應(yīng)用指南 - 小規(guī)模純化AAV-MAX系統(tǒng)生產(chǎn)的AAV

介紹Gibco?AAV-MAXHelper-Free無(wú)輔助病毒AAV生產(chǎn)系統(tǒng)是一生產(chǎn)。AAV-MAX系統(tǒng)包括一個(gè)克隆性HEK293F來(lái)源的懸浮細(xì)（booster）、轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑（enhancer）和裂解緩沖液。策略1是一項(xiàng)較基礎(chǔ)的工藝，不必使用昂貴的設(shè)備和過(guò)濾器，而是通過(guò)離心法直接澄清，并通過(guò)切向流過(guò)濾法（TFF）進(jìn)行濃縮，這對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室小規(guī)模的考察研究來(lái)說(shuō)是POROS?AAVX親和樹(shù)脂分別實(shí)現(xiàn)了AAV血清型6（rAAV6）載體70%和49%的重組AAV總工藝回收率，證明了在典型的材料和方法根據(jù)AAV-MAX用戶指南（出版號(hào)：MAN0019619），針對(duì)策略1和策略2分別在兩個(gè)2.8L搖瓶和四個(gè)2.8L搖瓶中使用完整的AAV-MAX系統(tǒng)試劑盒（表1）生產(chǎn)rAAV裂解和核酸酶處理在收獲時(shí)（轉(zhuǎn)染后3天），將10倍Gibco?AAV-MAX裂解緩程中，加入最終濃度為2mM的MgCl2和最終濃的ThermoScientific?Pierce?通用核酸酶，以消化rAAV顆粒中未被衣殼化的DNA。將培養(yǎng)物放在37℃的培養(yǎng)箱中，在轉(zhuǎn)速125rpm的搖床平臺(tái)上培養(yǎng)2小時(shí)。策略1細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解用AAV-MAX裂解緩沖液裂解2L細(xì)胞培養(yǎng)物澄清以6,000xg的速度離心30分鐘；NalgeneRapid-Flow過(guò)濾裝置（0.2μm）親和性POROSGoPureAAVX預(yù)裝柱，1mLMiniKros柱（10倍濃縮系數(shù)）策略2澄清澄清深層過(guò)濾器組：Millistak+C0SP過(guò)濾器，Millistak+F0HC過(guò)濾器，和Sartopore2XLG過(guò)濾器MiniKros柱（20倍濃縮系數(shù)）；6倍滲濾體積滲濾細(xì)胞裂解用AAV-MAX裂解緩沖液裂解4L細(xì)胞培養(yǎng)物親和性POROSGoPureAAVX預(yù)裝柱，1mL2表1.用于AAV生產(chǎn)和純化的材料。工藝步驟工藝步驟材料描述貨號(hào)AAV-MAXHelper-Free無(wú)輔助病毒AAV生產(chǎn)系統(tǒng)試劑盒A51217CN（含國(guó)產(chǎn)化細(xì)胞）AAV-MAX裂解緩沖液（10倍）A505201MMgCl2J61014.AK88702Pierce通用核酸酶88702ThomsonOptimumGrowth2.8L燒瓶（）50-112-006NalgeneRapid-Flow帶PES膜的無(wú)菌一次性過(guò)濾裝置（0.2μm）567-0020真空泵（Welch）I31-0176SorvallLYNX6000超速離心機(jī)75006590NalgenePPCO離心瓶3120-1000MasterflexL/S泵（）07522-20Masterflex鉑金固化硅膠管，25號(hào)（）96440-2516100118Millistak+HCPro深層過(guò)濾器，C0SP（MilliporeSigma）MC0SP027H1Millistak+Pod深層過(guò)濾器，F(xiàn)0HC（MilliporeSigma）MF0HC027H1Sartopore2XLG過(guò)濾器（Sartorius）5441307G4-SS-BMasterflexL/S泵（）07522-20Masterflex鉑金固化硅膠管，25號(hào)（）。