轉基因成分檢測 玉米檢測方法

1轉基因成分檢測玉米檢測方法本標準規(guī)定了玉米及其加工產品中轉基因成分檢測的PCR方法和實時熒光PCR方法。本標準的篩選檢測適用于玉米及其加工產品中轉基因成分的定性檢測。本標準的鑒定檢測適用于玉米MON810、Btl、Bt76、T14/T25、CBH351、GA21、MON863、Bt10、DP98140、MON87460、MON87427、5307、DAS40278-9品系轉基因成分的定性檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB/T19495.3轉基因產品檢測核酸提取純化方法GB/T19495.7轉基因產品檢測抽樣和制樣方法3術語、定義和縮略語3.1術語和定義下列術語和定義適用于本文件轉基因transgene將物種本身不具有的、宋源間物種的功能DNA序列。通過各種導入手段，使其在該物種中進行表達，以便該物種獲得新的品病導征在栽培的物種中拷貝數恒定的、不顯示等位基因變化的基國。該基因可用于對基因組中某一目的基因的定量分析。下列縮略語適用于本文件。IVR:玉米的轉化酶1基因，內源基因(imvertaseIgenefrommaize)Zein:玉米醇溶蛋白基因，內源基因。CaMV35S:來自花椰菜花葉病毒的35s啟動子(35SpomoterfromCaaLflowermosalewins)。CDPK:鈣依賴蛋白激酮基因[caleium-dependentpoteinkinase(CDPK)gene]。CgIA(b):蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白cryLA(b)基因[asyntheticggneencodesthefiret648aminoarids,insecticidal-activefrnuncatedpmduectidenticaltothatofcpyl4(b)geneofBacllastharinglensisCr9C:蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白Cn9C基因(inaecticidal-activefirancatedproductidenticaltothatofCy9CgeneofBacillustharinglensissabsHSP70:[0.8Kbintonfromthehsp70gene(heal-shockprotein)]來自熱休克蛋白(hsp70)基因的0.8Kb基因內區(qū)。IVS2:玉米乙醇脫氫酶基因的基因內區(qū)2(intmonfomthemaizealcoholdehydmgenasegene)。mEPSPS:來源于玉米的葬草酸羥基乙酰轉移酶(maize5-enolypyrurylshikimate-3-phosphatNOS:胭脂堿合成酶基因終止子(terminatorofnopalinesynthasegene)。NPTII:新霉素-3°磷酸轉移酶基因(neomycin-3'phosphotransferasepene)。OTP:優(yōu)化運輸肽基因(optimizedtramsitpepidegene)。PactinI:來源于玉米肌動蛋白1基因的啟動子[thepromoterderivedfromtherice(Orzasatia)PAT:草丁脾乙酰轉移酮基因(phosphinothricinacetyltransferasegene)。Tay:水生熱棲菌(Thermasaywaticw)。a值：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數(C:Cycle,t:threshold)。4防污染措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)行5抽樣和制樣按照GB/T19495.7中規(guī)定的方法執(zhí)行。稱取約50g玉米樣品，經干熱滅菌(150℃干熱預處理2h)或120℃、30mim高壓消毒處理的碾缽或粉碎機中碾磨至樣品粉末顆粒約0.5mm大小。樣品經過提取DNA后，針對轉基因植物所插人的外源基因的基因序列設計引物，通過PCR技術，特異性擴增外源基因的DNA片斷，根據PCR擴增結果，判斷該樣品中是否含有轉基因成分。6.2試劑和材料除另有規(guī)定外，其他試劑為分析純或生化試劑，水為按照GB6682規(guī)定的一級水。6.2.1引物：檢測轉基因玉米內、外源基因的引物及其信息見附錄A。62.5溴化乙錠(EB)或其他染色劑。6.2.11CTAB裂解液：3%CTAB(質量濃度),1.4mol/LNaCl,02%(體積分數)隨基乙醇，20mmolL.EDTA,100mmolLTris-HCl,62.12TE緩沖液：10mmolVLTis-HC,pH8.0;1mmolLEDTA,pH8.0。