apoB多態(tài)性檢測(cè)的方法(包括VNTR,Eco和MSP酶切多態(tài)性)

apoB基因多態(tài)性分析

apoB基因獨(dú)立位于2號(hào)染色體短臂末端（2p23），單拷貝?；蛉L(zhǎng)43kb，含28個(gè)內(nèi)含子和29個(gè)外顯子。功能：載脂蛋白B（apoB）是VLDL、IDL和LDL的主要結(jié)構(gòu)蛋白,其主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性膽固醇,維持體內(nèi)血膽固醇平衡。apoB基因在所有載脂蛋白基因中具有最明顯的多態(tài)性，其核苷酸變異有75處，其中導(dǎo)致氨基酸變異的有54處。一、apoB-VNTR3’VNTR位于該基因3’端下游第2個(gè)PolyA信號(hào)以下位置的一個(gè)可變數(shù)目串連重復(fù)序列，也稱(chēng)小衛(wèi)星區(qū)（minisatellite）。根據(jù)重復(fù)序列長(zhǎng)度的不同，可分為不同的等位基因型，自從1989年首先發(fā)現(xiàn)14種ApoB基因3’VNTR等位基因以來(lái)，國(guó)內(nèi)外至今已發(fā)現(xiàn)22種等位基因，長(zhǎng)度在400～1200bp之間，根據(jù)重復(fù)序列的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以把這些重復(fù)序列分為兩類(lèi)：一類(lèi)是ATAATTAAATATTTT，稱(chēng)為X型；另一類(lèi)是ATAATTAAAATATTT，稱(chēng)為Y型。其序列中發(fā)生單核苷酸取代（即G或C取代T），又可產(chǎn)生X或Y的變異體Xi、Yi、Xii和Yii等。VNTR重復(fù)序列數(shù)目的不同，以及每一重復(fù)序列內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化決定了VNTR的高度多態(tài)性。有關(guān)3’VNTR多態(tài)性PCR-VNTR(VariablenumbleoftandemlyrepeatedshortDNAsequence)多態(tài)性檢測(cè)PCR；電泳檢測(cè)有關(guān)PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系PCR過(guò)程PCR的基本原理標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200μmol/L引物各10～100pmolTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L模板DNA0.1～2μgapoB-VNTRPCR反應(yīng)引物1μlDNA模板1.5μlMix15μlddH2O12.5

μl總體積：30μl（1）PCR反應(yīng)體系（2）PCR程序

94℃5min（預(yù)變性）

94℃60’’（變性）

60℃4min

（復(fù)性+延伸）

60℃5min（續(xù)延伸）4℃保存30cycle二、酶切位點(diǎn)多態(tài)性1.EcoRI酶切位點(diǎn)

apoB基因的EcoRI酶切位點(diǎn)多態(tài)性是由于4154位密碼子突變，使原有的EcoRI酶切位點(diǎn)消失，產(chǎn)生E-等位基因，并使所編碼的谷氨酸被賴氨酸取代。有研究認(rèn)為具有突變的E-等位基因與血漿高膽固醇（TC）及高低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平有關(guān)，與血漿甘油三酯(TG)、LDL-C水平升高相關(guān)。GAATTCCTTAAGEcoRI酶切位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)

PCR反應(yīng)引物1μlDNA模板1.5μlMix15μlddH2O12.5

μl總體積：30μl（1）PCR反應(yīng)體系（2）PCR程序

94℃5min（預(yù)變性）94℃1min（變性）

58℃3min

（復(fù)性+延伸）

72℃5min（續(xù)延伸）4℃保存30cycle酶切反應(yīng)及電泳檢測(cè)(1)酶切反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)產(chǎn)物10ul10XbufferEcoRI2ul雙蒸水18ulEcoRI1ul(2)酶切反應(yīng)時(shí)間：37℃12小時(shí)，最后65℃20min終止反應(yīng)。

(3)電泳檢測(cè)

2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果：EcoRI酶切位點(diǎn)出現(xiàn)E+E+(含253bp、227bp2條帶)、E+E-(含480bp、253bp、227bp3條帶)和E-E-(含480bp1條帶)3種基因型。E-E-E-E+E+E+