96440-25PL1905847Q試劑瓶（Corning）431432MiniKros中空纖維TFF組件（Repligen）S02-E100-05-NSciLog壓力傳感器（Parker）080-699PSX-3P-5SciLog壓力監(jiān)測(cè)儀（Parker）SP0820J-1329POROSGoPureAAVX預(yù)裝柱A36652策略1：離心澄清和TFF將用核酸酶處理過(guò)的細(xì)胞裂解液在20℃下以6,000xg的速度離心30分鐘。將上清液倒入ThermoScientific?Nalgene?Rapid-Flow?無(wú)菌一次性過(guò)濾裝置（0.2μm），并使用真空裝置開(kāi)始進(jìn)行過(guò)濾。在2-8℃下儲(chǔ)存一心澄清和過(guò)濾方案重新澄清已經(jīng)過(guò)澄清的裂解液，然后裝入以沖掉過(guò)濾器中的儲(chǔ)存甘油，然后用過(guò)濾面積為1mL/cm2的以2,000s-1（368mL/min）的剪切率在HFTFF中再循環(huán)已經(jīng)過(guò)澄清的裂解液。使用軟管旋塞向再循環(huán)管路施加背壓并進(jìn)行倍后，將其收集起來(lái)。用1.4倍滯留體積的親和平衡緩沖液來(lái)淋洗HFTFF，并將其與HFTFF產(chǎn)物混合。按照上使用NalgeneRapid-Flow一次性無(wú)菌過(guò)濾器裝置（0.2μm）對(duì)混合的淋洗和HFTFF產(chǎn)物進(jìn)行離心和過(guò)濾。3策略2：深層過(guò)濾澄清和TFF2/hrmL/min）的流速?zèng)_洗Millistak+?C0SP和F0HC深層過(guò)濾器，或者直至從過(guò)濾器中排出所有空氣。將Millistak+C0SP過(guò)濾器的出口與F0HC過(guò)濾器的入口相連接；將F0HC過(guò)濾器的出口與Sartopore?2XLG過(guò)濾器的入口相連接。用1.5倍深層過(guò)濾器滯留體積（975mL）的澄清緩沖液以150L/m2/hr（67.5mL/min）的流速平衡整個(gè)過(guò)濾器組。以150L/m2/hr（67.5過(guò)濾器重新澄清已經(jīng)過(guò)澄清的裂解液，然后將其加載到MiniKrosHFTFF柱上（表2）。用過(guò)濾面積為2mL/cm2的DI水新的中空纖維過(guò)濾器，以沖掉過(guò)濾器中的儲(chǔ)存甘油，然后用過(guò)濾面積為1mL/cm2的親和平衡緩沖液進(jìn)行平衡。以2,000s-1（368mL/min）的剪切率在HFTFF中再循環(huán)已經(jīng)過(guò)澄清的裂解液。使用軟管旋塞向再循環(huán)管路施加背壓并進(jìn)行調(diào)整，使整液交換。緩沖液交換通過(guò)在保持20倍濃縮體積的情況下向樣本槽中緩慢加入6個(gè)滲濾體積的親和力平衡緩沖液2來(lái)進(jìn)緩沖液交換完成后，收集材料。用1.4倍滯留體積的親和平衡緩沖液來(lái)淋洗HFTFF，并將其與HFTFF產(chǎn)物混合。使用Sartopore2XLG過(guò)濾器過(guò)濾混合的淋洗和HFTFF產(chǎn)品。參數(shù)設(shè)置2,000s-1<5psi10倍或20倍6個(gè)滲濾體積25親和純化純化前，用0.5NNaOH對(duì)?KTA?FPLC系統(tǒng)進(jìn)行滅菌處理，CV的0.2M磷酸（接觸時(shí)間為15分鐘）、5個(gè)CV的6M鹽酸胍、5個(gè)CV的2MHCL、5個(gè)CV的洗滌1緩沖液、10個(gè)CV的略2）以300cm/hr的流速對(duì)ThermoScientific?POROS?接下來(lái)，以300cm/hr的流速將過(guò)濾后的HFTFF產(chǎn)物加載到色譜柱上（相應(yīng)的停留時(shí)間為1分鐘）。待過(guò)濾后的HFTFF產(chǎn)物加載完成后，先后用10個(gè)CV的平衡緩沖液、三個(gè)不同的中間沖洗液（每種均為5個(gè)CV）、10個(gè)CV的平衡緩沖液洗滌色譜柱。用pH值為2.5的甘氨酸緩沖液洗脫rAAV6。先后用7個(gè)CV的0.2M磷酸（接觸時(shí)間為15分鐘）、5個(gè)CV的6M鹽酸胍、5個(gè)CV的親和平衡緩沖液、5個(gè)CV的2MHCL、10個(gè)CV的DI水對(duì)POROSGoPureAAVX柱進(jìn)行剝離和滅菌處理，然后將其保存在5個(gè)CV的20%乙醇中。