各種液相色譜檢測(cè)器介紹 液相色譜操作規(guī)程

第第頁(yè)各種液相色譜檢測(cè)器介紹液相色譜操作規(guī)程紫外吸取檢測(cè)器ultravioletabsorptiondetector紫外吸取檢測(cè)器ultravioletabsorptiondetector簡(jiǎn)稱紫外檢測(cè)器（UV），是基于溶質(zhì)分紫外吸取檢測(cè)器ultravioletabsorptiondetector

紫外吸取檢測(cè)器ultravioletabsorptiondetector簡(jiǎn)稱紫外檢測(cè)器（UV），是基于溶質(zhì)分子吸取紫外光的原理設(shè)計(jì)的檢測(cè)器。由于大部分常見(jiàn)有機(jī)物質(zhì)和部分無(wú)機(jī)物質(zhì)都具有紫外吸取性質(zhì)，所以該檢測(cè)器是液相色譜中應(yīng)用廣泛的檢測(cè)器，幾乎全部液相色譜儀都配置了這種檢測(cè)器。它不僅有較好的選擇性和較高的靈敏度，而且對(duì)環(huán)境溫度、流動(dòng)相構(gòu)成變化和流速波動(dòng)不太敏感，因此既可用于等度洗脫，也可用于梯度洗脫。其檢測(cè)靈敏度在mg/L至mg/L范圍。

可見(jiàn)光檢測(cè)器visiblelightdetector

可見(jiàn)光檢測(cè)器visiblelightdetector又稱分光光度檢測(cè)器，是基于溶質(zhì)分子吸取可見(jiàn)光的原理設(shè)計(jì)的檢測(cè)器。能夠直接接受可見(jiàn)光檢測(cè)的溶質(zhì)不是很多，而且多數(shù)靈敏度也不高，但接受具有高摩爾吸光系數(shù)的有機(jī)試劑（配位體和螯合劑）作為衍生化試劑進(jìn)行柱前或柱后衍生操作的衍生化光度檢測(cè)法是相當(dāng)有用的，特別是在金屬離子搭配物液相色譜中的應(yīng)用是相當(dāng)成功的。

低壓梯度low—pressuregradient

低壓梯度low—pressuregradient又稱外梯度，是在低壓狀態(tài)下完成流動(dòng)相強(qiáng)度調(diào)整的梯度裝置。只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。由于比例閥是在泵之前，所以是在常壓（低壓）下混合之后再增壓輸送到色譜柱的。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器克服常見(jiàn)的HPLC檢測(cè)難題

雖然陣法光散射檢測(cè)器（EvaportivelightScattering,ELSD）已經(jīng)開(kāi)發(fā)生產(chǎn)15年，但是對(duì)于很多色譜工來(lái)說(shuō)，它仍是一個(gè)新產(chǎn)品。第一臺(tái)ELSD是由澳大利亞的UnionCarbide討論試驗(yàn)室的科學(xué)家研制開(kāi)發(fā)的，并在八十時(shí)代初轉(zhuǎn)化為商品，八十時(shí)代以激光為光源的第二代ELSD面世。此后，通過(guò)不斷設(shè)計(jì)提高了ELSD的操作性能。現(xiàn)在ELSD越來(lái)越多的作為通用型檢測(cè)器]用于高效液相色譜，超臨界色譜（SFC）和逆流色譜中。ELSD最大的優(yōu)越性在于能檢測(cè)不含發(fā)色團(tuán)的化合物，如：碳水化合物、脂類、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性劑、藥物，并在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品和化合物結(jié)構(gòu)參數(shù)未知的情況下檢測(cè)未知化合物。

ELSD的通用檢測(cè)方法除去了常見(jiàn)于傳統(tǒng)HPLC檢測(cè)方法中的難點(diǎn)，不同于紫外和熒光檢測(cè)器，ELSD的響應(yīng)不倚靠與樣品的光學(xué)特性，任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測(cè)，不受其官能團(tuán)的影響。ELSD

的響應(yīng)值與樣品的質(zhì)量成正比，因而能用于測(cè)定樣品的純度或者檢測(cè)未知物。示差檢測(cè)器（RI）也可以說(shuō)是一種通用型檢測(cè)器，打它靈敏度低，并與梯度脫洗不相容。質(zhì)譜是另一種通用型檢測(cè)器，但它的昂貴操作費(fèi)用和多而雜性限制了它的應(yīng)用。