2.MspI酶切位點(diǎn)多態(tài)性

對(duì)個(gè)體血脂影響不大，但由于它在CHD人群中出現(xiàn)頻率較高，推測(cè)它與脂質(zhì)代謝、CHD發(fā)病之間存在某種聯(lián)系CCGGGGCCMspII酶切位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)

PCR反應(yīng)引物1μlDNA模板1.5μlMix15μlddH2O12.5

μl總體積：30μl（1）PCR反應(yīng)體系（2）PCR程序

94℃5min（預(yù)變性）94℃1min（變性）

60℃1min

（復(fù)性）72℃1min（延伸）

72℃5min（續(xù)延伸）4℃保存30cycle酶切反應(yīng)及電泳檢測(cè)(1)酶切反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)產(chǎn)物10ul10XbufferEcoRI2ul雙蒸水18ulEcoRI1ul(2)酶切反應(yīng)時(shí)間：37℃12小時(shí)，最后65℃20min終止反應(yīng)。

(3)電泳檢測(cè)

2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果：MspI酶切位點(diǎn)出現(xiàn)M+M+(含395bp、85bp2條帶)、M+M-(含480bp、395bp、85bp3條帶)和M-M-(含480bp1條帶)3種基因型。M-M-M-M+M+M+

基因組DNA的瓊脂糖電泳檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)原理（1）瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，沸水中溶解（84-96度），36-42℃開(kāi)始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度（分離0.2-50kb）；DNA分子在堿性緩沖液（pH8.0）中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)；DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小、構(gòu)象及電荷數(shù)不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶；DNA顯色劑多用EB（致癌作用），它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在波長(zhǎng)為254nm~365nm的紫外光（防止損傷）照射下呈橘紅色（530nm）的熒光；一、實(shí)驗(yàn)原理（2）電場(chǎng)強(qiáng)度：與電泳速度成正比；（DNA/蛋白質(zhì)等大分子：100-500V，即常壓電泳；高壓電泳：氨基酸/核苷酸等小分子）溶液PH值：距等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，凈電荷越多，則速度越快；離子強(qiáng)度：越低則帶電物質(zhì)的速度越快。DNA分子量：越小則越快；DNA構(gòu)象：超螺旋＞線性＞開(kāi)環(huán)（質(zhì)粒）膠濃度：越低則速度越快TAE緩沖液：超螺旋結(jié)構(gòu)更符合其實(shí)際分子質(zhì)量；TBE：緩沖能力強(qiáng)，適合≤1KbDNA片段上樣緩沖液：EDTA—螯合鎂，防止DNA降解；含有聚蔗糖—防止樣品擴(kuò)散；遷移指示劑--溴酚藍(lán)相當(dāng)于0.5Kb大小；二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳分離DNA的原理和方法掌握檢測(cè)DNA的實(shí)驗(yàn)方法基因組DNA電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測(cè)儀等。瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，EB（溴化乙錠）或EB替代物，6X加樣緩沖液：Ⅰ0.25%溴酚藍(lán)（指示劑，約500bp），0.25%二甲苯青（指示劑，約5000bp），40%蔗糖水溶液（比重加大，防止擴(kuò)散）;Ⅱ0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液三、實(shí)驗(yàn)材料瓊脂糖凝膠板的制備（封板、梳子位置與高度、2%膠3mm、凝固后拔梳）倒緩沖液，加樣（取基因組DNA樣品液8μl+2μl上樣緩沖液（5×），混勻,上樣；）電泳（恒壓100V1小時(shí)）檢測(cè)（紫外檢測(cè)）四.操作步驟（1人1孔）PCR擴(kuò)增HBV基因產(chǎn)物的鑒定取PCR產(chǎn)物20μl直接上樣14325671%膠，電泳（100V30min）1：Marker2：陽(yáng)性模板3：待測(cè)樣品14：待測(cè)樣品25:待測(cè)樣品16:待測(cè)樣品27:待測(cè)樣品18