激光掃描共聚焦熒光顯微鏡的成像原理和基本結(jié)構(gòu) 顯微鏡操作規(guī)程

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（激光掃描共聚焦熒光顯微鏡）是一種利用計(jì)算機(jī)、激光和圖像處理技術(shù)獲得生物樣品三維數(shù)據(jù)、先進(jìn)的分子細(xì)胞生物學(xué)的分析儀器。緊要用于察看活細(xì)胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學(xué)變化，定量分析，以及實(shí)時(shí)定量測定等。

成像原理

接受點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個(gè)針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100—200nm；相對于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)通過一系列的透鏡，終可同時(shí)聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會(huì)聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，終在屏幕上聚合成清楚的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。

每一幅焦平面圖像實(shí)際上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面，這個(gè)光學(xué)橫切面總是有確定厚度的，又稱為光學(xué)薄片。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)宏大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng)，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深貌似為零，沿Z軸方向的掃描可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，形成待察看樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把X—Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計(jì)算機(jī)軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦于同一點(diǎn)，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進(jìn)入檢測針孔。

激光共聚焦的工作原理簡單表達(dá)就是它接受激光為光源，在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上，附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計(jì)算機(jī)掌控來進(jìn)行數(shù)字化圖像采集和處理的系統(tǒng)。

基本結(jié)構(gòu)

（激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)）緊要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數(shù)字信號(hào)處理器、計(jì)算機(jī)以及圖像輸出設(shè)備等。

（1）掃描模塊

掃描模塊緊要由針孔光欄（掌控光學(xué)切片的厚度）、分光鏡（按波長更改光線傳播方向）、發(fā)射熒光分色器（選擇確定波長范圍的光進(jìn)行檢測）、檢測器（光電倍增管）構(gòu)成。熒光樣品中的混合熒光進(jìn)入掃描器，經(jīng)過檢測針孔光欄、分光鏡和分色器選擇后，被分成各單色熒光，分別在不同的熒光通道進(jìn)行檢測并形成相應(yīng)的共焦圖象，同時(shí)在計(jì)算機(jī)屏幕上可以顯示幾個(gè)并列的單色熒光圖象及其合成圖象。

（2）熒光顯微鏡系統(tǒng)

顯微鏡是LSCM的緊要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。顯微鏡光路以無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)可便利地在其中插入光學(xué)選件而不影響成像質(zhì)量和測量精度。物鏡應(yīng)選取大數(shù)值孔徑平場復(fù)消色差物鏡，有利于熒光的采集和成像的清楚。物鏡組的轉(zhuǎn)換，濾色片組的選取，載物臺(tái)的移動(dòng)調(diào)整，焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計(jì)算機(jī)自動(dòng)掌控。

激光掃描共聚焦顯微鏡所用的熒光顯微鏡大體與常規(guī)熒光顯微鏡相同，但又有其特點(diǎn)：需與掃描器連接，使激光能進(jìn)入顯微鏡物鏡照射樣品，并使樣品發(fā)射的熒光到達(dá)檢測器；需有光路轉(zhuǎn)換裝置，即汞燈與激光轉(zhuǎn)換，同時(shí)汞燈光線強(qiáng)度可調(diào)。

（3）常用激光器

激光掃描共聚焦顯微鏡使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)，常用的激光器包括以下三種類型：

半導(dǎo)體激光器：405nm（近紫外譜線）

氬離子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm（藍(lán)綠光）

氦氖激光器：543nm（綠光—氦氖綠激光器）633nm（紅光氦氖紅激光器）

UV激光器（紫外激光器）：351nm、364nm（紫外光）

（4）輔佑襄助設(shè)備

風(fēng)冷、水冷冷卻系統(tǒng)及穩(wěn)壓電源。

激光掃描共聚焦顯微鏡的基本工作原理是首先由激光器發(fā)射的確定波長的激發(fā)光，光線經(jīng)放大后通過掃描器內(nèi)的照明針孔光欄形成點(diǎn)光源，由物鏡聚焦于樣品的焦平面上，樣品上相應(yīng)的被照射點(diǎn)受激發(fā)而發(fā)射出的熒光，通過檢測孔光欄后，到達(dá)檢測器，并成像于計(jì)算機(jī)監(jiān)視屏上。這樣由焦平面上樣品的的每一點(diǎn)的熒光圖像構(gòu)成了一幅完整的共焦圖像，稱為光切片。

倒置熒光顯微鏡的適用倒置熒光顯微鏡是指與一般顯微鏡相比，其物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來，由熒光附件與顯微鏡有機(jī)結(jié)合構(gòu)成的顯微鏡。

激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，被反射到物鏡中并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，經(jīng)雙色束分別器使激發(fā)光和熒光分開而成像。

物鏡和聚光鏡的工作距離很長，能直接對培育皿中的被檢物體進(jìn)行顯微察看和討論。

適用于土壤微生物培育試驗(yàn)，具有在培育瓶或培育皿內(nèi)進(jìn)行顯微察看的特點(diǎn)，可以察看不經(jīng)染色的透亮活體。

特別適用于對活體細(xì)胞和細(xì)胞離體培育等顯微察看。

高信噪比（S/N），能夠捕獲極弱熒光

光學(xué)品質(zhì)——對現(xiàn)代生命科學(xué)討論至關(guān)緊要

熒光察看的理想情況是接受最低量的激發(fā)光照射捕獲高對比度的圖像，由此將細(xì)胞受損及熒光衰減的機(jī)會(huì)降至最小。

對UIS2系統(tǒng)的物鏡進(jìn)行精密的設(shè)計(jì)，使用微弱的激發(fā)光即可捕獲光亮的熒光圖像。光透過率進(jìn)步的同時(shí)也提高了UIS2光學(xué)系統(tǒng)的信噪比。

干涉鍍膜熒光激發(fā)塊的性能改進(jìn)熒光激發(fā)塊的干涉膜接受了新型鍍膜技術(shù)，激發(fā)帶寬（BP）以及熒光帶寬（BA）比傳統(tǒng)譜線縮短了6nm，使信噪比更進(jìn)一步得到提高。

熒光激發(fā)塊接受硬鍍膜技術(shù)，大大延長了激發(fā)塊的使用壽命，提高了在潮濕環(huán)境中的使用性能。

熒光蛋白專用高質(zhì)量熒光激發(fā)塊

BX2系列HQ型熒光激發(fā)塊較為適合的波長是ECFP/EFP/EYFP/DsRed。高銳化鍍膜以及高透過率（90%—95%）可有效地透過熒光蛋白所發(fā)射的熒光。

這樣，即使接受微弱的激發(fā)光仍可察看到光亮的圖像，同時(shí)，防止熒光衰減，并將細(xì)胞受損的可能減至最小。

削減雜散光的功能

當(dāng)在分光鏡對激發(fā)光進(jìn)行反射時(shí)，雜散光的微量透射就可造成噪聲上升。

熒光激發(fā)塊經(jīng)由其獨(dú)特的光吸取涂層可吸取99%以上的雜散光，削減信號(hào)干擾，獲得高質(zhì)量圖像。

熒光成像用高數(shù)值孔徑物鏡

BX2系列具有新研制的PLAPON60XO物鏡的特點(diǎn)，