(高清版)GBT 16551-2020 豬瘟診斷技術(shù)

GB/T16551—2020代替GB/T16551—2008Diagnostictechniquesforclassicalswinefever2020-12-14發(fā)布2020-12-14實施國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I 1 1 1 24.1臨床癥狀 24.2病理變化 24.3結(jié)果判定 2 25.1器材 25.2試劑 25.3樣品采集 35.4保存與運輸 35.5樣本處理 36實驗室病原學(xué)診斷方法 36.1免疫熒光抗體試驗(FAT) 36.2免疫過氧化物酶試驗(IPT) 46.3豬瘟病毒分離與鑒定 56.4豬瘟病毒RT-nPCR檢測方法 66.5豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測方法 67實驗室抗體檢測方法 67.1豬瘟病毒中和試驗 67.2豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測方法 9 97.4豬瘟病毒化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法 9 附錄A(規(guī)范性附錄)試劑配制 附錄B(規(guī)范性附錄)豬瘟病毒TCIDso測定 附錄C(規(guī)范性附錄)校準(zhǔn)品的制備 ⅢGB/T16551—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T16551—2008《豬瘟診斷技術(shù)》。與GB16551—2008相比，主要技術(shù)變化如下：——修改了“范圍”(見第1章，2008年版的第1章); 第2章); 刪除了“兔體交互免疫試驗”部分(見2008年版的3.1):——修改了“免疫酶染色試驗”和“直接免疫熒光抗體試驗”部分，更名為“免疫熒光抗體試驗——刪除了“豬瘟病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)”(見2008年版的3.5);——修改了“血清學(xué)診斷”部分，并更名為“實驗室抗體檢測方法”(見第7章，2008年版的第4章);———修改了“熒光抗體病毒中和試驗”部分，并更名為“豬瘟病毒中和試驗”(見7.1,2008年版的4.1);本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：GB/T16551—2020豬瘟(Classicalswinefever,CSF)是由豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)感染豬引起的一種高度接觸性致死性傳染性疾病，可造成巨大的經(jīng)濟損失和社會影響。被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的疫病，我國規(guī)定CSF為一類動物疫病。易感，一年四季均可發(fā)生。感染豬在發(fā)病前能通過分泌物和排泄物排毒，并持續(xù)整個病程。與感染豬直鼠類和昆蟲、器具等均可成為重要傳播媒介。CSFV是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員之一，只有1個血清型，3個基因型，10個基因亞型，不同基因型間有很好的抗原交叉反應(yīng)。近年來，由于臨床上出現(xiàn)了CSFV持續(xù)性感染所致的無典型臨床癥狀和病理變化的慢性和隱性感染形式，以及多種疫病混合感染的現(xiàn)象，CSF的臨床診斷和病理學(xué)診斷只能作為初步診斷的依據(jù)，對CSF病原的實驗室檢測是確定病毒感染的主要方法，要求診斷技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)更加特異和敏感。由于診斷的需求和診斷技術(shù)的發(fā)展，GB/T16551—2008已經(jīng)不適應(yīng)要求。針對CSF感染普遍存在病毒載量低、病毒血癥時間短等特點，最適用于活體動物的檢腸系膜淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)等含毒量較高的臟器進行檢測。采用CSFV抗原免疫檢測法[免疫熒光抗體試驗(Fluorescentantibodytest,FAT)/免疫過氧化物酶試驗(Immunoperoxidasetest,IPT)]可檢測感染組織和細胞中的病毒抗原，用于確診；如果結(jié)果可疑或者樣本不足，可以通過核酸檢測技術(shù)確認(rèn)。