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團(tuán)的過(guò)程。其中絮凝劑主要起架橋作用。

機(jī)理：架橋作用

采納絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分別。

人工合成有機(jī)高分子聚合物、自然有機(jī)高分子聚合物、無(wú)機(jī)高分子聚合物

聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點(diǎn)

用量少，一般以mg/L計(jì)量；

絮凝體粗大，分別效果好；

絮凝速度快；

種類多，適用范圍廣。

聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點(diǎn)：

存在肯定的毒性，特殊是陽(yáng)離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時(shí)應(yīng)

謹(jǐn)慎。

自然有機(jī)高分子絮凝劑具有無(wú)毒，易生物降解，原料來(lái)源廣等優(yōu)點(diǎn)。

自然有機(jī)高分子改性絮凝劑依據(jù)其原料來(lái)源不同可分為淀粉類、纖維素

類、植物膠類和聚多糖類。

其中淀粉改性絮凝劑的探討開(kāi)發(fā)最引人注目o

微生物絮凝劑是近年來(lái)探討和開(kāi)發(fā)的新型絮凝劑，

由微生物或其分泌物產(chǎn)生的具有絮凝細(xì)胞功能的代謝產(chǎn)物。

主要成分是糖蛋白、粘多糖、纖維素與核酸等高分子物質(zhì)。

微生物絮凝劑和自然絮凝劑最大的優(yōu)點(diǎn)是平安，無(wú)毒和不污染環(huán)境。

4.助濾劑：一種不行壓縮的多孔微粒，

菌體可吸附于助濾劑微粒上，降低了濾餅的可壓縮性，減小了過(guò)濾阻力。

常用的助濾劑是硅藻土，其次是珍寶巖粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纖

維素等。

⑴粒度

依據(jù)懸浮液中的顆粒和濾液的澄清度確定，一般顆粒較小的濾餅應(yīng)采納細(xì)

小的助濾劑。

⑵助濾劑的品種

依據(jù)過(guò)濾介質(zhì)選擇助濾劑品種。運(yùn)用粗目濾網(wǎng)時(shí)易泄漏，可選擇石棉粉、

纖維素；采納細(xì)目濾布時(shí)，可運(yùn)用細(xì)硅藻土；

⑶用量

間歇操作時(shí)，過(guò)濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑，其厚度應(yīng)不小于2mm。連續(xù)過(guò)

濾機(jī)中依據(jù)過(guò)濾速度確定。運(yùn)用硅藻土?xí)r，通常細(xì)粒為500g/m3,中等

粒度700g/m3,粗粒700-1000g/m3o

5.反應(yīng)劑：加入某些不影響目標(biāo)產(chǎn)物的反應(yīng)劑，可消退發(fā)酵液中的一些雜

質(zhì)對(duì)過(guò)濾的影響，從而提高過(guò)濾速度。

1）反應(yīng)劑與某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，生成的沉淀能防止

菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，又能使蛋白質(zhì)凝固，過(guò)濾性能上升,

沉淀本身可作為助濾劑.

如新生霉素發(fā)酵液中加入CaC12和Na3PO4,生成Ca3(PO4)2沉淀。

2)發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質(zhì)時(shí)，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過(guò)濾

速率。

如萬(wàn)古霉素用淀粉作培育基，發(fā)酵液過(guò)濾前加入0.025%的淀粉酶，攪

拌30min后，再加2.5%硅藻土助濾劑，可提高過(guò)濾效率5倍。

6.雜蛋白的去除方法

沉淀法

A等電點(diǎn)沉淀法(運(yùn)oelectricprecipitation)

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大都在酸性范圍內(nèi)(pH4.。?5.5),調(diào)整發(fā)酵液的pH到蛋

白質(zhì)的等電點(diǎn)是除去蛋白質(zhì)的有效方法。

B.酸堿調(diào)整，使蛋白質(zhì)與離子形成沉淀

在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子形成沉淀，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、

苦味酸鹽等；

在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽(yáng)離子形成沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、

