(高清版)GBT 42076.1-2022 生物技術(shù) 細(xì)胞計(jì)數(shù) 第1部分：細(xì)胞計(jì)數(shù)方法通則

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)GB/T42076.1—2022/ISO20391-1 I Ⅱ 44.1概述 44.2總細(xì)胞計(jì)數(shù) 4 44.4直接細(xì)胞計(jì)數(shù) 4.5間接細(xì)胞計(jì)數(shù) 45細(xì)胞計(jì)數(shù)的注意事項(xiàng) 4 45.2選擇細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的注意事項(xiàng) 55.4細(xì)胞計(jì)數(shù)的樣本制備 5.4.1環(huán)境因素 6 65.4.3試劑和質(zhì)量穩(wěn)定性 65.5測(cè)量 7 76.2方法確認(rèn)和驗(yàn)證 76.3.1有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 6.3.2內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 86.3.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用 8 8 8 7.1.2圖像處理與分析 87.1.3圈門設(shè)定 87.1.4重合校正 8 8附錄A(資料性)常用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 附錄B(資料性)不同測(cè)量目的的常用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 IⅡGB/T42076.1—2022/ISO 1GB/T42076.1—2022/ISO20391-1:2018本文件定義了生物技術(shù)領(lǐng)域細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)術(shù)語(yǔ)，描述了懸液中的細(xì)胞計(jì)數(shù)附在基質(zhì)上的細(xì)胞計(jì)數(shù)(通常是細(xì)胞面積密度),提供了細(xì)胞計(jì)數(shù)方法(包括總數(shù)和分類計(jì)數(shù)，直本文件不適用于組織切片或生物材料基質(zhì)中[來源：ISO/IEC指南99:2007,2.132GB/T42076.1—2022/ISO20391-13[來源：ISO/IEC指南99:2007,2.15試劑reagent標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)referencemateri參考物質(zhì)測(cè)量系統(tǒng)按規(guī)定的測(cè)量程序使用并提供一個(gè)或多個(gè)被測(cè)量的測(cè)得值時(shí)，4GB/T42076.1—2022/ISO20391-1:20184.1概述直接細(xì)胞計(jì)數(shù)方法指通過采集來自每個(gè)細(xì)胞的單個(gè)或一組信號(hào)(見3.12)以是電信號(hào)(如阻抗)、光信號(hào)(如熒光或者色度)或者機(jī)械力信號(hào)。信號(hào)可以通過手動(dòng)記錄或者通過儀器自動(dòng)記錄。由于一般樣本中細(xì)胞數(shù)量巨大，因此直接細(xì)胞計(jì)數(shù)方法通常需要進(jìn)行樣本稀釋。然后根間接細(xì)胞計(jì)數(shù)方法通過采集樣本中所有細(xì)胞或某一亞群細(xì)胞的一個(gè)信號(hào)或一組信號(hào)，根據(jù)信號(hào)與細(xì)胞數(shù)量相關(guān)的特定的數(shù)學(xué)模型換算得到細(xì)胞數(shù)量(如校準(zhǔn)曲線)(見3.13)。5間接細(xì)胞計(jì)數(shù)(見圖1和附錄B)。根據(jù)測(cè)量物的預(yù)期用途，有些方法還可以用于多個(gè)類別的細(xì)胞計(jì)數(shù)。某些儀器和/或方法可以通過檢測(cè)不同的測(cè)量物既可以確定總細(xì)胞數(shù)量也可以同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分類每種方法都有其固有的噪聲和誤差，會(huì)影響準(zhǔn)確度和精確度。使用者應(yīng)根據(jù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)選擇適合于被測(cè)細(xì)胞類型、應(yīng)用和/或樣本制備步驟的一種或多種方法(預(yù)期目的)。直接細(xì)胞計(jì)數(shù)方法(包括總細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類計(jì)數(shù))要求細(xì)胞能夠很好地分散從而取得最佳的結(jié)果。細(xì)胞碎片、細(xì)胞聚集體或細(xì)胞團(tuán)的存在會(huì)導(dǎo)致直接細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)量偏高或偏低。只要有可能，宜建立一個(gè)制備程序保證樣本能充分分散，沒有細(xì)胞碎片、細(xì)胞聚集體和細(xì)胞團(tuán)。間接細(xì)胞計(jì)數(shù)方法使用替代性的測(cè)量來評(píng)估細(xì)胞數(shù)。這些方法取決于測(cè)量的準(zhǔn)確度以及校準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度。例如，當(dāng)使用總DNA量來估算細(xì)胞數(shù)時(shí)，準(zhǔn)確測(cè)量樣本中總DNA并在DNA和細(xì)胞數(shù)量之間建立準(zhǔn)確關(guān)系的能力很重要。如有必要，宜使用合適的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立校準(zhǔn)曲線。