同源克隆完整版本

利用同源克隆獲得新基因劉同坤南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院植物基因同源克隆的原理

擬分離的基因在目標(biāo)植物上沒(méi)有報(bào)導(dǎo)過(guò),然而在其它植物上有過(guò)報(bào)導(dǎo)，在genebank上搜索已分離出的該基因的核苷酸序列或氨基酸序列，通過(guò)序列同源性比較找出該基因的保守區(qū)，并在該保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，通過(guò)ＰＣＲ擴(kuò)增得到目標(biāo)植物該基因的保守區(qū)片段，再通過(guò)基因組文庫(kù)篩選獲得該基因的全長(zhǎng)，或通過(guò)cDNA文庫(kù)篩選和ＲＡＣＥ（RapidAmplificationofcDNAends)獲得該基因的cDNA全長(zhǎng)。植物基因同源克隆的策略1.

植物基因組DNA的提取與純化

保守區(qū)引物設(shè)計(jì)

PCR擴(kuò)增基因保守區(qū)片段

構(gòu)建基因組文庫(kù)基因文庫(kù)篩選基因全長(zhǎng)的獲得2.植物總RNA的提取與純化

逆轉(zhuǎn)錄

cDNA

保守區(qū)引物設(shè)計(jì)

PCR擴(kuò)增構(gòu)建cDNA文庫(kù)

保守區(qū)cDNA片段設(shè)計(jì)RACE引物

5/-RACE3/-RACEcDNA文庫(kù)篩選

基因的cDNA全長(zhǎng)

植物基因保守區(qū)片段的克隆植物基因序列同源性的比較植物基因同源序列的搜尋進(jìn)入GeneBank：美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（nationalcentreforbiotechnologyinformation,NCBI)，網(wǎng)址為。NCBI的使用在search選項(xiàng)中選擇nucleotide,在For選項(xiàng)中輸入所要搜尋基因的名稱,按go,就可搜尋genebank中已經(jīng)克隆的基因的序號(hào)、基因名稱、注冊(cè)號(hào)；雙擊BD085077.Polyphenoloxidas...[gi:22630687]就顯示基因的全部?jī)?nèi)容，在display選項(xiàng)中選擇genebank。搜尋到基因的內(nèi)容LOCUSBD0850771319bpDNAlinearPAT27-AUG-2002DEFINITIONPolyphenoloxidasegenesfrombanana,tobaccoandpineapple.ACCESSIONBD085077VERSIONBD085077.1GI:22630687KEYWORDSJP2001525677-A/9.SOURCEAnanascomosus.ORGANISMAnanascomosusEukaryota;Viridiplantae;Streptophyta;Embryophyta;Tracheophyta;Spermatophyta;Magnoliophyta;Liliopsida;Commelinidaeincertaesedis;Bromeliaceae;Ananas.REFERENCE1(bases1to1319)AUTHORSRobinson,S.P.TITLEPolyphenoloxidasegenesfrombanana,tobaccoandpineappleJOURNALPatent:JP2001525677-A911-DEC-2001;COMMONWEALTHSCIENTIFICANDINDUSTRIALRESEARCHORGANISATIONCOMMENTOSPineapplePNJP2001525677-A/9PD11-DEC-2001PF19-MAY-1998JP1998549703PR19-MAY-1997AUPO6849PISIMONPIERSROBINSONPCC12N15/53,A01H1/00,A01H5/00CCPolyphenoloxidasegenesfrombanana,tobaccoandpineappleFHKeyLocation/QualifiersFTCDS(1)..(1053).FEATURESLocation/Qualifierssource1..1319/organism="Ananascomosus"/db_xref="taxon:4615"BASECOUNT332a347c406g234t基因序列同源性的比較

雙擊DNAMAN圖標(biāo)，打開DNAMAN的頁(yè)面，雙擊工具欄中的空白文檔圖標(biāo)，在文件菜單中選擇open選項(xiàng)，打開genebank中基因的內(nèi)容，或直接雙擊打開圖標(biāo)，打開genebank中基因的內(nèi)容。將genebank的基因序列轉(zhuǎn)變成seq文件

選中g(shù)enebank中的基因序列，按復(fù)制或ctr+C，雙擊DNAMAN工具欄中的空白文檔圖標(biāo)，按粘貼或ctr+V，把基因序列粘到DNAMAN上，先從edit菜單中點(diǎn)擊SelectAll，然后點(diǎn)擊SequenceFormat，彈出對(duì)話框，單擊確定；先從sequence菜單選擇Loadsequence，然后選擇display選項(xiàng)，在File菜單中選擇saveas，輸入文件名，在其后加上“.seq”。序列同源性的比較從Sequence菜單中點(diǎn)擊Alignment，選擇multiplesequencealignment，彈出對(duì)話框，點(diǎn)擊Add中的file，輸入兩個(gè)以上的基因序列，單擊確定，出現(xiàn)序列同源性高低的結(jié)果，單擊on，選擇mono-tree，單擊on，在進(jìn)化樹上出現(xiàn)同源性數(shù)值。ORIGIN