Fe3+等。

變性

蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱為變性。變性蛋白質(zhì)溶解

度較小。

加熱,

大幅度調(diào)整pH值，

加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等。

不足之處：

加熱法只適合于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；

極端pH值也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；

有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。

1.沉淀法主要包括鹽析法,有機(jī)溶劑沉淀法,等電點(diǎn)沉淀法,結(jié)晶法等

等。

2.依據(jù)一般的習(xí)慣，析出物為晶體時(shí)稱為結(jié)晶，析出物為無(wú)定形固體則

稱為沉淀。

3.影響鹽析的因素有：無(wú)機(jī)鹽的種類、溶質(zhì)(蛋白質(zhì)等)種類的影響、蛋

白質(zhì)濃度的影響、溫度的影響、pH的影響。

吸附法

加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。

四環(huán)類抗生素生產(chǎn)中，采納黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氟化鋅鉀

K2Zn3[Fe(CN)5]2的膠狀沉淀來(lái)吸附蛋白質(zhì)，利用此法除蛋白質(zhì)已取得

很好的效果。

在枯草桿菌發(fā)酵液中，常加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，這兩者本身生成浩大

的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體與其它不溶性粒子吸附并包袱在其中而除去，從

而加快了過(guò)濾速度。

1發(fā)酵液為何須要預(yù)處理？處理方法有哪些？其簡(jiǎn)要機(jī)理如何？

2凝集與絮凝過(guò)程有何區(qū)分？如何將兩者結(jié)合運(yùn)用？

3除去發(fā)酵液中雜蛋白常用方法有哪些？

4簡(jiǎn)述膠體雙電層結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性機(jī)理？

5什么是助濾劑和反應(yīng)劑？能列舉1-3個(gè)應(yīng)用的例子

1.鹽析法：是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過(guò)向溶液

中引入肯定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的

的方法。

2.Ks鹽析：在肯定的pH和溫度下變更離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析，

稱作Ks鹽析法。Ks鹽析法多用于提取液的前期分別工作。

3.0鹽析：在肯定離子強(qiáng)度下僅變更pH和溫度進(jìn)行鹽析，稱作0鹽析法。

在分別的后期階段，為了求得較好的辨別率，或者為了達(dá)到結(jié)晶的目的，

有時(shí)應(yīng)用B鹽析法。B鹽析法由于溶質(zhì)溶解度變更緩慢且變更幅度小，沉淀

辨別率比公鹽析法好。

4.親和沉淀：利用親和反應(yīng)原理，將配基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成載體

-配基復(fù)合物（親和沉淀劑），該復(fù)合物可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，在肯定

條件下沉淀出來(lái)。

四問(wèn)答

1.什么是鹽析作用？鹽析的原理是什么?

答：鹽析作用：向蛋白質(zhì)溶液中漸漸加入中性鹽，在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)

溶解度隨之減小，發(fā)生了鹽析作用。產(chǎn)生鹽析作用的一個(gè)緣由是由于鹽離

子與蛋白質(zhì)表面具相反電性的離子基團(tuán)結(jié)合，形成離子對(duì)，因此鹽離子部

分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間電排斥作用減弱而能相互靠

攏，聚集起來(lái)。鹽析作用的另一個(gè)緣由是由于中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大,

鹽離子在水中發(fā)生水化而使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于

疏水區(qū)域的相互作用，使其沉淀。

2.如何選擇鹽析所用中性鹽？

(1)鹽析作用要強(qiáng)。一般來(lái)說(shuō)多價(jià)陰離子的鹽析作用強(qiáng)，有時(shí)多價(jià)陽(yáng)離

子反而使鹽析作用降低。

(2)鹽析用鹽要有足夠大的溶解度，且溶解度受溫度影響應(yīng)盡可能小。

這樣便于獲得高濃度鹽溶液，有利于操作，尤其是在較低溫度下的操作，

不致造成鹽結(jié)晶析出，影響鹽析效果。

(3)鹽析用鹽在生物學(xué)上是惰性的，不致影響蛋白質(zhì)等生物分子的活性,

最好不引入給分別或測(cè)定帶來(lái)麻煩的雜質(zhì)。

(4)來(lái)源豐富、經(jīng)濟(jì)。

3.有機(jī)溶劑沉淀的原理是什么？

答：親水性有機(jī)溶劑加入溶液后降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間

的靜電引力增加，聚集形成沉淀；水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了

自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的

親水性，導(dǎo)致脫水凝集。

4.有機(jī)溶劑沉淀影響沉淀效果的因素有那些？

答：(1)有機(jī)溶劑種類與用量

(2)pH的影響

(3)溫度無(wú)機(jī)鹽的含量

(4)某些金屬離子的助沉淀作用

(5)樣品濃度

第三章

1.影響發(fā)酵液固液分別的因素

1)發(fā)酵液中懸浮離子的大小

2)發(fā)酵液的黏度v運(yùn)cosity：

固液分別速度通常與粘度成反比，粘度越大，固液分別越困難。影響粘

度的因素：

菌體的種類和濃度(重要因素)