如果樣本量大，可采用豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測方法進行初篩，陽性者采用豬瘟病毒RT-nPCR檢測方法和序列測定進行確診和基因分型；上述都不能確診的樣本，采用經(jīng)典的CSFV分離技術(shù)確診，分離的病毒可用于進一步研究。上述三類方法均為OIE推薦的方法。目前，實施CSF疫苗全面免疫是我國防控CSF的重要手段，CSFV抗體檢測主要用于CSF疫苗的免疫效果評價，而對于一些不實施免疫CSF疫苗的國家和地區(qū)來說，CSF抗體檢測可以作為未免疫豬瘟疫苗豬群感染CSF的診斷依據(jù)。而在我國，ELISA方法已成為監(jiān)測免疫后CSFV抗體保護水平、評價豬群免疫效果的最主要手段，根據(jù)檢測目的不同，可選擇不同的方法。對于我國CSF疫苗采取的全面免疫后而開展的大規(guī)模普查，間接ELISA抗體檢測方法能夠更加真實地反映中和抗體水平，為免疫程序制定和抗體水平監(jiān)測提供可靠的數(shù)據(jù)支持；阻斷ELISA抗體檢測方法因其特異性強，可用于引種的種豬檢測；化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法是近年來發(fā)展起來的一種新的酶聯(lián)免疫檢測方法，利用化學(xué)發(fā)光底物提高檢測的靈敏度，同時增加檢測的線性范圍。本標(biāo)準(zhǔn)中的CSFV化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法中采用了CSFV抗體的校準(zhǔn)品，并在檢測中繪制校準(zhǔn)曲線，可以使抗體檢測結(jié)果相對定量。另外，采用該方法進試驗(Virusneutralizationtest,VNT)。ELISA方法和VNT兩類方法均為OIE推薦的方法，也是國際貿(mào)易指定試驗。本標(biāo)準(zhǔn)中涉及了5種CSF病原和4種CSFV抗體的實驗室檢測方法，均可用于CSF病原和抗體的定性檢測。使用者可根據(jù)自身的實驗條件、能力水平以及待檢樣本的實際情況選擇合適的方法。本文件的發(fā)布機構(gòu)提請注意，聲明符合本文件時，可能涉及7.2和7.3與CSFVE2蛋白表達及純化相關(guān)的專利的使用。本文件的發(fā)布機構(gòu)對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機構(gòu)保證，他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，VGB/T16551—2020就專利授權(quán)許可進行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得：地址：北京中關(guān)村南大街8號。請注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。1GB/T16551—20201范圍以及實驗室抗體檢測方法等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬(家豬、野豬)的豬瘟診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27540豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測方法GB/T34729—2017豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測方法GB/T35906豬瘟抗體間接ELISA檢測方法GB/T36875豬瘟病毒RT-nPCR檢測方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范3縮略語下列縮略語適用于本文件。