1ttgccgttttggaattgggacgcgccggggggcatgcagatcccggccatctacgccgac61gcttcgtccccgctctacgacaagctgcgcaatgcgaagcaccagccgccgactttggtc121gacctcgactacaacggcaccgacccgaccttcacccctgagcagcagatcgcccacaac181ctcaccatcatgtaccgacaggtgatatccggcgggaagacgccggagttgtttatgggc241gcggcgtaccgcgcgggcgacgcgccagacccgggcgcaggcactctagagctcgtgccg301cacaacacgatgcatttgtggaccggcgaccccaaccaacccaacgacgaagacatgggc361acgttctacgcggcggcgcgggaccccatcttcttcgcccaccacggcaacgtcgaccgc421atgtggtacgtgtggcggaaactcgggggcacgcaccgcgatttcaccgaccccgactgg481ctcaacgcgtccttcctcttctacgacgagaacgcgcagctcgtccgcgtcaaagtaaag541gactgcttgagcgccgacgcgctgcggtacacgtaccaggacgtcgacatcccgtggatc601agtgcgaagccgacgccgaagaaaacaccggggggcgctgcgccttccacgacagaggct661atatttccggtggtgctggataagccggtgagctctacggtggcgaggccgaagacgggg721aggagtactggggaggaggaggtgttggtggtggagggaatcgagctggacaaggacgtg781gccgtgaagttcgacgtgtatataaacgcgccggacaacgaaggggtggggccggaggcg841agcgagttcgcagggagcttcgtccaggtgccgcacaagcacaagaaggggaagaaggag901aaggcgaggattaaaacgacgctcaggctcgggataacggacctgctcgaggacatcggc961gccgaggacgacgagagcgtgctcgtcacgctcgtgccgaggataggcgaggggttggtc1021aaggttggtgggctaaggatcgatttctccaagtgatcagcagcaaattaactatacatg1081aaagtaaaaaaaattgcatttacctacctatagaagagaataaatgcgtatgtaatctgc1141cccatttgtcacttttaatttctcgagcgtgttctgaatgagagttgcatgcatgcgcgc1201agccataatgcctggtatagtgtagtagtttaggcgtggatacgtataacgtacgtatgc1261atgtataaggaataatgatgagtttactatgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa//

Revised:July5,2002.

Disclaimer|WritetotheHelpDesk

NCBI|NLM|NIH

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）技術(shù)PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)1.引物序列應(yīng)位于基因的高度保守區(qū)內(nèi)，且與非擴(kuò)增區(qū)域無(wú)同源性，提高PCR的特異性。2.引物的長(zhǎng)度以15-30bp為宜，常用23-25bp。3.引物的堿基應(yīng)盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)幾個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，G+C堿基的含量在40-75%之間，常用50-55%。4.引物內(nèi)部應(yīng)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，特別是引物的應(yīng)無(wú)回文結(jié)構(gòu)。