培育液中蛋白質(zhì)、核酸大量存在

培育基成分

此外，某些染菌發(fā)酵液，如染細(xì)菌，則粘度會(huì)增大。

發(fā)酵過(guò)程的不正常處理，如大量過(guò)剩的培育基和消沫油加入，都會(huì)使粘

度增大。

2.常見(jiàn)的固液分別方法

過(guò)濾filtration

過(guò)濾操作是借助于過(guò)濾介質(zhì)，在肯定的壓力差A(yù)P作用下，使懸浮液中

的液體通過(guò)介質(zhì)的孔道，而固體顆粒被截留在介質(zhì)上，從而實(shí)現(xiàn)固液分

別的單元操作。

離,小Centrifugation

離心分別是基于固體顆粒和四周液體密度存在差異，在離心場(chǎng)中使不同

密度的固體顆粒

加速沉降的分別過(guò)程。

擴(kuò)張床吸附EBA(ExpandedBedAdsorption)

一種新型的生物分別技術(shù)：集成化分別技術(shù)，即對(duì)已有的兩種或兩種以

上的單元操作進(jìn)行有效的組合，組成一種有效的單元操作，以達(dá)到提高

產(chǎn)品收率、縮短純化步驟、降低純化費(fèi)用和投資成本的目的

2.固液分別過(guò)濾設(shè)備

按操作方式分類：間歇過(guò)濾機(jī)、連續(xù)過(guò)濾機(jī)

按操作壓強(qiáng)差分類：壓濾、吸濾和離心過(guò)濾

典型過(guò)濾設(shè)備：

試驗(yàn)室用抽濾裝置

板框壓濾機(jī)(間歇操作)板框壓濾機(jī)的過(guò)濾推動(dòng)力來(lái)自泵產(chǎn)生的液壓或

進(jìn)料貯槽中的氣壓。

轉(zhuǎn)筒真空過(guò)濾機(jī)（連續(xù)操作）真空過(guò)濾設(shè)備以大氣與真空之間的壓力

差作為過(guò)濾操作的推動(dòng)力。生物工業(yè)中，用得較多的是轉(zhuǎn)筒式真空過(guò)濾

機(jī)和帶式真空過(guò)濾機(jī)。

過(guò)濾式離心機(jī):由于離心力作用，液體產(chǎn)生徑向壓差，通過(guò)濾餅、濾網(wǎng)

與濾筐而流出。

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2.離心分別設(shè)備優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

分別速度快，分別效率高、

液相澄清度好；

缺點(diǎn)：

與過(guò)濾設(shè)備相比，設(shè)備投資高、能耗大、

離心產(chǎn)生的固體濃縮物和過(guò)濾產(chǎn)生的濃縮不同。

通常離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。而過(guò)濾可獲得的水

分含量較低的濾餅。

3.離心的幾種原理類型

（一）差速離心

特點(diǎn)：

介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級(jí)離心。

用途：分別大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。

沉降依次:核——線粒體——溶酶體與過(guò)氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基

體——核蛋白體。

可將細(xì)胞器初步分別，常需進(jìn)一步通過(guò)密度梯離心再行分別純化。

（二）密度梯度離心

用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻

漿置于介質(zhì)的頂部,通過(guò)離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分別O

類型：速度沉降、等密度沉降。

常用介質(zhì)：氯化鈉、蔗糖、多聚蔗糖。

分別活細(xì)胞的介質(zhì)要求：

1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；

2）pH中性或易調(diào)為中性；

3）濃度大時(shí)滲透壓不大；

4）對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。

4.膨脹床吸附原理和固相分級(jí)特性

膨脹床與傳統(tǒng)固定床的區(qū)分在于：膨脹床的床層上部安裝有調(diào)整器，當(dāng)

料液或清洗液從床底輸入時(shí)，吸附劑床層產(chǎn)生膨脹，高度調(diào)整器上升，

膨脹床狀態(tài)下床層高度一般為固定床狀態(tài)的2-3倍，可干脆處理菌體

發(fā)酵液或細(xì)胞勻漿液，提高目標(biāo)產(chǎn)物收率。

膨脹床與流化床的區(qū)分：后者的吸附型粒子和液體在床層內(nèi)混合程度

高，吸附效率低，而前者的吸附劑粒子基本懸浮于固定的位置，液體的

流淌與固定床相像，接近平推流，吸附效率高。

第四章

細(xì)胞破裂的目的:破壞細(xì)胞外圍，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)。

意義：破裂細(xì)胞，提取其中的各種物質(zhì)，分析細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，遺傳物質(zhì)的