通過(guò)ddPCR對(duì)病毒基因組進(jìn)行定量使用靶向GFP基因的引物和探針通過(guò)微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）測(cè)定每毫升病毒基因組的AAV滴度（vg/mL）。在進(jìn)行ddPCR然后，在QX200?微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)（Bio-Rad）上運(yùn)行每測(cè)定完整衣殼的百分比根據(jù)制造商的說(shuō)明使用AAV6ELISA試劑盒（Progen）殼滴度。用基因組滴度除以衣殼滴度，以測(cè)定洗脫組分中完整通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位進(jìn)行定量然后用連續(xù)稀釋的rAAV6-GFP過(guò)程樣本和5型腺病毒輔助病毒共同感染細(xì)胞。根據(jù)用流式細(xì)胞儀測(cè)定的每個(gè)孔的GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量來(lái)計(jì)算每個(gè)樣本的轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（TU/mL）。濁度測(cè)量濁度測(cè)量全部在ThermoScientific?Orion?AQUAfastAQ30104表3.親和純化方法。緩沖液或溶液緩沖液或溶液0.980.980.2M磷酸50mMTris，1.5MNaCl，0.01%Pluronic?F-68表面活性劑，pH7.2PluronicF-68表面活性劑，pH7.2PluronicF-68表面活性劑，pH7.2B6B3B2B1A230030030030055555-0.98150.980.98150.98-0.98-0.98300-0.98-0.98300-0.98A13005-0.98A13005-0.98沖洗液30.98沖洗液3輸出3輸出53005A1-3005A10.98300.141分鐘的停S1PluronicF-68表面活性劑，pH0.98300.141分鐘的停S10.98PluronicF-68表面活性劑，pH7.20.9810300A1-10300A10.98PluronicF-68表面活性劑，pH7.20.98A23005-50mMTris，1.5MNaCl，0.01%PluronicF-68表面活性劑，pH7.2A23005-3000.983000.98A35-50mMTris，1.5M尿素，0.01%Pluronic3000.983000.98A35-A45-50mMTris，1%Tween?20表面活性劑，0.01%PluronicF-68表面活性劑，pH9.0A45-3000.98PluronicF-683000.9810A1-10A1PluronicF-68表面活性劑，pH7.21分鐘的停0.98300.14A5B3B3B255250.98300300300-75mM甘氨酸，50mMNaCl，500mM精氨酸，0.01%PluronicF1分鐘的停0.98300.14A5B3B3B255250.98300300300-0.98150.2M磷酸0.98150.98-0.98-0.98PluronicF-68表面活性劑，pH7.20.983005A1-3005A1PluronicF-68表面活性劑，pH7.20.980.98B1B6A6A73003000.980.98B1B6A6A73003003003005555-0.98-0.98--20%乙醇0.98-0.98--5結(jié)果就親和層析前AAV6培養(yǎng)物的處理對(duì)兩種不同策略進(jìn)行了測(cè)試。策略1使用離心和過(guò)濾來(lái)產(chǎn)生澄清的裂解液，然后在生澄清的裂解液，然后在HFTFF上進(jìn)行20倍濃縮和濾體積的緩沖液交換。每項(xiàng)策略的測(cè)試結(jié)果策略1：離心澄清經(jīng)過(guò)裂解和核酸酶處理的AAV6培養(yǎng)物的濁度為302個(gè)散射濁度單位（NTU細(xì)胞培養(yǎng)物的滴度為7.85x1013vg/L（圖2和3）。