5.2選擇細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的注意事項(xiàng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的選擇取決于預(yù)期目的以及樣本和處理因素，包括：——細(xì)胞計(jì)數(shù)的預(yù)期目的；——用于評(píng)估指定被測(cè)量[包括定量限(LOQ)]的儀器的適用性；——樣品特征，包括細(xì)胞屬性和樣品異質(zhì)性的潛在影響；——由于存在細(xì)胞碎片、細(xì)胞聚集體和/或細(xì)胞團(tuán)，可能對(duì)測(cè)量產(chǎn)生潛在影響；——由于生物處理和預(yù)測(cè)量對(duì)測(cè)量產(chǎn)生的潛在影響：包括儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)移、冷凍保存(包括冷凍和解凍過程);——細(xì)胞樣本中的輔助材料和其他成分可能會(huì)對(duì)測(cè)量產(chǎn)生潛在影響(如培養(yǎng)基、微球)。細(xì)胞計(jì)數(shù)的樣本通常是通過從較大的整體中獲取的一個(gè)或多個(gè)樣本確定的。6GB/T42076.1—2022/ISO20391-1:2018宜使用適當(dāng)?shù)牟蓸映绦騺肀M可能減少與測(cè)量細(xì)胞樣品相關(guān)的取樣誤差，而不是測(cè)量整個(gè)批量或批較小抽樣比例可能會(huì)產(chǎn)生較大的取樣誤差。在某些情況下，應(yīng)取較大的抽細(xì)胞聚集體或細(xì)胞團(tuán)的存在會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果偏低。宜建立樣本制備宜將樣品環(huán)境因素的改變可能影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的方式降至最低。環(huán)境因素可以包括溫度、濕度、光宜考慮設(shè)備和耗材對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。宜選擇適當(dāng)?shù)娜萜骱娃D(zhuǎn)移設(shè)備，盡可能地減少與樣本轉(zhuǎn)移如有可能，宜確認(rèn)樣本制備中使用的試劑以確保質(zhì)量和一致性。試劑的質(zhì)量宜使用合適的方法或某些試劑(如熒光染料、緩沖液)可能會(huì)過期或在某些環(huán)境條件下不穩(wěn)定。批次之間或不同供應(yīng)商處的某些試劑(如抗體)可能不一致。用戶在使用這些75.5測(cè)量細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)使用經(jīng)過驗(yàn)證的程序進(jìn)行。宜為預(yù)期的細(xì)胞計(jì)數(shù)建立適當(dāng)?shù)膬x如已驗(yàn)證了細(xì)胞樣本的穩(wěn)定性，細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在規(guī)定的時(shí)限內(nèi)進(jìn)行。本的隨機(jī)選取可以減少操作人員偏倚和不精確性對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)不可使用儀器制造商規(guī)定的安裝確認(rèn)(IQ)和運(yùn)行確認(rèn)(OQ)。常規(guī)性能確認(rèn)(PQ)應(yīng)按預(yù)先規(guī)定的時(shí)間間隔按記錄的程序進(jìn)行。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證。應(yīng)提供方法性能參數(shù)，以證明該方法產(chǎn)生的理想情況下，通過評(píng)估分析結(jié)果的平均值與參考值之間的差異(通過認(rèn)準(zhǔn)確性。也可以使用具有統(tǒng)計(jì)分析的多組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)方法或其他已ISO20391-2提供了有關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析的其他信息。確認(rèn)計(jì)劃應(yīng)形成文件并加以維護(hù)，確認(rèn)計(jì)劃應(yīng)包括預(yù)期用途的方法性能參數(shù)，確認(rèn)結(jié)果應(yīng)形成為保證經(jīng)驗(yàn)證的方法在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)執(zhí)行可進(jìn)行方法確認(rèn)。為此可以確定一組簡(jiǎn)化的方法性能參6.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)8GB/T42076.1—2022/ISO20391-1:2018在計(jì)數(shù)過程中應(yīng)評(píng)估內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的用途。在可能的情況下，應(yīng)建立有相關(guān)不確定度的內(nèi)部標(biāo)對(duì)于所選的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，宜使用合理的數(shù)據(jù)處理和分析方法。數(shù)據(jù)處理注用于識(shí)別細(xì)胞對(duì)象并從分析中排除碎片。圖像分析還可以用于識(shí)別樣本中特處理可以包括圖像的亮度和對(duì)比度的校正以及照明不均勻性的校正。圖像分析用于得出細(xì)胞數(shù)。圖像直方圖的形式顯示。圈門可以通過辨別分析來定義，也可以簡(jiǎn)單地手動(dòng)圍繞細(xì)胞計(jì)數(shù)中的重合是指在基于流式的測(cè)量中，來自細(xì)胞信號(hào)的時(shí)間重疊或基于顯微鏡的圖像中的空間重疊，從而導(dǎo)致計(jì)數(shù)損失。宜使用適當(dāng)?shù)闹睾闲Ｕ椒▉肀苊饧?xì)胞計(jì)數(shù)不足?；诹魇綔y(cè)量的特7.2報(bào)告9GB/T42076.1—2022/ISOGB/T42076.1—2022/ISO20(資料性)A.1概述樣本的毛細(xì)管。在底部收集的細(xì)胞高度用于估計(jì)細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)。