探討，對(duì)人類的發(fā)展具有重要的意義。

細(xì)胞破砰?方法分類

表今2

分類作用機(jī)理適應(yīng)性______________

可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大

固體剪切作用

珠磨法分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難

機(jī)可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適

高壓勻漿法液體剪切作用

合絲狀菌和革蘭氏陽(yáng)性菌

械

對(duì)酵母菌效果較差，破碎過(guò)程升溫劇烈，

超聲破碎法液體剪切作用

不適合大規(guī)模操作

法

破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感

法固體剪切作用

X-press目的產(chǎn)物不適應(yīng)

具有高度專一性，條件溫和，漿液易分

酶溶法酶分解作用

離，溶酶價(jià)格高，通用性差

非具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率

化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性

機(jī)較低，通用性差

滲透壓法破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用

械滲透壓劇烈改變

破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感的目的

法凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化

產(chǎn)物

干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活

包含體可用密度梯度離心機(jī)收集，收集的包含體用變性劑溶解，再除去

變性劑即可得到復(fù)原活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

1.非機(jī)械破裂方法有酶溶破裂法、化學(xué)破裂法、去垢劑破裂法、滲透壓沖

擊破裂法'凍融破裂法。

2.破裂率的測(cè)定：干脆測(cè)定法'目的產(chǎn)物測(cè)定法'導(dǎo)電率測(cè)定法

3.3因工程包涵體的純化過(guò)程為洗滌—、—溶解―和—復(fù)性

....,

目標(biāo)蛋白的變性溶解通常運(yùn)用的變性劑是—鹽酸服—和―尿素―;目標(biāo)

蛋白復(fù)性的方法通常有—稀釋法—、—膜分別法—和—層析法

4.氣流干燥主要適用于酵母菌,一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥

多用于細(xì)菌，冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)

5.細(xì)胞破裂常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS,陰離子型）；。

非離子型如TritonX-10。和吐溫（Tween）等對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的

親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層,使某些胞內(nèi)物質(zhì)

釋放出來(lái)

第五章

1.萃?。‥xtraction）指隨意兩相之間的傳質(zhì)過(guò)程。在液液萃取過(guò)程中

常用有機(jī)溶劑作為萃取試劑，因而經(jīng)常稱液液萃取為溶劑萃取。

溶劑萃取法是生物工業(yè)中一種重要的分別提取方法。它是利用一種溶質(zhì)

組分（如產(chǎn)物）在兩個(gè)互不相溶的液相（如水相和有用機(jī)溶劑相）中競(jìng)

爭(zhēng)性溶解和安排性質(zhì)上的差異來(lái)進(jìn)行分別操作的。有機(jī)溶劑萃取法廣泛

應(yīng)用于抗生素、有機(jī)酸、維生素、激素等發(fā)酵產(chǎn)物工業(yè)規(guī)模的提取上。

2.溶劑萃取法有以下一些優(yōu)點(diǎn)：比化學(xué)沉淀法分別程度高；比離子交換

法選擇性好、傳質(zhì)快；比蒸儲(chǔ)法能耗低。另外它還有生產(chǎn)實(shí)力大、周期

短、便于連續(xù)操作、簡(jiǎn)單實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化限制等優(yōu)點(diǎn)。

2.一個(gè)良好的溶劑要滿意以下幾方面的要求：

①有很大的萃取容量，即單位體積的萃取溶劑能萃取大量的產(chǎn)物;

②有良好的選擇性，志向狀況是只萃取產(chǎn)物而不萃取雜質(zhì)；

③與被萃取的液相（通常是水相）互溶度要小，且粘度低、界面

張力小或適中；

④溶劑的回收和再生簡(jiǎn)單；

⑤化學(xué)穩(wěn)定性好，不易分解，對(duì)設(shè)備腐蝕性??；

⑥經(jīng)濟(jì)性好，價(jià)廉易得；

⑦平安性好，閃點(diǎn)高，對(duì)人體無(wú)毒性或毒性低。

生物工業(yè)上常用的溶劑有酯類、醇類和酮類等.