ELSD的獨(dú)特檢測(cè)方法，對(duì)于它的多種用途和高性能至為關(guān)鍵。ELSD檢測(cè)只要分為三個(gè)步驟：（1）用惰性氣體霧化脫洗液（2）流動(dòng)相在加熱管（漂移管）中蒸發(fā)（3）樣品顆粒散射光后得到檢測(cè)。

討論:

UV檢測(cè)的緊要缺點(diǎn)在于紫外不吸取的化合物靈敏度很低。ELSD可以檢測(cè)任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品。ELSD的通用性響應(yīng)值使得ELSD響應(yīng)值比UV響應(yīng)值更能代表樣品的質(zhì)量

不同于紫外檢測(cè)只能使用不吸取紫外的流動(dòng)相，ELSD能與任何的揮發(fā)性流動(dòng)相相容，不論其光學(xué)特性。您可依據(jù)樣品的溶解度或分別特性選擇流動(dòng)相，例如選擇氯仿和丙酮用于脂類的分別以提高樣品的溶解性。用紫外檢測(cè)器定量未知物是困難的，由于樣品的紫外吸取值往往和代表樣品的質(zhì)量的色譜峰的大小無(wú)關(guān)。ELSD對(duì)幾乎全部的樣品給出一致的響應(yīng)因子。因此可以通過(guò)和內(nèi)標(biāo)比較定量未知化合物，此特性對(duì)于使用組合化合技術(shù)而合成的系列化合物的定量尤其有用。用組合合成技術(shù)合成的化合物通常是用HPLC聯(lián)合低波長(zhǎng)紫外或質(zhì)譜檢測(cè)進(jìn)行分析，但是，在缺乏已表面活性劑特別靈敏，并在梯度脫洗下維知結(jié)構(gòu)參數(shù)已知的參照標(biāo)準(zhǔn)品情況下，兩種方法都不能精準(zhǔn)的定量分析此種系列化合物。

熒光檢測(cè)

熒光檢測(cè)的緊要缺點(diǎn)在于只有少數(shù)化合物產(chǎn)生熒光。大多數(shù)的分子不發(fā)熒光，但含有可衍生的官能團(tuán)用于合成能發(fā)熒光的衍生物，例如，鄰苯二甲醛是一種常用熒光基團(tuán)用于柱后衍生氨基酸。雖然熒光檢測(cè)很靈敏，但對(duì)于常見(jiàn)的樣品分析來(lái)說(shuō)不需要如此高的靈敏度。由于ELSD的響應(yīng)不倚靠于熒光基團(tuán)，所以不需要衍生，因此大大降低了樣品預(yù)處理和分析時(shí)間。

示差檢測(cè)：

雖然示差檢測(cè)在原理上是通用型檢測(cè)器，但是它的靈敏度低，和梯度脫洗不相容，因此它對(duì)于HPLC來(lái)說(shuō)不是理想的檢測(cè)器。室溫的變化會(huì)影響基線的穩(wěn)定性，大的溶劑前沿峰可能會(huì)掩蓋前期脫洗的色譜峰。由于ELSD在檢測(cè)前將流動(dòng)相蒸發(fā)，所以基線的噪聲和漂移都很小，因此基線穩(wěn)定和樣品檢測(cè)的靈敏度高。流動(dòng)相的蒸發(fā)使得ELSD和梯度脫洗相容，因而可提高色譜分別的辨別率和縮短分別時(shí)間。另外ELSD比RI檢測(cè)蔗糖靈敏度高和基線穩(wěn)定。

應(yīng)用實(shí)例：

近年來(lái)，脂類在生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域中的緊要性正在日益引起廣泛的關(guān)注。脂類的分析方法對(duì)于很多討論工作，臨床使用和質(zhì)量掌控方面都特別緊要。大多數(shù)的脂類分子都缺乏適當(dāng)?shù)陌l(fā)色團(tuán)，因此脂類除非通過(guò)衍生化，否則不能用紫外檢測(cè)。一般但一樣品種含有的各種脂類其極性差異很大，弱項(xiàng)要達(dá)到個(gè)作分的較佳分別和辨別率需要使用梯度脫洗，因而限制了示差檢測(cè)器的使用。不同于UV和RI的局限性，ELSD是脂類檢測(cè)的有用工具。