CSF:豬瘟(ClassicalswiCSFV:豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzymelinkedimmunosorbentassay)FAT:免疫熒光抗體試驗(Fluorescentantibodytest)HRP:辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase)IPT:免疫過氧化物酶試驗(Immunoperoxidasetest)MEM:基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基(Minimumeagle'smedium)NCU:國家臨床單位(Nationalclinicalunit)NIF:免疫熒光中和試驗(Neutralization-immunofluorescence)NPLA:過氧化物酶聯(lián)中和試驗(Neutralizationperoxidase-linkedantibody)PBS:磷酸鹽緩沖溶液(Phosphatebufferedsaline)PK-15:豬腎傳代細胞系(Pigkidney-15cellline)RT-nPCR:巢式PCR技術(shù)(Reversetranscriptionnestpolymerasechainreaction)RT-PCR:反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)TCID?o:組織半數(shù)感染劑量(50%tissuecultureinfectivedose)2GB/T16551—20204臨床癥狀與病理變化豬群中被檢豬出現(xiàn)下列臨床癥狀時，可作為綜合診斷定性的依據(jù)之一：b)體溫≥40.5℃或間歇性發(fā)熱；對臨床檢出的可疑患豬可進行病理學(xué)診斷，下述肉眼可見的病理變化可作為綜合診斷定性的依據(jù)之一：易感豬出現(xiàn)4.1或4.2的情況，可判定為疑似CSF。5.1.2無菌剪刀。5.1.3無菌鑷子。5.1.4無菌離心管。5.1.6醫(yī)用EDTA抗凝采血管。5.1.7一次性密封袋。5.1.9冷凍離心機。5.2.1MEM培養(yǎng)液。3GB/T16551—20205.2.2雙抗儲液，見A.1。5.2.375%酒精，見A.2。5.3樣品采集心管中并編號。5.3.2活體動物抗凝全血的采集采用75%酒精對待采血動物頸部前腔靜脈表面皮膚進行擦拭消毒。用無菌注射器于前腔靜脈采血，立即注入醫(yī)用EDTA抗凝采血管，充分混勻后編號備用。臟器出現(xiàn)了典型的病理變化，宜采集病健交界處的組織，不宜采集病變嚴(yán)重且出現(xiàn)繼發(fā)感染(如細菌污染)的組織。采樣時用無菌的剪刀和鑷子剪切至少1g,裝入一次性自封袋或離心管，編號。5.4保存與運輸采集的樣本應(yīng)放入主容器密封后，采用保溫容器加冰袋或干冰密封，應(yīng)在8h之內(nèi)運送到實驗室。樣本相關(guān)生物安全標(biāo)識和運送流程應(yīng)按照NY/T541的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。樣本到達實驗室后，在2℃~8℃條件下保存應(yīng)≤24h。若需長期保存，應(yīng)放置于超低溫冰箱(≤-70℃),避免反復(fù)凍融。5.5樣本處理樣本處理的生物安全措施按GB19489規(guī)定的相關(guān)操作進行。將病料用無菌眼科剪和眼科鑷進行修剪(病灶與健康組織的交界處),處理不同組織病料應(yīng)更換手套并消毒操作器械。取1g大小的病料組織，置于無菌離心管中，再向其中加入無菌MEM培養(yǎng)液(含2%雙抗)1mL。在2℃~8℃溫度下置于勻漿機中勻漿，將勻漿液于4℃溫度下8000r/min離心將抗凝全血樣本直接分裝于無菌離心管中，在4℃下8000r/min離心5min,取上清，置于另一個6實驗室病原學(xué)診斷方法6.1免疫熒光抗體試驗(FAT)4GB/T16551—2020或觸片以及細胞培養(yǎng)物中的病毒抗原。樣本需在無防腐劑的冷藏條件下運送，但樣本不能凍結(jié)。根據(jù)FITC標(biāo)記的抗體不同，可分為直接法和間接法。6.1.2.1倒置熒光顯微鏡。6.1.2.2恒溫培養(yǎng)箱。6.1.2.3濕盒(帶蓋子的長方形容器，底部鋪一層濕紗布)。6.1.2.4蓋玻片。6.1.2.5微量移液器(200μL、1000μL)。6.1.3試劑6.1.3.1PBS緩沖液，見A.3。6.1.3.2丙酮，—20℃預(yù)冷。6.1.3.5抗體：直接法采用FITC標(biāo)記的抗CSFV的單克隆或多克隆抗體；間接法采用抗CSFV的單克隆或多克隆抗體及相應(yīng)的FITC標(biāo)記二抗。6.1.4操作步驟6.1.4.1將待檢的組織樣本制成冰凍切片或觸片，將液體吸干后用預(yù)冷的丙酮固定5min～10min,自然干燥；細胞培養(yǎng)物棄去孔中液體，用PBS緩沖液漂洗3次后，自然干燥，每孔加入適量固定液固定30min。每個樣本應(yīng)做3個重復(fù)切片或觸片。固定后用PBS緩沖液漂洗3次，自然干燥。同時采用陽性組織和陰性組織進行相同處理，分別作為陽性對照和陰性對照。