3、單級(jí)萃取

單級(jí)萃取是運(yùn)用一個(gè)混合器和一個(gè)分別器的萃取操作。

料液F與萃取溶劑S一起加入混合器內(nèi)攪拌混合萃取，達(dá)到平衡后的溶液

送到分別器內(nèi)分別得到萃取相L和萃余相R,萃取相送至回收器，萃余相

R為廢液。

在回收器內(nèi)產(chǎn)物P與溶劑分別(如蒸儲(chǔ)、反萃取等)，溶劑S

則可循環(huán)運(yùn)用。

目的物在兩相中的數(shù)量比：

E=K?VS/VF=K/m

其中m為濃縮比，即：m=VF/VS

令未被萃取的分率為甲，貝IJ：

甲=1/(E+1)

而理論收(得)率：1一年=E/(E+1)

脅施素在骯柳H2.5時(shí)的分繇數(shù)為35,若用等體積的乙笛進(jìn)行

單除取一丸則

占35.

理論解為

1=嬴=97。%

因?yàn)檫@種雕辟取一次,所以-麟取效率福,陶在率余相的含翱

A段嬴如果增懈劑的用最會(huì)腳取鏟麟度過(guò)氏增加產(chǎn)物回收雕

㈱魅,也會(huì)增加溶劑回收的工作品為魏送些腦,工業(yè)上多采取多解

取的魏，

4、多級(jí)萃取

1）多級(jí)錯(cuò)流萃取

圖5-5多級(jí)錯(cuò)流萃取流程

多級(jí)錯(cuò)流萃取流程的特點(diǎn)是：每級(jí)均加簇新溶劑，故溶劑消耗量大，得到

的萃取液產(chǎn)物平均濃度較稀，但萃取較完全。多級(jí)錯(cuò)流萃取流程收率

l-cp=l-l/(El+l)(E2+l)---(En+l)

例如,對(duì)赤雷索果用二級(jí)錯(cuò)果用取時(shí),K為35,第一級(jí)用體積乙胤

第二級(jí)用1/10體積乙酯，則有

Ei=35x1/2=17.5E2=35x140=3.5

11

可以看到，在二級(jí)錯(cuò)流莓取中，當(dāng)乙雷總用量為3/5體積時(shí)，理論得率為

98.79%,比乙酯用量為【體積的單級(jí)萃取得率97.2%還要高一些。

多級(jí)錯(cuò)液萃取的特點(diǎn)是在每級(jí)中都加入新鮮的溶劑，故萃取推動(dòng)力較大，萃

取較完全且效果好。缺點(diǎn)是溶劑用量大，萃取液平均濃度較稀，溶劑回收需要用

耗較多的能量，

2）多級(jí)逆流萃取

圖5-6多級(jí)逆流萃取流程

多級(jí)逆流萃取流程的特點(diǎn)是：料液走向和萃取劑走向相反，只在最終一級(jí)