在0.2μmNalgeneRapid-Flow過(guò)濾裝置上經(jīng)過(guò)離心和過(guò)濾后，濁度降至16.49NTU，該過(guò)程的每步產(chǎn)率為94%，細(xì)胞培養(yǎng)的滴度為7.36x1013vg/L（圖2和3）。在HFTFF上進(jìn)行了53分鐘的10倍濃縮，平均滲透通量為28L/m2/h在該步驟中未觀察到滴度損失。將HFTFF產(chǎn)物在0NalgeneRapid-Flow過(guò)濾裝置上進(jìn)行離心和過(guò)濾后，濁度降載過(guò)程中，最大柱前壓和△柱壓均保持在0.0和純化產(chǎn)物產(chǎn)生了5.49x1013vg/L的細(xì)胞培養(yǎng)物，每步產(chǎn)率為74%，整體過(guò)程產(chǎn)率為70%（圖3）。Millistak+F0HC過(guò)濾器上的最大壓力達(dá)到1.34psi。Sartopore2XLG過(guò)濾器上的最大壓力達(dá)到0.8psi（圖9）。澄清步驟將濁度降至1.03NTU，每步的產(chǎn)率為70%，細(xì)胞培養(yǎng)物的滴度為8.29x1013vg/L（圖2和3）。在HFTFF上進(jìn)行了52.6HFTFF上進(jìn)行了總共22.9分鐘的6個(gè)滲濾體積的緩沖液交換，平均滲透通量為21.4LMH。失降至最低，每步的產(chǎn)率為76%（圖2和3）。HFTFF產(chǎn)物在Sartopore2XLG過(guò)濾器上進(jìn)行過(guò)濾后，濁度降至7.47NTU。TFF產(chǎn)物策略2過(guò)濾后的TFF產(chǎn)物策略2過(guò)濾后的TFF產(chǎn)物感染性在整個(gè)純化過(guò)程中保持不變；提取的細(xì)胞培養(yǎng)物和親和產(chǎn)物的感染性值均為3.32x103vg/TU（圖6）。該純化不包括富集完整衣殼，所以完整衣殼的百分比在純化過(guò)程的各個(gè)步驟中保持相對(duì)穩(wěn)定，其范圍約為20-30%（圖7）。使用SDS，顯示親和產(chǎn)物的大小策略2：深層過(guò)濾器澄清經(jīng)過(guò)裂解和核酸酶處理的AAV6培養(yǎng)物的濁度為442NTU，細(xì)胞培養(yǎng)物的滴度為1.18x1014vg/L（圖2和3）。通過(guò)Millistak+C0SP、Millistak+F0HC和Sartopore2XLG過(guò)濾器組進(jìn)行了74分澄清產(chǎn)物TFF產(chǎn)物過(guò)濾后的策略1的滴度策略2的滴度策略1的滴度策略2的滴度--策略2的每步產(chǎn)率圖3.每個(gè)工藝步驟中細(xì)胞培養(yǎng)物的滴度和每步產(chǎn)率。通過(guò)ddPCR測(cè)定滴度（vg/mL然后用vg/mL以測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的滴度（vg/L）。通過(guò)該值，可以比較每個(gè)工藝步驟中兩種純化策略的滴度需考慮每步所處理材料的體積。滴度變化可用于確定每個(gè)工6策略1通量（LMH）策略1策略1通量（LMH）策略1TMP（psi）策略2初始滲濾策略2TMP（psi）器連接至過(guò)濾器的入口、截留物和透過(guò)物上。取入口和截留物壓力的平均值，然后減去透過(guò)物壓力，以計(jì)算出跨膜壓（T塞來(lái)調(diào)整截留物的背壓，使TMP達(dá)到目標(biāo)值5psi。在TFF期間，每隔2-5分鐘收集一次透過(guò)物并進(jìn)行稱重。用以kg為單位（與升相關(guān)）的透過(guò)物除以處理時(shí)間，以確定透過(guò)物的流速（升/時(shí)）。然后用透過(guò)這兩種策略的滲透通量都是隨著濃度系數(shù)的增加而衰減。在緩沖液交換期間，由于濃度在這一步保持不變，通量比較穩(wěn)定。在整策略1UV吸光度280nm策略1UV吸光度260nm策略2UV吸光度280nm策略2UV吸光度260nm提取的細(xì)胞培養(yǎng)物親和產(chǎn)物澄清產(chǎn)物TFF提取的細(xì)胞培養(yǎng)物親和產(chǎn)物TFF產(chǎn)物策略2策略策略2圖6.