HCI(pH88)。1%TimnX-100,1mg/6.2.145×TBE緩沖液：Tris54g,硼酸275g,0.5mol/LEDTA(pH80)20mL,加蒸餾水至1000mL。6.2.1510×上樣緩沖液：025%溴酚藍，40%藍糖。6.3.1固體粉碎機及研缽6.32高速冷凍離心機6.3.3臺式小型離心機6.3.4Mimi個人離心機6.3.6純水器或雙蒸水器6.3.9核酸蛋白分析僅6.310凝膠成像系統(tǒng)。6.3.11微量移液器(0.1μL~2μl、0.5μL~10μL、2μL~20μL、10檢測過程中應按照GB/T19495.2中的規(guī)定設置對照陰性目標DNA對照：不含外源目標核酸序列的DNA片段。陽性目標DNA對照：參照DNA,或從可溯源的標準物質提取的DNA,或從含有已知序列陽性樣品(或生物)中提取的DNA。擴增試劑對照：該對照包括除了測試樣品DNA模板以外所有的反應試劑，在PCR反應體系中用相同體積的水(不含核酸)取代模板DNA。稱取1g粉樣于10mL離心管中，加入5mLCTAB裂解液(含適量RNA酶),混勻，60℃水浴振蕩保溫1h,2000rmin離心5min;取上清液，加等體積三氯甲烷/異戊醇(體積比：24/1)混勻，靜置5min,8000fmin離心5min;小心取離心上清液。再加等體積三氯甲烷/異戊醇(體積比：24/1)混勻，靜置5min,8.000thmin離心5min;取離心上清液加0.65倍體積的異丙醇，混勻，12000r/min4℃離心10min;棄上清液，加500μL70%冰乙醇洗滌一次，12000rpm4℃離心5min;棄上清。將沉淀晾干，加入50pLTE,溶解沉淀(4℃過夜，或37℃保溫1hr)。此即為總DNA提取液。也可用相應市售DNA提取試劑盒提取DNA,或參照GB/T19495.3執(zhí)行。PCR反應體系見表1,每個樣品各做兩個平行管。加樣時應使樣品DNA溶液完全落入反應液中，不要粘附于管壁上，加樣后應盡快蓋緊管蓋表1PCR反應體系dMIP(含dUIP)50℃PCR前去污染2min,94℃預變性2min。94℃變性40s,55℃~58℃退火60s,72℃延伸60s,35個循環(huán)，72℃延伸5min,4℃保存。也可根據不同的基因擴增儀對PCR反應循環(huán)參數做適當調整56.4.4PCR擴增產物電泳檢測用電泳緩沖液(1×TBE或TAE)制備2%瓊脂糖凝膠(其中在55℃-60℃左右加人EB或其他染色劑至終濃度為0.5μg/mL,也可在電泳后進行染色)。將10μL~15μLPCR擴增產物分別和2pL上樣緩沖液混合，進行點樣。用100bpLadderDNAMarker或相應合適的DNAMarker作分子量標記。3Vem-5Vem恒壓，電泳20min~40min。凝膠成像儀觀察并分析記錄。6.5結果判斷6.5.1內源基因的檢測用針對玉米內源基因IVB基因(或Zcin基因)設計的引物對玉米DNA提取液進行PCR測試，待測樣品應被擴增出226bp(或173bp)的PCR產物。如未見有該PCR產物擴增，則說明DNA提取質量有問題，或DNA提取液中有抑制PCH反應的因子存在，應重新提取DNA,直到擴增出該PCRI產物。6.5.2外源基因的檢測對玉米樣品DNA提取液進行外源基因的PCR測試，如果陰性目標DNA對照和擴增試劑對照未出現擴譜條帶，陽性目標DNA對照和待測樣品均出現頂期大小的擴增條帶(擴增片段大小見附錄A中的表A.1),則可初步判定待測樣品中含有可疑的該外源基因，應進一步進行確證試驗(見6.6),依據確證試驗的結果最終報告；如果待測樣品中未出現PCR擴增產物，則可斷定該待測樣品中不含有該外源基因。6.5.3篩選檢測和鑒定檢測的選擇對玉米樣品中轉基因成分的檢測按照附錄A執(zhí)行，先篩選檢測CaMV35S、NOS、NPTII、PAT、若篩選檢測結果陽性，則需進一步鑒定檢測MON810、BtI、Be176、T14/T25、CBH351、GA21、TC1507、MON863、NK603、Br10的結構特異性基因或品系特異性基因，以確定是何種轉基因玉米品系。實時熒光PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過擴增曲線對檢測模板進行定性分析的方法7.2主要儀器實時熒光定量PCR儀；核渦酸蛋白分析儀；高速冷凍離心機、臺式小型離心機、Mini個人離心機；純水器或雙蒸水器；旋渦振蕩器；微量進樣器(0.5μL,2μL,10μL。20μt,100μL,200μL.1000μL);離心管：1.5mL-5mL;實時熒光PCR反應管。除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。