適用于新高考新教材浙江專版2025屆高考生物一輪總復習第9單元生物技術與工程熱點練9新情境下基因工程的綜合應用浙科版

熱點練(九)新情境下基因工程的綜合應用1.(2024浙江溫州二模)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于動植物中具有金屬結合實力的蛋白質(zhì),確定該蛋白質(zhì)合成的基因結構如圖1所示,其中A鏈為編碼鏈、B鏈為模板鏈?？蒲腥藛T利用圖2所示質(zhì)粒構建棗樹的MT基因重組DNA分子并導入大腸桿菌細胞,獲得對重金屬鎘(Cd)具有吸附實力和耐受實力的MT工程菌。圖1圖2注:XhoⅠ、KpnⅠ、PstⅠ為不同限制酶的識別位點;LacZ基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以催化無色物質(zhì)X-gal產(chǎn)生藍色物質(zhì)使菌落呈現(xiàn)藍色,否則菌落為白色;ampr基因為氨芐青霉素抗性基因?；卮鹣铝袉栴}。(1)獲得目的基因提取棗樹細胞的,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。為了使PCR擴增后的產(chǎn)物依據(jù)正確的方向與已被酶切的載體連接,克隆MT基因時應選擇的引物組合是,并在其(填“5'”或“3'”)末端分別添加限制酶的識別序列。

(2)構建重組DNA分子①啟動子是識別并結合的部位;基因工程中構建用于原核生物的表達載體時,常用的啟動子不包括以下哪一項?(A.噬菌體基因啟動子

B.乳酸菌基因啟動子C.大腸桿菌基因啟動子D.棗樹MT基因啟動子)②影響DNA連接反應的主要因素除pH與溫度等操作環(huán)境、反應時間、DNA連接酶的種類及濃度外,還有等(答出1項即可)。

(3)導入、篩選和鑒定MT工程菌①將得到的混合物導入到用處理的大腸桿菌完成試驗。

②將菌液稀釋并涂布在含X-gal和氨芐青霉素的培育基上進行培育后,隨機挑取的單菌落可獲得MT工程菌。

③欲進一步對MT工程菌進行鑒定,可將挑取出的MT工程菌與分別接種至含的LB液體培育基中,置于恒溫培育箱中培育,相宜時間后檢測菌種數(shù)量。(4)擴大菌種將MT工程菌接種至發(fā)酵罐內(nèi)進行擴增,培育過程中可定期取樣并運用細菌計數(shù)板對(填“菌體”或“菌落”)進行干脆計數(shù),以評估增殖狀況。發(fā)酵結束后,接受(答出1項即可)等方法獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)品。

2.(2024浙江名校協(xié)作體高三二模)番茄的果實養(yǎng)分豐富,是深受人們寵愛的蔬果,但番茄不抗凍,在我國冬季無法栽培?，F(xiàn)有科研人員利用轉(zhuǎn)基因技術,將北極海魚中的抗凍基因轉(zhuǎn)入到了番茄細胞中,從而勝利培育抗凍番茄。導入目的基因的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,圖1為培育過程運用的Ti質(zhì)粒,已知Vir區(qū)的基因活化能促進T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移?；卮鹣铝袉栴}。圖1圖2(1)若經(jīng)過誘變,北極海魚的一條染色體上的抗凍基因發(fā)生了堿基對的替換,導致抗凍實力大大增加,通過瓊脂糖凝膠電泳,能否區(qū)分突變前后的兩個抗凍基因?,請說明理由:

。

(2)對于目的基因的獲得,探討人員提取了抗凍蛋白,依據(jù)氨基酸序列分析了mRNA的堿基序列,繼而合成了抗凍基因,通過這種方法得到的目的基因因不含、,故無法擴增和表達。選擇圖示Ti質(zhì)粒構建基因表達載體,應選擇限制酶(填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”),不選其他限制酶的理由是

。

(3)為篩選勝利導入抗凍基因的番茄細胞,在培育基中添加。將篩選后獲得的番茄細胞經(jīng)過程形成愈傷組織后,經(jīng)器官發(fā)生途徑或途徑發(fā)育形成植株,再在條件下篩選出具有抗凍性狀的番茄植株。

(4)探討人員欲比較不同轉(zhuǎn)基因番茄中抗凍蛋白的合成量,制備相應的單克隆抗體,利用圖2所示原理進行檢測。①檢測前,先將抗凍蛋白的單克隆抗體固定在支持物上,然后向該檢測體系中加入確定量的番茄植株中提取的蛋白質(zhì)(待測抗原)和等量酶標記抗凍蛋白(酶標記抗原),目的是讓待測抗原、酶標記抗原與抗體結合。