每個(gè)工藝步驟的感染性。感染性滴度（TU/mL）和vg/mL分別通過(guò)流式細(xì)胞儀和ddPCR測(cè)定。vg/TU的值通過(guò)vg/mL滴度除以感染性滴度計(jì)算親和產(chǎn)物提取的細(xì)胞培養(yǎng)物澄清產(chǎn)物過(guò)濾后的TFF親和產(chǎn)物產(chǎn)物策略1策略1圖7.每個(gè)工藝步驟中完整衣殼的百分比。別通過(guò)ddPCR和ELISA測(cè)capsids/mL計(jì)算出完整衣殼的百分比。層析過(guò)程中，使用?KTAFPLC系統(tǒng)nm。初始寬峰（A）與流經(jīng)親和柱但未7無(wú)產(chǎn)物損失。在親和加載過(guò)程中，UVA280信號(hào)僅達(dá)到215mAU，這表明一保持在0.07MPa以下。親和純化產(chǎn)物產(chǎn)生了5.78x1013vg/L的細(xì)胞培養(yǎng)物，提供了49%的總工藝取的細(xì)胞培養(yǎng)物（3.68x103vg/TU）和親和產(chǎn)物（2.79x103vg/TU）保持富集完整衣殼，所以完整衣殼的百分比在純化過(guò)程的各個(gè)步驟中保持相對(duì)用SDS，顯示親和產(chǎn)物的大小結(jié)論本文介紹了兩種使用AAV-MAX系統(tǒng)兩種策略都能獲得高質(zhì)量和高產(chǎn)量的為70%和49%。在策略2中觀察到的策略1泳道描述1請(qǐng)參見(jiàn)BluePlus2標(biāo)準(zhǔn)品2親和加載3親和流穿液4親和沖洗液15親和沖洗液26親和沖洗液37親和產(chǎn)物8親和剝離液9請(qǐng)參見(jiàn)BluePlus2標(biāo)準(zhǔn)策略2泳道描述1請(qǐng)參見(jiàn)BluePlus2標(biāo)準(zhǔn)2請(qǐng)參見(jiàn)BluePlus2標(biāo)準(zhǔn)3親和加載4親和流穿液5親和沖洗液16親和沖洗液27親和沖洗液38親和產(chǎn)物9親和剝離液10請(qǐng)參見(jiàn)BluePlus2標(biāo)準(zhǔn)圖8.親和工藝步驟的樣本SDS-PAPlus2預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品加載到Invitrogen?NuPAGE?4-12%Bis-Tris凝膠上，然后在200V下運(yùn)行35分鐘。接著使用Invitrogen?SimplyBlue?SafeStain對(duì)凝膠進(jìn)行染色。處理時(shí)間（分鐘）C0SP過(guò)濾器F0HC過(guò)濾器開(kāi)始淋洗SartoporeC0SP過(guò)濾器F0HC過(guò)濾器開(kāi)始淋洗Millistak+C0SP過(guò)濾器前面添加壓力傳感器1。在Millistak+C0SP和Millistak+F0HC過(guò)濾器之間添加壓力傳感器2。在Millistak+F0HC過(guò)濾器和Sartopore2XLG過(guò)濾器之間添加壓力傳感器3。在處理過(guò)程中，每隔5分鐘記錄一次壓力讀數(shù)。使用傳感器1和傳感器2之間的Δ壓力測(cè)定Millistak+C0SP過(guò)濾器的壓力。使用傳感器2和傳感器3之間的Δ壓力測(cè)定Millistak+F0HC的壓力。使用傳感器3的壓力讀數(shù)測(cè)定Sartopore2XLG過(guò)濾器的壓力。壓力超過(guò)濾器堵塞。在運(yùn)行期間，過(guò)濾器的壓力均未超過(guò)2.5psi。8兩種策略之間的顯著區(qū)別是，策略2產(chǎn)生的中間產(chǎn)物濁度的A280值更低。策略2的澄清產(chǎn)物和TFF產(chǎn)物的分別低94%和90%。策略2在濃高33%，在親和流穿液中的A280值比策略1低89此類差異，但兩種策略的最終親和產(chǎn)物在感染性、完整衣殼的百分比和產(chǎn)量方面是相當(dāng)?shù)?。我們建議用策略1進(jìn)行初始發(fā)現(xiàn)或小規(guī)模的考察研究。