此方法更適用可以通過測(cè)量單位體積的干細(xì)胞或新鮮細(xì)胞的重量來估算細(xì)胞數(shù)量。從肉湯培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，A.4細(xì)胞計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)板(也稱為血細(xì)胞計(jì)數(shù)器)是一種顯微鏡載玻片，專門設(shè)計(jì)用于細(xì)胞懸浮液沉積在凹槽中，以使其以限定的體積填充在蓋玻片和載玻片柵格不能稀釋得太小而影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。常見的錯(cuò)誤來源包括填充量不一致細(xì)胞接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)直到形成克隆從而進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果細(xì)胞懸分布在平板上，通?？梢约俣總€(gè)細(xì)胞將產(chǎn)生單個(gè)克隆形在培養(yǎng)基上的細(xì)胞培養(yǎng)液體積，可計(jì)算細(xì)胞濃度。通常需要稀釋樣品以使細(xì)胞分驟可能會(huì)導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。此過程的準(zhǔn)確性和有效性將取決于目標(biāo)細(xì)胞類A.6分光光度法分光光度計(jì)測(cè)量透過樣本的光的強(qiáng)度。混濁的細(xì)胞懸浮液吸收或散射A.7阻抗法計(jì)數(shù)器中，懸浮在導(dǎo)電溶液中的細(xì)胞通過一個(gè)小孔被一個(gè)接一個(gè)地吸引。在孔的側(cè)面是兩個(gè)導(dǎo)電的電極流(和阻抗),該電流和阻抗與通過細(xì)胞的體積直接相關(guān)。通過指定目標(biāo)細(xì)胞群的大小范圍來控制細(xì)胞計(jì)數(shù)。常見的誤差來源包括巧合(偶爾有多個(gè)細(xì)胞同時(shí)通過孔徑)和圈門。適用用標(biāo)準(zhǔn)是ASTM2149-01(2007)。括試劑質(zhì)量和特異性，儀器設(shè)置(如圈門參數(shù))和數(shù)據(jù)分析方法?？梢允褂没诩?xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(如通過非選擇性的DNA熒光標(biāo)記的強(qiáng)度來確定總DNA量，該方法有時(shí)被用作確定總細(xì)胞數(shù)量的替代方法。DNA定量的準(zhǔn)確性會(huì)受到標(biāo)記物選擇性和標(biāo)記有效性以及制備過程中裂解物DNA提取效其他不太常用的細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫法(ELISA)和酶聯(lián)免疫印記(ELISpot)檢測(cè)。產(chǎn)生細(xì)胞因子或者表面具有特異性標(biāo)記的細(xì)胞可使用該類間接方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。(資料性)間接細(xì)胞計(jì)數(shù)方法總細(xì)胞計(jì)數(shù)——NIR(近紅外光譜)——克隆形成單位(CFU)——代謝活性檢測(cè)——NIR(近紅外光譜)表B.1提供的清單不是所有計(jì)數(shù)方法的詳盡清單。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，某些列出的方法可能會(huì)放在其他類別中。在某些情況下，只介[2]ISOGuide98-3,Uncertaintyofmeasurement,Guidetotheexpressiurement(GUM:1995).[3]ISO/IECGuide99:2007,Internationalvocandassociatedterms([4]ISO5725-1:1994,Accuracy(truenessandprecision)[5]ISO5725-2:1994,Accuracy(truenessandprecision)Part2:Basicmethodforthedeterminationofrepeatabilityandreproducibilityofastandardmeasure-[6]ISO5725-3:1994,Accuracy(truenessandprecision)Part3:Intermediatemeasuresoftheprecisionofastandardmeasurementmethod[7]ISO5725-6:1994,Accuracy(truenessandprecision)Part6:Useinpracticeofaccuracyvalues.[8]ISO8196-3:20091),Milk—Def[9]ISO10718:2002,Corkstoppers—Enumerationofcolony-formingunitsofparison[13]ISO17511:2003,Invitrodiagnosticmedicaldevic[15]ASTMF2149-01(Reapproved2007),StandardTestMethodforAutomatedAnalysesof[17]ASTMD4455-85(2014),StandardTe [19]H20-A2.ReferenceLeukocyte(WBC)DifferentialCount(GB/T42076.1—2022/ISO[20]DIN58932-1,Haematology—Determinationoftheconcentrationofblood—Part1:Bloodcollection,samplepreparation,biolo[21]DIN58932-2,Haematology—Determinationoftheconcentrationofblood—Part2:Characteristicquantitiesforerythrocytes(erythrocyteindices).[22]DIN58932-3,Haematology—Determinationoftheconcentrationofbloodcorpuscl