②保溫一段時間后洗滌,再向檢測體系中加入確定量的白色底物,若檢測體系藍色越,則說明番茄提取物中抗凍蛋白的含量越高。

③本檢測方法中的單克隆抗體可經(jīng)雜交瘤細胞體外培育或注射到小鼠腹腔克隆化培育后,分別從、中提取。

3.(2024浙江名校新高考探討聯(lián)盟第三次聯(lián)考)白細胞介素-6(IL-6)在醫(yī)學中被廣泛應用,科研人員進行了利用大腸桿菌作為生物反應器生產(chǎn)重組人源白細胞介素-6(rhIL-6)的相關試驗探討?；卮鹣铝袉栴}。(1)若利用化學方法合成rhIL-6基因,通常需先依據(jù)IL-6的設計出rhIL-6的基因序列,在設計時,還要盡可能依據(jù)細胞偏好的密碼子。在利用PCR擴增rhIL-6基因時,為提高引物與模板結合的效率,設計引物需避開2個引物或1個引物不同區(qū)段的堿基序列。在構建重組質(zhì)粒時,要選擇在宿主菌中水平高的質(zhì)粒作為載體。

(2)將大腸桿菌用處理后,加入重組質(zhì)粒,懸浮培育一段時間后,并獲得沉淀,經(jīng)稀釋后再用法接種到含有氨芐青霉素的平板上進行篩選,長出的菌落再利用核酸分子雜交進行鑒定。

(3)將陽性細菌進行克隆化培育,利用凝膠電泳分別并檢測rhIL-6蛋白。完善下列試驗思路:①將SDS制成電泳所需的凝膠,凝膠的孔隙可起到分子篩的作用,理論上SDS制備的凝膠孔徑應比瓊脂糖凝膠孔徑。

②將凝膠塊放入電泳槽中,加入緩沖液,緩沖液(填“須要”或“不須要”)沉沒凝膠塊。

③將蛋白質(zhì)樣品加入加樣孔中,進行電泳。④用緩沖液將電泳后的凝膠塊中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到特別的膜上,再利用具有熒光或放射性的作為探針進行檢測。

(4)SDS可使蛋白質(zhì)空間結構變更,所以電泳時蛋白質(zhì)在凝膠中移動的快慢主要由和電場大小確定。若上述試驗結果出現(xiàn)“微笑”或“皺眉”等條帶不整齊現(xiàn)象(如下圖1、2),其可能的緣由包括下列哪幾項?。(A.凝膠冷卻不勻整B.凝膠底部混有氣泡C.靠近隔片的凝膠聚合不完全D.樣品溶解不佳)

(5)將篩選出的大腸桿菌進行發(fā)酵試驗,發(fā)酵過程中須要限制發(fā)酵液的、滲透壓、pH、養(yǎng)分物質(zhì)和代謝廢物濃度等條件,由于發(fā)酵過程中pH會發(fā)生變更,所以在定時補充養(yǎng)分物質(zhì)時還需補充。

4.(2024浙江金華模擬)P24是HIV病毒顆粒的主要結構蛋白(大小約為26KD),是P24基因的表達產(chǎn)物。P24單克隆抗體在HIV感染的診斷、治療等方面有重要意義,P24單克隆抗體的制備主要包括三個階段:利用基因工程生產(chǎn)P24蛋白;利用細胞融合技術生產(chǎn)單克隆抗體;單克隆抗體活性的鑒定。請回答下列問題。(1)提取HIV的總RNA,經(jīng)過程獲得總cDNA。通過PCR技術可在總cDNA中專一性的擴增出P24基因的cDNA,緣由是

。

(2)在構建重組質(zhì)粒時,需對質(zhì)粒和P24基因的cDNA用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切,雙酶切的優(yōu)點是。探討發(fā)覺,P24基因的cDNA缺乏這兩種限制酶的識別序列。為此,在設計PCR引物時,須要。

(3)將重組質(zhì)粒(含卡那霉素抗性基因)導入宿主菌體細胞后,進行的部分操作及結果如下圖所示。圖中①②兩處的接種方法(填“相同”或“不同”),在固體平板培育基上能生長的菌落不愿定能合成P24,其緣由是。蛋白凝膠分析結果圖中,1為蛋白Marker,2為不含物質(zhì)A的菌液,3為含物質(zhì)A的菌液,試驗結果說明P24較高的是(填“2”或“3”),據(jù)此推想物質(zhì)A的作用是。