6.1.4.2染色方法，以下兩種可任選其一：a)直接法：滴加工作濃度的FITC標(biāo)記的抗CSFV的單克隆或多克隆抗體，覆蓋于樣本表面，置37℃濕盒避光作用30min～40min,用PBS緩沖液洗滌3次。b)間接法：滴加工作濃度的抗CSFV的單克隆或多克隆抗體，覆蓋于樣本表面，置37℃濕盒作用1h后，用PBS緩沖液洗滌3次，再加入工作濃度的FITC標(biāo)記二抗，置37℃濕盒避光作用30min～40min,用PBS緩沖液洗滌3次。6.1.4.3將組織切片放置室溫干燥5min,于組織樣本表面滴加適量緩沖甘油，用蓋玻片覆蓋樣本；細胞培養(yǎng)物表面滴加適量PBS緩沖液。將樣本直接置于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。6.1.4.4實驗成立條件和結(jié)果判定：當(dāng)細胞胞漿中出現(xiàn)亮綠色熒光著染時，判為染色陽性；細胞胞漿無著染，判為染色陰性。當(dāng)陽性對照為染色陽性，陰性對照為染色陰性時，實驗結(jié)果成立。待檢樣本的3個重復(fù)切片或觸片中至少一個出現(xiàn)染色陽性時，即判該樣本為CSFV陽性；否則，判為陰性。6.2免疫過氧化物酶試驗(IPT)6.2.1概述本方法原理與FAT相似，但抗體標(biāo)記物為HRP,根據(jù)標(biāo)記的抗體不同，可分為直接法和間接法。在普通光學(xué)顯微鏡下可觀察結(jié)果，且細胞板或組織切片能長期保存、反復(fù)觀察。器材包括倒置光學(xué)顯微鏡和其他器材(按6.1.2.2～6.1.2.5執(zhí)行)。5GB/T16551—2020抗體：直接法采用HRP標(biāo)記的抗CSFV的單克隆或多克隆抗體，間接法采用抗CSFV的單克隆或多克隆抗體及相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗。底物顯色液見A.5。a)直接法：滴加工作濃度的HRP標(biāo)記的抗CSFV的單克隆或多克隆抗體，覆蓋于樣本表面，置37℃濕盒避光作用30min～40min,用PBS緩沖液洗滌3次。1h后，用PBS緩沖液洗滌3次，再加入工作濃度的HRP標(biāo)記二抗，置37℃濕盒避光作用30min～40min,用PBS緩沖液洗滌3次。6.2.4.4將組織切片放置室溫干燥5min,于組織樣本表面滴加適量緩沖甘油，用蓋玻片覆蓋樣本；細胞培養(yǎng)物表面滴加適量PBS緩沖液。樣本直接置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。為染色陰性。當(dāng)陽性對照為染色陽性，陰性對照為染色陰性時，實驗結(jié)果成立。待檢樣本的3個重復(fù)中6.3豬瘟病毒分離與鑒定6.3.1.125cm2細胞培養(yǎng)瓶。6.3.1.224孔細胞培養(yǎng)板。6.3.1.4微量移液器(200μL,1000pL)。6.3.1.6二氧化碳溫箱。6.3.1.7倒置熒光顯微鏡(FAT染色)或普通光學(xué)顯微鏡(IPT染色)。6.3.2.3MEM培養(yǎng)液。6.3.2.4雙抗儲液(100倍),見A.1。6GB/T16551—20206.3.2.11PK-15細胞，或?qū)Σ《久舾行圆坏陀赑K-15細胞的豬腎和豬睪丸傳代細胞系。6.3.3.1細胞的制備：分離病毒前24h～36h制備細胞。用胰酶消化處于對數(shù)生長期的PK-15細胞單層，將所得細胞懸液以1500r/min離心5min,并用細胞生長液將細胞重懸，細胞計數(shù)器計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至2×10?個/mL,備用；也可取適量細胞懸液加入細胞培養(yǎng)瓶或24孔細胞培養(yǎng)板制備細胞單層，待細胞長至60%～70%鋪滿孔底時備用。6.3.3.2待檢樣本的準(zhǔn)備：取5.5.2和5.5.3中制備的組織懸液或全血，用0.45pm一次性針式濾器過6.3.3.3病毒接種和培養(yǎng)。以下2種接種方式可選其一：a)同步接種：取9份細胞懸液(見6.3.3.1)和1份待檢樣本(見6.3.3.2)進行混合，取5mL混合液加入細胞培養(yǎng)瓶中，同時接種24孔細胞培養(yǎng)板2孔，每孔0.5mL;24孔細胞培養(yǎng)板上同時接種豬瘟兔化弱毒疫苗C株細胞毒作為陽性對照(9份細胞懸液和1份細胞毒)2孔和陰性對照(9份細胞懸液和1份PK-15細胞培養(yǎng)上清)2孔，每孔0.5mL。操作時一定要避免交叉污染。當(dāng)接種完待檢樣本后，做好標(biāo)記，置于37℃含5%二氧化碳溫箱中培養(yǎng)72h。