6實驗用水：應符合GB6682中一級水的規(guī)格；PCR緩沖液；MgCl,;dNTPsdATP、dTTP、dCTP、引物和探針：玉米轉基因成分實時熒光PCR檢測所用引物和探針序列見附錄A表A.2。7.4.1對照的設置7.4.3實時熒光PCR反應體系實時熒光PCR反應體系見表2、表3(可根據實際需要任選其一),每個樣品各做兩個平行管。加樣時應使樣品DNA溶液完全落入反應液中，不要粘附于管壁上，加樣后應盡快蓋緊管蓋。551111UNG酶(1UhuL)上游引物(10pmo/L)1下游引物(10μmlL)1探針(5pmol/L)17ag酶(5UWL)DNA模板(40ngjuL-50ngjpL)5TaqMamRRUmiveosalPCRMasterMix(2x)上游引物(10μmol/L)7探針(5μmol/L.DNA模板(40nghuL-50nguL)注：表中DNA模板為原料的模板量，加工產品可視加工程度適當增加模板量，也可根據具體情況7.4.4實時熒光PCR反應參數實時熒光定量PCR的反應參數為：50℃PCR前去污染2min;預變性95℃10min;95℃15s,60℃1min,45個循環(huán)。7.4.5儀器檢測通道的選擇PCR反應管熒光信號收集的設置，應與探針所標記的報告基團一致。報告基團為FAM時，熒光信號收集應設在FAM通道：報告基團為TET時，熒光信號收集應設在TET通道；以此類推。具體設置方法因儀器而異，可參照儀器使用說明書7.4.6實時熒光PCR反應運行按預先設定的樣品擺放順序將PCR反應管依次擺放(上機前應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄漏污染儀器).開始運行儀器進行實時熒光PCR反應。7.4.7結果分析實時熒光PCR反應結束并分析結果后，應設置無效基線范圍。無論采用任何熒光通道(FAM或TET),基線范圍選擇在315個循環(huán)，如果有強陽性樣本，應根據實際情況調整基線范圍。閥值設置原則以基線剛好超過4陰性4標DNA對照擴增曲線的最高點，且Cr值等于40為準。7.4.7.2Ct值與DNA濃度的關系Ca值大于或等于40時，PCR過程中無目標DNA的擴增；a值在36至40之間，且平行樣的每個值之間的差異很大，表明PCR反應體系中的目標DNA量很少，應適當增加模板量。7.5實時熒光PCR檢測的質量控制擴增試劑對照：外源基因檢測C值大于或等于40。內源基因檢測C值大于或等于40。陰性目標DNA對照：外源基因檢測a值大于或等于40。陽性目標DNA對照：外源基因檢測C值小于或等于36。上述指標有一項不符合者，應重做實時熒光PCR擴增。7.6篩選檢測和鑒定檢測的選擇對玉米樣品中轉基因成分的檢測，可參考附錄B的內容，先篩選檢測CaMV35S、NOS、NPTI、PAT、BAR、CrIA(b)基因，篩選檢測結果陰性則直接報告結果。8若篩選檢測結果陽性，則需進一步鑒定檢測MON810、Bt1、B1176、T14/T25、CBH351、GA21、ES3272、Bt10、DP98140、MON87460、MON87427、5307、DAS40278-9品系特異性基因，以確定是何種轉基因玉米品系。7.7結果判斷待測樣品外源基因檢測Ca值大于或等于40,內源基因檢測C值小于或等于28,設置的對照結果正常者，則可判定該樣品未檢出xxx基因；待測樣品外源基因檢測ca值小于或等于36,內源基因檢測C值小于或等于28,設置的對照結果正常者，則可判定該樣品檢出xx×基因；待測樣品外源基因檢測Cr值在36~40之間，應重做實時熒光PCR擴增。再次擴增后的結果Ct值仍小于40,且設置的對照結果正常，則可判定該樣品檢出×××基因；再次擴增后結果Ci值大于40。且設置的對照結果正常，可判定該樣品未檢出xx×基因。8結果表述8.2檢出xxx基因，(可進一步報告)該樣品中含有xx××轉基因玉米品系內源5'-cgigtalcaeaaprtgp任選其一內源基因5°-gatmitgnata-3”篩選檢測任選其一-ttateetagttgrpgrta-3”任選其一品系5°-ctcpaappccetiost5°-lctrgsltiltggectl5°-aegtggaugigtlont5”-gactcaagiootgpog5°-atgutgicctiegngtaateii5°-aapapatateaggaloacteaa5"-cacarzopatlatLatapod5'標記FAM:3'標記TAMRA或blips(內源基因)(內源基因)5°-egegtieccactetleetee-3”5°-alegtteiscattgga-3”5”-cgrtragtggarguaartr-3”5°-cgllotggpaaggstagiatrgc-3”S'-ocpagepeapgscepr任選其一125品系5“-dtategtalptalltpsaar5°-lgstc