(4)用P24蛋白對小鼠以靜脈注射的方式進行加強免疫3次,其目的是。取免疫后小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞,用促融,并經(jīng)HAT培育基篩選獲得雜交瘤細胞。進一步篩選時,需先對含雜交瘤細胞的培育液進行稀釋,然后用抗原-抗體雜交技術進行檢測,篩選出具有特性的細胞。再將所得細胞進行克隆培育,進而獲得P24單克隆抗體?？寺∨嘤年P鍵是。

答案：1.答案(1)mRNA引物Ⅱ和引物Ⅲ5'KpnⅠ和XhoⅠ(2)①RNA聚合酶D②載體濃度、目的基因濃度、載體和目的基因的比例(3)①Ca2+轉(zhuǎn)化②白色③一般大腸桿菌(確定濃度的重金屬)鎘(4)菌體過濾、沉淀、離心、靜置解析(1)mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄可獲得cDNA。引物能使DNA聚合酶從引物的3'端起先連接脫氧核苷酸,故應選擇引物的方向是從5'端→3'端延長,即引物Ⅱ和引物Ⅲ。限制酶序列應添加在基因的外側(cè),不影響基因的序列,故添加在5'端。因為B鏈為模板鏈,轉(zhuǎn)錄的方向是沿著模板鏈的3'端→5'端,應將MT基因的左端與啟動子一側(cè)連接,又因為目的基因中含有PstⅠ的識別序列,故添加的限制酶序列分別是XhoⅠ和KpnⅠ。(2)①啟動子是一段有特別序列結構的DNA片段,位于基因的上游,緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點,它是RNA聚合酶識別和結合的部位,有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,最終表達出人類須要的蛋白質(zhì)。乳酸菌和大腸桿菌都是原核生物,啟動子可以用于構建原核生物的表達載體;噬菌體是寄生于細菌中的病毒,可在特定細菌內(nèi)繁殖,啟動子可用于構建原核生物表達載體;棗樹MT基因啟動子只能在特定棗樹細胞中發(fā)揮作用,不適合用于構建原核生物表達載體,故選D。②DNA連接反應是酶促反應,影響因素除了pH與溫度、反應時間、DNA連接酶的種類及濃度外,還有載體濃度、目的基因濃度、載體和目的基因的比例等。(3)①用Ca2+處理大腸桿菌,使其處于易于吸取外源DNA的狀態(tài);將基因表達載體導入受體細胞以完成轉(zhuǎn)化試驗。②在含有X-gal和氨芐青霉素的培育基上,導入空白質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的大腸桿菌都可以形成菌落,但導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌LacZ基因被破壞,不能催化無色物質(zhì)X-gal產(chǎn)生藍色物質(zhì),菌落為白色,故應挑取白色單菌落進行培育。③MT工程菌的特點是對重金屬鎘(Cd)具有吸附實力和耐受實力,欲進一步對MT工程菌進行鑒定,可將挑取出的MT工程菌與一般大腸桿菌分別接種到含有重金屬鎘的LB液體培育基中,置于恒溫培育箱中培育,相宜時間后檢測菌種數(shù)量。(4)細菌計數(shù)板可對菌體干脆計數(shù)。若要獲得發(fā)酵產(chǎn)品,可接受過濾、沉淀、離心、靜置等方法。2.答案(1)不能因為堿基對的替換,突變前后基因長度相同,無法通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分(2)復制起點啟動子和終止子Ⅲ限制酶Ⅰ會破壞四環(huán)素抗性基因,影響后續(xù)含目的基因的受體細胞的篩選,限制酶Ⅱ會破壞Vir區(qū)基因,影響目的基因的轉(zhuǎn)移(3)四環(huán)素脫分化體細胞胚胎發(fā)生低溫/寒冷(4)①競爭性②淺③細胞培育液小鼠腹水解析(1)因為堿基對的替換,突變前后基因長度相同,無法通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分。