b)單層細胞接種：待6.3.3.1中的細胞長至60%～70%細胞單層后，棄去細胞培養(yǎng)上清，按細胞培養(yǎng)液1/10體積加入處理后的待檢樣本(見6.3.3.2)于細胞培養(yǎng)瓶和24孔細胞培養(yǎng)板中，24孔細胞培養(yǎng)板中同時接種0.2mL陽性對照和陰性對照各2孔。置于37℃含5%二氧化碳燥死亡。吸出孔中液體，棄于2%NaOH溶液中進行滅活，用無血清MEM培養(yǎng)液漂洗瓶/板中細胞3次。加入適量細胞維持液于細胞培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板中(例如：25cm2細胞培養(yǎng)瓶加入5mL維持液，24孔細胞培養(yǎng)板加入維持液0.5mL～1mL);37℃含5%二氧化碳溫箱中放置72h。6.3.3.4檢測和結(jié)果判定。病毒接種后72h,取出細胞培養(yǎng)板，吸出孔中液體于2%NaOH溶液中滅活。用PBS漂洗3次，置通風(fēng)櫥下干燥5min,用-20℃預(yù)冷的固定液固定30min以上。棄去孔中固定液，PBS緩沖液漂洗3次?？刹捎?.1或6.2的方法進行檢驗和結(jié)果判定。6.3.3.5病毒傳代及擴大培養(yǎng)。如需對病毒陽性樣本進行擴大培養(yǎng)，取出接種樣本的細胞瓶反復(fù)凍融共2次，進行擴大培養(yǎng)，獲得第3代陽性培養(yǎng)物，凍存?zhèn)溆?。根?jù)需要對獲得的陽性培養(yǎng)物進行病毒滴度測定(見附錄B)或基因分型等研究。如對檢測結(jié)果有疑問可按上述方法盲傳2代并進行檢測。6.4豬瘟病毒RT-nPCR檢測方法豬瘟病毒RT-nPCR檢測方法按照GB/T36875執(zhí)行。豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測方法按照GB/T27540執(zhí)行。77.1.1.1.2多道移液器(200μL)。7.1.1.2.1MEM培養(yǎng)液。7.1.1.2.3CSFV抗體陽性血清。7.1.1.2.5PK-15細胞。7.1.1.2.6豬瘟兔化弱毒疫苗C株細胞毒。7.1.1.3.1細胞的準(zhǔn)備：用96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)PK-15細胞，待細胞鋪滿孔底60%～70%時，備用。離心管中，一份血清換一個移液器吸頭。將分裝后的待檢血清和對照血清置于56℃水浴鍋中滅活7.1.1.3.3病毒的稀釋：在血清滅活期間，取適量已知毒價的豬瘟兔化弱毒疫苗細胞毒(豬瘟病毒TCID?o測定見附錄B),用含1%雙抗的無血清MEM培養(yǎng)液將病毒稀釋至200TCID??/0.1mL。7.1.1.3.4血清與病毒的中和：取1塊96孔細胞培養(yǎng)板(記為板I),每孔加入含1%雙抗的無血清MEM培養(yǎng)液80μL。將7.1.1.3.2滅活后的待檢血清和對照血清按順序加入上述培養(yǎng)液中，每孔20μL,每份血清做2個重復(fù)。此時，待檢/對照血清均被稀釋5倍。血清稀釋后，向板I中每孔加入100μL7.1.1.3.3中的病毒液，此時血清的最終稀釋倍數(shù)為10倍。將板I置于37℃含5%二氧化碳溫箱中孵育1h。7.1.1.3.5孵育結(jié)束后，將7.1.1.3.1中制備的PK-15從板I中吸取1列、2列孔中液體加入板Ⅱ的對應(yīng)孔中。7.1.1.3.6將板Ⅱ置于37℃含5%二氧化碳溫箱中孵育1h。7.1.1.3.7取出板Ⅱ,每孔加入維持液100μL,37℃含5%二氧化碳溫箱中孵育72h。85min。每孔加入—20℃預(yù)冷的固定液100μL,—20℃放置37.1.1.3.9細胞染色。棄去孔中固定液，PBS緩沖液漂洗3次?？刹捎弥苯臃ɑ蜷g接法進行細胞染色：a)直接法：用抗體稀釋液將FITC標(biāo)記的CSFV單克隆/多克隆抗體稀釋至工作濃度，每孔加入b)間接法：將CSFV多克隆/單克隆抗體用稀釋液稀釋至工作濃度。向板Ⅱ中加入稀釋后的抗體，每孔加入50μL,37℃反應(yīng)1h。取出板Ⅱ,棄去孔中液體。用PBS緩沖液漂洗3次。將反應(yīng)30min～45min。7.1.1.3.10取出板Ⅱ,棄去孔中液體。用PBS緩沖液漂洗3次。血清的2個重復(fù)孔中，2孔均為染色陽性，則該血清判為CSFV抗體陰性；若2孔均為染色陰性，則該血清判為CSFV抗體陽性；若2孔中1孔為染色陽性、1孔為染色陰性，則該血清判為可疑，應(yīng)重復(fù)檢7.1.2過氧化物酶聯(lián)中和試驗(NPLA)抗體按6.2.3執(zhí)行。