策略2適用于工藝開(kāi)發(fā)工作，因?yàn)樯顚舆^(guò)濾步驟可以利用任何堆疊式或互鎖過(guò)濾系統(tǒng)和過(guò)濾器支架進(jìn)Holmes、KennethThompson和JonathanZmuda，Thermo附錄：2L下游方案裂解1.收獲時(shí)，在培養(yǎng)物中加入10倍裂解緩沖液，直至最終濃3.在培養(yǎng)物中加入核酸酶，直至最終濃度為90U/mL（Benzonase?核酸酶或Pierce通用核酸酶0.8mLPierce通用核酸酶）。4.攪拌裂解液，以確保各種成分充分混合。5.將裂解液倒入兩個(gè)2.8L燒瓶中。6.在37℃下將裂解液以125rpm的速度振蕩2小時(shí)。離心澄清1.將裂解液以6,000xg的轉(zhuǎn)速離心30分鐘。2.將含有AAV的上清液倒入0.2μm的Nalgene用深層過(guò)濾器進(jìn)行澄清組裝和平衡過(guò)濾系統(tǒng)：1.將管路連接到Millistak+C0SP過(guò)濾器的入口、通風(fēng)口和出2.沖洗Millistak+C0SP過(guò)濾器。A.夾住出口管并打開(kāi)排氣管，開(kāi)始用去離子（以600L/m2/hr（270mL/min）的流速?zèng)_洗C0SP過(guò)為確保將所有空氣從過(guò)濾器中排出，夾住出口管和排氣管，讓過(guò)濾器的壓力上升到<10psi，然后再打開(kāi)排氣管。繼續(xù)執(zhí)行該步驟，直至過(guò)濾器排氣管沒(méi)有氣泡排出。用手或橡膠錘輕輕敲擊過(guò)濾器也可以B.用DI水以600L/m2/hr（270mL/min）的流速?zèng)_洗C0SP過(guò)濾器，同時(shí)夾住排氣管并打開(kāi)保將所有空氣從過(guò)濾器中排出，夾住出口管和排氣管，讓過(guò)濾器的壓力上升到<10psi，然后再打開(kāi)出口管。繼續(xù)執(zhí)行該步驟，直至過(guò)濾面積為100L/m23.沖洗Millistak+F0HC過(guò)濾器。A.將C0SP過(guò)濾器的出口管連接至F0HC過(guò)濾器的入口處，并在入口前安置一個(gè)壓力傳感器。將管路連接至F0HC過(guò)濾器的排氣口和出口。B.夾住出口管并打開(kāi)排氣管，開(kāi)始用DI水以600L/m2/hr（270mL/min）的流速?zèng)_洗C0SP和F0HC夾住F0HC出口管和排氣管，讓過(guò)濾器的壓力上升到<10psi，然后再打開(kāi)F0HC排氣管。繼續(xù)執(zhí)行該步驟，直至F0HC排氣管沒(méi)有氣泡排出。用手或橡膠錘輕輕敲擊過(guò)濾器也可以幫助清除過(guò)濾器中的氣9C.繼續(xù)用DI水以600L/m2/hr（270mL/min）的流速?zèng)_洗C0SP和F0HC過(guò)濾器，同時(shí)夾住排氣管并打開(kāi)F0HC出口管。為確保將所有空氣從F0HC過(guò)濾器中排出，夾住F0HC出口管和排氣管，讓過(guò)濾器的壓力上升到<10psi，然后再打開(kāi)F0HC出口管。A.將F0HC過(guò)濾器的出口管連接至Sartopore2XLG過(guò)濾器的入口，并在入口前安置一個(gè)壓力傳感器。將管路連接至Sartopore2XLG過(guò)濾器的出口。以150L/m2/hr（67.5mL/min）的流速流經(jīng)所有三滯留體積（975mL）流經(jīng)過(guò)濾器。澄清處理：1.以150L/m2/hr（67.5mL/min）的流速將所有用核酸酶處理過(guò)的細(xì)胞裂解液泵入過(guò)濾器組。壓力不應(yīng)超過(guò)102.用1.5倍過(guò)濾器組滯留體積（1,008mL）淋洗產(chǎn)物。如果澄清的裂解液之前已置于2-8℃的能會(huì)出現(xiàn)渾濁，需要使用離心方案或Sartopore2XLG過(guò)濾器A.夾住Pp管路，用至少0.25mL/cm2的DI水沖洗中注意：不要讓色譜柱超過(guò)其能承受的最大壓力，并3.測(cè)試中空纖維過(guò)濾器的完整性。A.倒出中空纖維中的所有DI水（注意此時(shí)的滯留體入空氣，直至TMP達(dá)到5-7psi左右。C.注意TMP在1分鐘內(nèi)的下降量。下降值為2psi/minA.將Ps管路和Pr管路放入所需的平衡緩沖液中。C.