中加入萃取劑，故和錯(cuò)流萃取相比，萃取劑消耗少，萃取液產(chǎn)物平均濃度

高,產(chǎn)物收率最高。

多級(jí)逆流萃取流程收率

l-cp=（En+l-E）/（En+l-l）

赤霉素二級(jí)逆流萃取的K為35,乙酯用量為1〃體積，則有

E]=35x172=17.5w=2

1

i="溜）Ff=99-7%

可以看到，三種萃取流程中,以逆流萃取收率最高，溶劑用量最少，因而

普遍采用。

5.乳化和去乳化

乳化：是一種液體（分散相）分散在另一種不相混溶的液體（連續(xù)相）

中的現(xiàn)象。乳化發(fā)生后，兩相分層困難，出現(xiàn)夾帶現(xiàn)象，影響收率和分

別效果。

乳化的結(jié)果可能形成兩種形式的乳濁液。一種是水包油型（O/W）,

另一種為油包水型（W/O）。

由蛋白質(zhì)引起的乳化，構(gòu)成形式為O/W型，液滴粒徑再.5?30微米。

形成穩(wěn)定的乳濁液，一般應(yīng)有第三種物質(zhì)即表面活性劑的存

在。乳濁液的穩(wěn)定性與下列因素有關(guān)：

①界面上愛(ài)護(hù)膜是否形成；

②液滴是否帶電；

③介質(zhì)的粘度。

其中①最重要。在發(fā)酵液中，蛋白質(zhì)是引起乳化的最重要的表

面活性物質(zhì)。

表面活性劑親水性強(qiáng)，乳化時(shí)易形成水包油。

表面活性劑疏水性強(qiáng)，乳化時(shí)易形成油包水。

6、破乳化

破乳方法：

1）過(guò)濾或離心分別破乳法，

2）化學(xué)法（加電解質(zhì)中和離子型乳濁液的電荷）

3）物理法（加熱、稀釋、吸附等）

4）頂替法（加入表面活性更大，但因其C鏈較短難以形

成堅(jiān)實(shí)的愛(ài)護(hù)膜的物質(zhì)，取代界面上的乳化劑，如戊醇）

5）轉(zhuǎn)型法（如在O/W中加入親油性乳化劑，使乳化液有

生成W/O的傾向，但又不穩(wěn)定，從而達(dá)到破乳目的）

7.浸?。河媚撤N溶劑把有用物質(zhì)從固體原料中提取到溶液中的過(guò)程稱為

浸取，也稱之為浸出。

溶劑從固體顆粒中浸取可溶性物質(zhì)的過(guò)程一般包括以下一些步驟：

1）溶劑從溶劑主體傳遞到固體顆粒的表面；

2）溶劑擴(kuò)散滲入固體內(nèi)部和內(nèi)部微孔隙內(nèi)；

3）溶質(zhì)溶解進(jìn)入溶劑；

4）通過(guò)固體微孔隙通道中的溶液擴(kuò)散至固體表面并進(jìn)一步進(jìn)入溶劑主

體。

其中，第3和4步是浸取過(guò)程總速率的限制性步驟。

溶質(zhì)從固體內(nèi)部向溶劑主體的傳遞受各種因素的影響。包括幾個(gè)方面：

1）通常狀況，為一般的擴(kuò)散傳遞。

2）對(duì)于生物大分子，傳遞通道的空間尺度影響較大。

3）溶液中的凝膠物質(zhì)形成的框架結(jié)構(gòu)會(huì)影響分子的擴(kuò)散。

4）在固體內(nèi)部的分子擴(kuò)散包含兩種不同的機(jī)理（溶解擴(kuò)散和多孔內(nèi)擴(kuò)

散）。

8、安排定律和安排系數(shù)

從料液中提取出來(lái)的物質(zhì)稱為溶質(zhì)；

用來(lái)萃取產(chǎn)物的溶劑常稱為萃取劑；

溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與萃取劑形成的溶液稱為萃取液；

被萃取出溶質(zhì)后的料液稱萃余液。

在肯定溫度肯定壓力的條件下，溶質(zhì)安排在兩個(gè)互不相溶的溶劑

中，達(dá)到平衡時(shí)溶質(zhì)在兩相中的活度之比為一常數(shù)，這個(gè)現(xiàn)象即為安排

定律，比例常數(shù)為安排系數(shù)。

安排定律成立的條件：

1）稀溶液

2)溶質(zhì)對(duì)溶劑互溶性沒(méi)有影響

3)必需是同一分子類型

不同溶質(zhì)在不同溶劑中有不同的K值。K值越大，表示該溶質(zhì)在上層

液相中溶解度愈大，K值越小，表示該溶質(zhì)在下層液相中溶解度愈大。

9.分別因數(shù)

含有兩個(gè)與兩個(gè)以上的溶質(zhì)時(shí)，萃取劑對(duì)溶質(zhì)A和B分別實(shí)力的大小

可用分別因數(shù)網(wǎng)來(lái)表征：

B=(C1A/C1B)/(C2A/C2B)=(C1A/C2A)/(C1B/C2B)

=KA/KB

式中：C代表濃度，下標(biāo)1、2代表萃取相和萃余相，A、B為溶質(zhì)。

假如A是產(chǎn)物，B為雜質(zhì)，分別因數(shù)可寫(xiě)為：

B=K產(chǎn)/K雜

B越大，A、B的分別效果越好，即產(chǎn)物與雜質(zhì)越簡(jiǎn)單分別。

10.弱電解質(zhì)表觀安排系數(shù)

(1)pH值

假如溶質(zhì)是弱酸，表觀安排系數(shù)為K=KO[H+]/(Kp+[H+]),假如

是弱堿，則K=K0Kp/(Kp+[H+])o可見(jiàn)pH干脆影響表觀安排系數(shù)。

pH除影響K外，還可能對(duì)選擇性有影響。

pH值還應(yīng)盡量選擇在使產(chǎn)物穩(wěn)定的范圍內(nèi)。

(2)溫度

溫度會(huì)影響生化物質(zhì)的穩(wěn)定性，所以一般在室溫或低溫下進(jìn)