碳水化合物不帶有發(fā)色團(tuán)，因而不能用UV來(lái)檢測(cè)。他們通常用氨基柱或者陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分別。但是示差檢測(cè)器不是很靈敏，而且需要掌控溫度來(lái)維持基線穩(wěn)定，不能與梯度脫洗相容。ELSD靈敏度高，基線穩(wěn)定，與梯度脫洗相容。

隨著高聚物和表面活性劑在很多行業(yè)中的廣泛應(yīng)用，簡(jiǎn)單和牢靠的分析方法的尤為緊要，他們通常是不含有發(fā)色團(tuán)的復(fù)合分子。此類化合物不帶有適當(dāng)?shù)陌l(fā)色團(tuán)和分別是需要接受梯度脫洗意味著不能接受示差和紫外檢測(cè)器。ELSD檢測(cè)高聚物和表面活性劑可以保持基線穩(wěn)定。

在科研、臨床和生產(chǎn)的工藝掌控上，藥物需要分析評(píng)估。目前，隨著日益增長(zhǎng)的加速藥品開(kāi)發(fā)的要求，藥品工需要一種開(kāi)速的鑒定方法來(lái)測(cè)定帶物的代謝物、雜質(zhì)、降解物和各種天然產(chǎn)物，很多不含有適當(dāng)?shù)陌l(fā)色團(tuán)，限制了紫外檢測(cè)器的使用。示差比紫外檢測(cè)器的靈敏度要低，且不能與梯度脫洗相容，而多而雜的藥品分析常需要梯度脫洗。ELSD的通用檢測(cè)本領(lǐng)和梯度相容性使得ELSD是藥物分析的理想工具。由于ELSD的響應(yīng)接近于代表產(chǎn)品的質(zhì)量，所以即使在降解產(chǎn)物和雜質(zhì)的性質(zhì)不明確的情況下ELSD的使用為藥物雜質(zhì)分析供應(yīng)較快速的方法。

結(jié)論：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器正日益成為分析碳?xì)浠衔?、表面活性劑、聚合物、脂肪酸和氨基酸、油和其他難檢樣品的強(qiáng)大工具，多用途的ELSD能檢測(cè)任何揮發(fā)相低于流動(dòng)相的樣品，克服了常見(jiàn)于示差和紫外檢測(cè)器的缺點(diǎn)。

紫外—可見(jiàn)光（UV—VIS）檢測(cè)器

原理：基于Lambert—Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見(jiàn)光具有吸取，且吸取強(qiáng)度與組分濃度成正比。

很多有機(jī)分子都具紫外或可見(jiàn)光吸取基團(tuán)，有較強(qiáng)的紫外或可見(jiàn)光吸取本領(lǐng)，因此UV—VIS檢測(cè)器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV—VIS對(duì)環(huán)境溫度、流速、流動(dòng)相構(gòu)成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。一般的液相色譜儀都配置有UV—VIS檢測(cè)器。

用UV—VIS檢測(cè)時(shí)，為了得到高的靈敏度，常選擇被測(cè)物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸取的波長(zhǎng)作檢測(cè)波長(zhǎng)，但為了選擇性或其它目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸取稍弱的波長(zhǎng)，另外，應(yīng)盡可能選擇在檢測(cè)波長(zhǎng)下沒(méi)有背景吸取的流動(dòng)相。

二極管陣列檢測(cè)器（diode—arraydetector,DAD）：以光電二極管陣列（或CCD陣列，硅靶攝像管等）作為檢測(cè)元件的UV—VIS檢測(cè)器（圖8—15）。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長(zhǎng)的信號(hào)，然后，對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的三維譜圖。與一般UV—VIS檢測(cè)器不同的是，一般UV—VIS檢測(cè)器是先用單色器分光，只讓特定波長(zhǎng)的光進(jìn)入流動(dòng)池。而二極管陣列UV—VIS檢測(cè)器是先讓全部波長(zhǎng)的光都通過(guò)流動(dòng)池，然后通過(guò)一系列分光技術(shù)，使全部波長(zhǎng)的光在接受器上被檢

直接紫外檢測(cè)：所使用的流動(dòng)相為在檢測(cè)波長(zhǎng)下無(wú)紫外吸取的溶劑，檢測(cè)器直接測(cè)定被測(cè)組分的紫外吸取強(qiáng)度。多數(shù)情況下接受直接紫外檢測(cè)。