(2)探討人員提取了抗凍蛋白,依據(jù)氨基酸序列分析了mRNA的堿基序列,推想出目的基因的堿基序列,合成抗凍基因,通過這種方法得到的目的基因因不含復制起點、啟動子和終止子,故無法擴增和表達。構建重組DNA分子時,限制酶Ⅰ會破壞四環(huán)素抗性基因影響后續(xù)的篩選,限制酶Ⅱ會破壞Vir區(qū)基因影響目的基因的轉(zhuǎn)移,因此構建重組DNA分子時,選擇的限制酶最好是限制酶Ⅲ。(3)在培育基中添加四環(huán)素,可以篩選勝利導入抗凍基因的番茄細胞。由分化細胞形成愈傷組織的過程叫脫分化;愈傷組織發(fā)育成植株的兩個途徑為器官發(fā)生途徑和體細胞胚胎發(fā)生途徑;要篩選具有抗凍性狀的番茄,應在低溫(或寒冷)的條件下進行。(4)依據(jù)圖示反應原理,待測抗原中的目標抗原和酶標記抗原競爭結合抗體,標記抗原的酶可催化白色底物變?yōu)樗{色產(chǎn)物,所以假如待測抗原中目標抗原越多,則酶標記抗原和抗體結合得越少,催化生成的藍色產(chǎn)物就越少,檢測體系藍色就越淺。本檢測方法中的單克隆抗體可經(jīng)雜交瘤細胞體外培育或注射到小鼠腹腔克隆化培育后,分別從細胞培育液、小鼠腹水中提取。3.答案(1)氨基酸序列大腸桿菌互補表達(2)Ca2+離心稀釋涂布平板(3)①?、陧氁芸箁hIL-6抗體(4)分子大小(或分子量)ABC(5)溫度(氧氣濃度)堿性物質(zhì)解析(1)假如基因比較小,核苷酸序列已知,可以通過DNA合成儀用化學方法干脆人工合成,先依據(jù)IL-6的氨基酸序列設計出rhIL-6的基因序列。該探討利用大腸桿菌作為生物反應器,因此在設計時,要盡可能依據(jù)大腸桿菌細胞偏好的密碼子。利用PCR擴增rhIL-6基因時,為提高引物與模板結合的效率,設計引物需避開2個引物或1個引物不同區(qū)段的堿基序列互補。在構建重組質(zhì)粒時,要選擇在宿主菌中基因表達水平高的質(zhì)粒作為載體。(2)用Ca2+處理大腸桿菌可以使細胞處于一種能吸取四周環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),加入重組質(zhì)粒與大腸桿菌混合,在確定的溫度下促進大腸桿菌吸取DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過程。大腸桿菌會沉淀在底部,因此可離心后獲得沉淀,經(jīng)稀釋后再用稀釋涂布平板法接種到含有氨芐青霉素的平板上進行篩選,長出的菌落再利用核酸分子雜交進行鑒定。(3)將SDS制成電泳的凝膠,凝膠孔隙可起到分子篩的作用,因此制備的凝膠孔徑應比瓊脂糖凝膠孔徑小。將凝膠塊放入電泳槽中,加入緩沖液,緩沖液須要沉沒凝膠塊。對于rhIL-6蛋白,可用抗原-抗體雜交技術進行檢測,即利用具有熒光或放射性的抗rhIL-6抗體作為探針進行檢測。(4)SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性,所以電泳時蛋白質(zhì)在凝膠中移動的快慢主要由蛋白質(zhì)分子大小和電場大小確定。電泳條帶不整齊可能是由于凝膠冷卻不勻整、凝膠底部混有氣泡、靠近隔片的凝膠聚合不完全等緣由,故選A、B、C。(5)大腸桿菌發(fā)酵過程中須要限制發(fā)酵液的溫度、氧氣濃度、滲透壓、pH、養(yǎng)分物質(zhì)和代謝廢物濃度等條件。發(fā)酵過程中大腸桿菌會生成CO2,CO2溶于水可使pH下降,所以為維持pH的相對穩(wěn)定,在定時補充養(yǎng)分物質(zhì)時還需補充堿性物質(zhì)。4.答案(1)逆轉(zhuǎn)錄引物是依據(jù)P24基因?qū)腸DNA的一段已知序列設計合成的(含有/加入了能與之特異性結合的引物)(2)防止質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化及質(zhì)粒和目的基因的反向連接在引物中加入限制酶BamHⅠ和XhoⅠ的識別序列(3)不同重組質(zhì)粒表達了卡那霉素抗性基因,但不愿定表達了P24基因(合理即可)3物質(zhì)A能誘導P24基因的表達(合理即可)(4)促使小鼠產(chǎn)生更多的(能分泌抗P2