7.1.2.3.2細胞染色。可采用直接法或間接法進行細胞染色：a)直接法：用抗體稀釋液將HRP標(biāo)記的CSFV單克隆/多克隆抗體稀釋至工作濃度，每孔加入50μL,37℃避光反應(yīng)1h。b)間接法：將CSFV多克隆/單克隆抗體用稀釋液稀釋至工作濃度。向板Ⅱ中加入稀釋后的抗體，每孔加入50μL,37℃反應(yīng)1h。取出板Ⅱ,棄去孔中液體。用PBS緩沖液漂洗3次。將應(yīng)30min～45min。7.1.2.3.3取出板Ⅱ,棄去孔中液體。用PBS緩沖液漂洗3次。7.1.2.3.4向各孔中滴加底物顯色液50μL,待陰性血清對照孔細胞出現(xiàn)紅褐色顯色時，棄去孔中液體，7.1.2.3.5將板Ⅱ置于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察。9豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測方法按照GB/T34729—2017執(zhí)行。豬瘟抗體間接ELISA檢測方法按照GB/T35906執(zhí)行。7.4.2.1CSFVE2蛋白：見GB/7.4.2.7發(fā)光底物A:見A.15。7.4.2.8發(fā)光底物B:見A.16。7.4.3.1包被：將CSFVE2蛋白用包被液稀釋至0.1pg/mL,按100μL每濕度≤40%環(huán)境下干燥3h。放入干燥劑，密封包裝，置2℃~8℃保存。GB/T16551—2020物，震蕩混勻；每孔吸取100pL轉(zhuǎn)移至包被E2蛋白的化學(xué)發(fā)光板對應(yīng)孔內(nèi)。37℃溫箱中反應(yīng)30min。7.4.3.4洗滌：棄去孔中液體，每孔加入300μL洗滌液，室溫放置3自動洗板機洗板5次。7.4.3.5加底物和顯色：每孔加入50μL化學(xué)發(fā)光底物A和50μL的化學(xué)發(fā)光底物B,振蕩混勻。也可加入到各孔。在18℃~26℃條件下避光靜置5min。7.4.3.6化學(xué)發(fā)光儀讀取發(fā)光值。7.4.3.7繪制校準(zhǔn)曲線：以校準(zhǔn)品發(fā)光值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的NCU為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)品的四參數(shù)擬合7.4.3.8結(jié)果判定：如果樣本中抗體含量<20NCU/mL,樣本應(yīng)判定為陰性；如果樣本中抗體含量≥20NCU/mL,則判定為陽性。8綜合判定8.1臨床癥狀與病理變化判定為典型的疑似豬病料，按6.1或6.2檢測為CSFV抗原陽性，或按6.3分離出CSFV,或按6.4和6.5檢測出CSFV核酸，同時與流行病學(xué)史相符合，均可判定為CSF陽性。8.2臨床癥狀與病理變化無明顯特征的疑似豬的病料，按6.1或6.2檢測為CSFV抗原陽性，或按6.3分離出CSFV(一般需盲傳培養(yǎng)),或按6.4和6.5檢測出CSFV核酸，同時與流行病學(xué)史相符合，均可判定為CSF陽性。8.3若臨床癥狀與病理變化的診斷結(jié)果與6.1或6.2,或與6.4和6.5不符合，按6.3分離出CSFV,可判定為CSF陽性。8.5若待檢病料按第6章檢測為CSFV抗原陽性，需判斷是否為CSFV野毒感染或疫苗免疫所致。如6.4方法對陽性病料進行核酸擴增，并對目的片段進行測序，與豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株進行序列比檢測出CSF抗體的，可判定該動物曾經(jīng)或正在感(規(guī)范性附錄)A.1雙抗儲液(100倍)青霉素10?IU鏈霉素1g無菌蒸餾水100mL無菌定量分裝，于—20℃保存。無水乙醇(分析純)75mL無菌蒸餾水25mL室溫保存。A.3PBS緩沖液氯化鈉8g氯化鉀0.2g磷酸氫二鈉1.42g磷酸二氫鉀0.27g加去離子水800mL,充分溶解后，用濃鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至7.4,去離子水定容至1000mL。高壓滅菌15min(121℃±2℃),室溫保存。A.4緩沖甘油無水碳酸鈉0.6g碳酸氫鈉3.7g加100mL蒸餾水或去離子水，充分溶解，調(diào)節(jié)pH值至9.0～9.3,與等量甘油(分析純)充分混合即可。A.5底物顯色液3,3-二氨基苯聯(lián)胺50mgTris-HCl緩沖液(0.01mol/L,pH值7.6)100mL充分