間接紫外檢測(cè)：使用具有紫外吸取的溶液作流動(dòng)相，間接檢測(cè)無(wú)紫外吸取的組分。在離子色譜中使用較多，如以具有紫外吸取的鄰苯二甲酸氫鉀溶液作陰離子分別的流動(dòng)相，當(dāng)無(wú)紫外吸取的無(wú)機(jī)陰離子被洗脫到流動(dòng)相中時(shí)，會(huì)使流動(dòng)相的紫外吸取減小。

柱后衍生化光度檢測(cè)：對(duì)于那些可以與顯色劑反應(yīng)生成有色搭配物的組分（過(guò)渡金屬離子、氨基酸等），可以在組分從色譜柱中洗脫出來(lái)之后與合適的顯色劑反應(yīng)，在可見(jiàn)光區(qū)檢測(cè)生成的有色搭配物

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相關(guān)熱詞：

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色譜是一種分別分析手段，分別是核心，因此擔(dān)負(fù)分別作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等，色譜柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到較佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)及裝填技術(shù)。1、高效液相色譜柱的保養(yǎng)色譜柱在使用前，可以進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是依照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測(cè)試所使用的條件是較佳條件），只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。我們?cè)趯?duì)色譜柱使用前進(jìn)行測(cè)試以后，我們要依據(jù)不同的情況對(duì)色譜柱進(jìn)行保養(yǎng)：①反相色譜柱每天試驗(yàn)后的保養(yǎng)：使用緩沖液或含鹽的流動(dòng)相，試驗(yàn)完成后應(yīng)用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)當(dāng)在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。②長(zhǎng)期保存色譜柱：如色譜柱要長(zhǎng)時(shí)間保存，必需存于合適的溶劑下。對(duì)于反相柱可以儲(chǔ)存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲(chǔ)存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲(chǔ)存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購(gòu)買新色譜柱時(shí)附送的堵頭堵上。儲(chǔ)存的溫度可以是室溫.2、高效液相色譜柱的維護(hù)我們?cè)谑褂眯碌纳V柱應(yīng)當(dāng)在我們本身的液相色譜儀上進(jìn)行性能測(cè)試，即使用色譜柱附帶的檢驗(yàn)報(bào)告上測(cè)試條件和樣品來(lái)測(cè)定該色譜柱的柱效。并且，在以后的使用中，應(yīng)時(shí)常對(duì)色譜柱進(jìn)行測(cè)試。而且在使用的過(guò)程中常常有堵塞的現(xiàn)象，造成這種現(xiàn)象的緊要原因是①溶劑中的不溶物；②樣品中的不溶物；③泵進(jìn)樣器等中的不溶物；④柱內(nèi)不溶物的形成等。假如當(dāng)色譜柱堵塞以后我們可以對(duì)色譜柱進(jìn)行修復(fù)，首先，使用含鹽緩沖液后（如離子對(duì)試劑）應(yīng)用溶解性強(qiáng)的溶劑（如水）進(jìn)行沖洗。其次，先斷開(kāi)檢測(cè)器，然后用對(duì)來(lái)自樣品中的物質(zhì)有強(qiáng)溶解性的溶劑進(jìn)行沖洗，對(duì)于反相色譜柱，可使用甲醇、乙睛、四氫呋喃、氯仿、庚烷等，在此條件下，應(yīng)避開(kāi)溶劑的pH低于2或高于8、最后假如經(jīng)過(guò)上述還是沒(méi)有修復(fù)，色譜柱壓力還是沒(méi)有下降，則要斷開(kāi)檢測(cè)器，將色譜柱反方向放置，然后檢查柱壓，若壓力穩(wěn)定下降，則保持色譜柱反方向連接，用低于0.5ml/min流速?zèng)_洗一小時(shí)。假如壓力不下降，則要看內(nèi)置過(guò)濾器是否被堵塞，假如被堵塞應(yīng)沖洗或更換，若進(jìn)口端的填料發(fā)生堵塞，柱子將不可能被徹底恢復(fù)，只能通過(guò)去掉進(jìn)口端的部分填料，重新填充進(jìn)行有限的柱效恢復(fù)。而且修復(fù)的厚度是2—5mm