5.上下游引物不應(yīng)有互補(bǔ)序列，特別是3/端應(yīng)避免互補(bǔ)，以免形成引物二聚體。

6.引物的5/端堿基無(wú)嚴(yán)格限制，可加上內(nèi)切酶位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列或其他序列（最多可加10個(gè)堿基），便于對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析和克隆。7.引物3/端的頭1-2個(gè)堿基會(huì)影響TaqDNA聚合酶的延伸效率，影響PCR的擴(kuò)增效率和特異性，一般PCR的引物3/末端的堿基最好是C、G，其次為T，不用A，因?yàn)槟┪粸锳，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)鏈合成效率大大降低，末位為T，錯(cuò)配時(shí)也能引發(fā)鏈的合成。8.引物的3/端應(yīng)為保守氨基酸序列，即采用簡(jiǎn)并密碼少的氨基酸如Met、Trp，且要避免引物的3/末端不應(yīng)終止于密碼子的簡(jiǎn)并堿基。9.盡量采用植物偏好的密碼子。植物偏愛(ài)的密碼子氨基酸 密碼子 氨基酸 密碼子Gly(G) GAA Ile(I) ATCGlu(E) GAG Thr(T) ACCAsp(D) GAT Trp(W) TGGVal(V) GTT Cys(C) TGCAla(A) GCT Tyr(Y) TACArg(R) AGG Leu(L) CTTSer(S) TCT Phe(F) TTCLys(K) AAG Gln(Q) CAAAsn(N) AAC His(H) CACMet(M) ATG Pro(P) CCA用DNAMAN設(shè)計(jì)PCR引物在Primer菜單中點(diǎn)擊Self-complementarity，彈出對(duì)話框，顯示nocomplementarityfound，說(shuō)明引物無(wú)自身互補(bǔ)，關(guān)閉對(duì)話框，打開序列同源性比較的結(jié)果，檢查對(duì)應(yīng)的每個(gè)堿基是否存在簡(jiǎn)并，在簡(jiǎn)并位置上使用I或偏愛(ài)密碼子或簡(jiǎn)并密碼，將引物序列轉(zhuǎn)變成.seq文件，保存到特定位置，到此，上游引物設(shè)計(jì)完成。將下游的經(jīng)設(shè)計(jì)和確定的序列轉(zhuǎn)變成.seq文件，保存；打開該序列，選定，在Sequence菜單中點(diǎn)擊loadsequence，然后點(diǎn)擊Display和Rev.Compl.Sequence，在Primer菜單中選擇TwoPrimerComplimentarity和SecondPrimerFomInput，輸入上游引物序列，點(diǎn)擊OK，顯示兩個(gè)引物的互補(bǔ)情況，在3/端不應(yīng)出現(xiàn)連續(xù)4個(gè)的互補(bǔ)，關(guān)閉對(duì)話框，將下游引物轉(zhuǎn)變成.seq文件，保存。PCR反應(yīng)的全過(guò)程1.高溫變性:94℃下雙鏈DNA通過(guò)熱變性使其氫鍵斷裂解離成兩條單鏈。2.低溫退火：當(dāng)溫度降到引物Tm以下時(shí),引物與模板互補(bǔ)序列雜交。3.中溫延伸：當(dāng)溫度升高到72℃時(shí)，模板在dNTP、TaqDNAPolymerase、Mg2+存在下，以引物為起始，沿著5/3/方向延伸。PCR反應(yīng)體系的組成1.10×PCRBuffer（Mg2+plus):100mMTris-HCl，pH8.3；500mMKCl；0.1%geltin；15mMMgCl2。2.MgCl2:母液15mM或25mM，工作濃度1.5-5.0mM。3.dNTP:母液10mM或2mM，工作濃度200μM。4.引物：母液10μM或20μM，工作濃度0.1-1.0μM。5.TaqDNApolymerse:1-3U。6.模板DNA：1-500ng。PCR反應(yīng)體系20μl反應(yīng)體系10×PCRBuffer（Mg2+-free）:2μlMgCl2(15mM):2μldNTP(10mM):0.3μl5/-Primer(10μM):0.25μl3/-Primer(10μM):0.25μlDNA模板：10-250ngTaqDNApolymerase:1-2UddH2O:加至20μl50μl反應(yīng)體系10×PCRBuffer（Mg2+-free）:5μlMgCl2(15mM):3μldNTP(10mM):0.6μl5/-Primer(10μM):0.5μl3/-Primer(10μM):0.5μlDNA模板：10-250ngTaqDNApolymerase:1-2UddH2O:加至50μl100μl反應(yīng)體系10×PCRBuffer:10μlMgCl2(15mM):10μl（1.5-2.5mM）dNTP(10mM):10μl(各為200μΜ)5/-Primer(10μM):1μl（0.1-0.5μΜ）3/-Primer(10μM):1μl（0.1-0.5μΜ）TaqDNApolymerase(5.0U/μl）：3-5U基因組DNA模板：10-250ngddH2O:加至100μl94℃2-5min94℃30-40s退火溫度1min25-40cycles72℃1-2min72℃7-10min4℃保存PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)條件的選擇1.初變性：94℃5min。2.預(yù)變性：94℃30-45s。3.退火：退火溫度（55-72℃）一般選擇比理論Tm低5-10℃（常用5℃左右）。4.延伸：一般為70-75℃（常用72℃），擴(kuò)增長(zhǎng)度為1-2kb時(shí)延伸時(shí)間為1min，大于2kb時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)至5-10min，引物長(zhǎng)度小于16bp，可采用使延伸溫度緩慢上升到70-75℃，在最后一輪循環(huán)后在70-75℃(72℃)延伸10min。5.循環(huán)數(shù)：25-30個(gè)循環(huán)。常用的PCR反應(yīng)條件

94℃初變性5min，94℃30s、55℃30s、

72℃1min，25-30個(gè)循環(huán)，72℃10min后4℃停止反應(yīng)。木奈PPO基因保守區(qū)片段的PCR產(chǎn)物cDNA末端的快速擴(kuò)增技術(shù)

（RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE）5/-RACE5/RACE引物設(shè)計(jì)1.GC含量大于50%，退火溫度大于58°C2.3/端不能以A結(jié)尾3.GSP1盡可能靠近poly(A)4.GSP2與GSP3之間的間隔至少大于50bp5.GSP2、GSP3與AUAP不能在3/端有4個(gè)以上的互補(bǔ)配對(duì)6.擴(kuò)增cDNA全長(zhǎng)應(yīng)在ATG上游設(shè)計(jì)5/端引物，在終止密碼子的下游設(shè)計(jì)3/端引物7.GSP1、GSP2、GSP3均為反向基因特異引物8.一般兩個(gè)正向引物AAP與AUAP，AAP與GSP2配對(duì)，AUAP與GSP3配對(duì)AAP與AUAP的序列AAP的序列：5/-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3/。AUAP的序列：5/-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3/。5/RACE的全過(guò)程cDNA第一鏈的合成：在PCR管中加入GSP12.5pmol、總RNA1-5μg，無(wú)RNA酶水加至15.5μl，混勻，放70℃水浴保溫5min，放冰上冷卻后，離心；依次加入10XPCRbuffer2.5μl、25mMMgCl22.5μl、10mMdNTPmix1μl、0.1MDTT2.5μl總體積為24μl混勻，離心；42°C保溫1min，加入1μlSuperScript.IIRT，混勻，離心；42°C保溫1hr；70°C保溫15min，離心；放入37°C；加入1μlRNasemix，混勻，離心；37°C保溫30min，離心；-20°C保存逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的純化預(yù)先將binglingsolution放室溫，將100μl無(wú)菌水放65°C預(yù)熱；在逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入120μlbinglingsolution（6MNaI)；將混合物轉(zhuǎn)到GLASSMAXspincartridge中，13000g離心20s；取出柱子將離心管中的液體轉(zhuǎn)入到新的離心管中保存，將柱子放回到原離心管中；向柱子中加入0.4ml4°C預(yù)冷的1Xwashbuffer，13000g離心20s；去掉液體，重復(fù)洗3次；用400μl70%乙醇（4°C預(yù)冷）洗2次，去掉70%乙醇，13000g離心1min；將柱子轉(zhuǎn)移到新的離心管中加入50μl65°C預(yù)熱的無(wú)菌水，13000g離心20s洗脫cDNA。cDNA的加尾反應(yīng)在離心管中依次加入無(wú)RNA酶水6.5μl、5Xtailingbuffer5μl、2mMdCTP2.5μl、純化的cDNA10μl，總體積為24μl，混勻，離心；放94°C保溫2-3min，置冰上1min，離心；放冰上，加1μlTdT，混勻，37°C保溫10min；65°C保溫10min，離心。第一輪PCR：將PCR儀預(yù)先調(diào)到94°C；將0.2ml離心管放冰上，依次加入無(wú)菌水31.5μl、10XPCRbuffer5μl、25mMMgCl23μl、10mMdNTPmix1μl、10μMGSP22μl、AbridgedAnchorPrimer(10μM)2μl、dC-tailedcDNA5μl，總體積為49.5μl，加入0.5μlTaqDNApolymerase(5U/μl)，混勻，離心；PCR反應(yīng)；取5-20μl電泳。巢式PCR將PCR儀預(yù)先調(diào)到94°C；取5μl第一次PCR產(chǎn)物加入到495μlTE（pH8.0)中稀釋；將0.2ml離心管放冰上，依次加入無(wú)菌水31.5μl、10XPCRbuffer5μl、25mMMgCl23μl、10mMdNTPmix1μl、10μMGSP32μl、AUAPorUAP(10μM)2μl、dilutionofprimaryPCRproduct5μl，總體積為49.5μl，加入0.5μlTaqDNApolymerase(5U/μl)，混勻，離心；PCR反應(yīng)；取5-20μl電泳。3′-RACE3′-RACE的逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成：在PCR管中加入總RNA1-5μg、無(wú)RNA酶水加至11μl，加入1μl10mMAP，混勻，離心；放70℃水浴保溫10min，放冰上冷卻1min，離心；依次加入10XPCRbuffer2.5μl、25mMMgCl22.5μl、10mMdNTPmix1μl、0.1MDTT2.5μl總體積為24μl混勻，離心；42°C保溫2-5min；加入1μlSuperScript.IIRT，混勻，離心；42°C保溫50min；70°C保溫15min，離心；放冰上；加入1μlRNaseH，混勻，離心；37°C保溫20min，離心；-20°C保存3′-RACE第一輪PCR將PCR儀預(yù)先調(diào)到94°C；將0.2ml離心管放冰上，依次加入無(wú)菌