行。

溫度會(huì)影響安排系數(shù)K,因?yàn)闇囟韧ㄟ^(guò)影響溶質(zhì)的化學(xué)位而影響溶

質(zhì)在兩相中的安排。

(3)鹽析

無(wú)機(jī)鹽類可降低產(chǎn)物在水中的溶解度而使其更易于轉(zhuǎn)入有機(jī)

溶劑相中。

無(wú)機(jī)鹽類還能減小有機(jī)溶劑在水相中的溶解度。

鹽析劑用量要相宜，用量過(guò)多也有可能促使雜質(zhì)一起轉(zhuǎn)入溶劑相，

同時(shí)還要考慮其經(jīng)濟(jì)性，必要時(shí)要回收。

(4)帶溶劑

帶溶劑是指這樣一種物質(zhì)，它們能和產(chǎn)物形成復(fù)合物，使產(chǎn)物更易

溶于有機(jī)溶劑相中，提高安排系數(shù)K,該復(fù)合物在肯定條件下又要簡(jiǎn)單

分解。

第七章

1.雙水相系統(tǒng)

雙水相系統(tǒng)就是當(dāng)兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于水中而形成

溶液時(shí)，由于聚合物溶液間或聚合物與無(wú)機(jī)鹽溶液間具有不相容性，致

使當(dāng)聚合物和無(wú)機(jī)鹽的濃度達(dá)到肯定值以上時(shí)，就會(huì)分成互不相溶的兩

相系統(tǒng)，由于其共同溶劑是水，就稱此系統(tǒng)為雙水相系統(tǒng)。常見(jiàn)的用于

生物物質(zhì)分別的聚合物/聚合物系統(tǒng)有聚乙二醇（PEG）/葡聚糖，聚

合物/無(wú)機(jī)鹽系統(tǒng)有PEG/磷酸鹽，PEG/硫酸錢(qián)等。相對(duì)于葡聚糖來(lái)

說(shuō)，無(wú)機(jī)鹽價(jià)格便宜，所以聚合物/無(wú)機(jī)鹽系統(tǒng)在工業(yè)應(yīng)用上具有更為

廣袤的前景。

雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用舉例

生物物質(zhì)種類典型例子相體系

酶過(guò)氧化氫酶PEG/Dextran

核酸有活性的DNAPEG/Dextran

生長(zhǎng)索人生長(zhǎng)激素PEG/鹽

病毒脊儲(chǔ)病毒和線病毒PEG/NaDS（硫酸簡(jiǎn)聚糖:

干擾素B-干擾索PE號(hào)磷酸酯/鹽

細(xì)胞組織含有膽堿受體的細(xì)胞三甲胺-PEG/Dextran

2.要?jiǎng)倮剡\(yùn)用雙水相萃取方法，應(yīng)滿意下列條件：

1）欲提取的酶和細(xì)胞碎片應(yīng)安排在不同的相中；

2）酶的安排系數(shù)應(yīng)足夠大，使在肯定的相體積比時(shí)，經(jīng)過(guò)一

次萃取，就能得到較高的收率；

3）兩相用離心機(jī)很簡(jiǎn)單分別。

3.相圖

水溶性兩相的形成條件和定量關(guān)系常用相圖來(lái)表示。圖1所示是

由兩種聚合物和水組成的體系（如PEG/Dextran體系，這兩種聚合

物都能與水無(wú)限混合），以聚合物PEG的濃度（重量％）為縱坐標(biāo)，

以聚合物Dextran的濃度（重量％）為橫坐標(biāo)所作相圖。只有在這兩

種聚合物達(dá)到肯定濃度時(shí)才會(huì)形成兩相。

Dextran

圖1PEG/Dextran體系的相圖

（參考嚴(yán)希康，1998:俞俊棠等，1997）

圖中曲線TCB把勻稱區(qū)域和兩相區(qū)域分隔開(kāi)來(lái)，稱作雙節(jié)線。處于

雙節(jié)線下面的區(qū)域時(shí)是勻稱的，當(dāng)它們的組成位于上面的區(qū)域時(shí)，體系

才會(huì)分成兩相。例如，點(diǎn)M代表整個(gè)系統(tǒng)的組成，輕相（或上相）組

成用T點(diǎn)表示，重相（或下相）組成用B點(diǎn)表示。T、M、B三點(diǎn)在一

條直線上，其連接的直線稱系線。

T和B代表成平衡的兩極在同一條系線上

在以上的財(cái)相系斛,各種轆、

的各點(diǎn)分成的兩相，具有相同的組分，但

體積比不同。若令%、％分別代表上相觸料的分繇數(shù)或大于100,或小于

和下相的體積，則有

血;蛋白質(zhì)或前的分陽(yáng)系數(shù)在

%MT（M點(diǎn)與T點(diǎn)之間的距離）001?10

VB-BM（B點(diǎn)與M點(diǎn)之間的距離）之間;無(wú)觸的M系教-雌近于1.0。

（14-1）這種不醐質(zhì)分繇致睚杲懶了財(cái)

即服從于習(xí)知的杠桿規(guī)吼若總組成點(diǎn)在

相就分離的翱,

雙節(jié)線的下方，體系只能形成均-的-相。

第九章

膜分別：利用膜的選擇性（孔徑大小），以膜的兩側(cè)存在的能量差作為推

動(dòng)力，由于溶液中各組分透過(guò)膜的遷移率不同而實(shí)現(xiàn)分別的一種技術(shù)。

濃差極化：是指但溶劑透過(guò)膜，而溶質(zhì)留在膜上，因而使膜面濃度增大，

并高于主體中濃度。

1.膜分別過(guò)程中所運(yùn)用的膜，依據(jù)其膜（孔徑）不同可分為（微濾膜），

（超濾膜），（納濾膜）和（反滲透膜）。

2.工業(yè)上常用的膜裝置有（板式），（管式），（螺旋卷式）和（中空

纖維式）。

3.依據(jù)膜結(jié)構(gòu)的不同，常用的膜可分為（對(duì)稱性膜）、（非對(duì)稱膜）和（復(fù)

合膜）三類

4.膜的污染主要有兩種狀況，一種是化學(xué)污染；另一種是物理污

1.區(qū)分滲透與反滲透？舉例說(shuō)明反滲透的應(yīng)用。

答：滲透是由于存在化學(xué)勢(shì)存在梯度而引起的自發(fā)擴(kuò)散現(xiàn)象。

因此，通常狀況下，

其結(jié)果是水從純水一側(cè)透過(guò)半透膜向溶液側(cè)滲透，使后者的液位抬高。

假如在溶液一側(cè)施加壓力4,外界力做功使溶液中水的化學(xué)勢(shì)上升，則純

水通過(guò)膜的滲透就會(huì)漸漸減小，并最終停止（條件？），此時(shí)的壓力差就

是溶液的滲透壓萬(wàn)。

當(dāng)6-乙＞"時(shí)，水將從溶液一側(cè)向純水一側(cè)移動(dòng)，此種滲透稱之為反滲透。

2.膜分別過(guò)程中，有那些緣由會(huì)造成膜污染，如何處理？

答：（1）膜污染主要有兩種狀況：一是附著層被濾餅、有機(jī)物凝膠、無(wú)

機(jī)物水垢膠體物質(zhì)或微生物等吸附于表面；另一種是料液中溶質(zhì)結(jié)晶或沉

淀造成堵塞。（3分）

（2）膜污染是可以預(yù)防或減輕的，措施包括料液預(yù)處理、膜性質(zhì)的改善、

操作條件變更等方式。（2分）

（3）膜污染所引起的通量衰減往往是不行逆的，只能通過(guò)清洗的處理方

式消退，包括物理方法沖洗和化學(xué)藥品溶液清洗等。（2分）

1.膜分別技術(shù)的類型和定義？

答：膜分別過(guò)程的實(shí)質(zhì)是物質(zhì)透過(guò)或被截留于膜的過(guò)程，近似于篩分過(guò)程,

依據(jù)濾膜孔徑大小而達(dá)到物質(zhì)分別的目的，故而可以按分別粒子大小進(jìn)行

分類:

(1)微濾：以多孔細(xì)小薄膜為過(guò)濾介質(zhì)，壓力為推動(dòng)力，使不溶性物質(zhì)

得以分別的操作，孔徑分布范圍在。.025~14Hm之間；

(2)超濾：分別介質(zhì)同上，但孔徑更小，為。.001~0.02Rm,分別推

動(dòng)力仍為壓力差，適合于分別酶、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)；

(3)反滲透：是一種以壓力差為推動(dòng)力，從溶液