基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)課件

Microarray-baseddiscoveryofhighlyexpressedolfactorymucosalgenes:potentialrolesinthevariousfunctionsoftheolfactorysystem

基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)：在嗅覺系統(tǒng)多功能作用中扮演的潛在角色基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)實驗?zāi)康模韩@得在嗅黏膜中組織特異性基因表達的全局觀。Why？

OM呼吸道與神經(jīng)系統(tǒng)的交界處，執(zhí)行使兩個器官系統(tǒng)連為一體的功能，是脊椎動物成體中神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)再生的主要位點。嗅覺器官的感覺神經(jīng)元負責(zé)氣味轉(zhuǎn)換，呼入的空氣中有毒媒介能夠被鼻呼吸道和嗅覺組織中的黏膜纖毛結(jié)構(gòu)和代謝酶清除。OM相對于其它神經(jīng)組織的獨特之處在于：OM有一個基底細胞群，能夠不斷地提供新的神經(jīng)元，使因受傷或毒氣損傷而丟失的神經(jīng)元得以替換?；谖㈥嚵械男狃つぶ懈弑磉_基因的發(fā)現(xiàn)

MATERIALSANDMETHODS

SECTION1基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)MATERIALSANDMETHODS：1、Animals,tissuesamples,andRNApreparation2、Fluorescentprobepreparationandmicroarrayhybridization3、Dateanalyses4、confirmatorytest

5、Identi?cationofcis-elementsincoordinatelyexpressedgenes基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)組織來源：

成鼠的嗅黏膜（OM）、嗅球（olfactorybulb）、鼻呼吸道黏膜（nasalrespiratorymucosa）組織取自6-8周齡的C57BL/6雌性小鼠。Theethmoidturbinatesandcaudalone-thirdofthenasalseptumservedasthesourceofOMRNA,andthenasoturbinates,maxillo-turbinates,andanteriortwo-thirdsofthenasalseptumwerethesourceofrespiratorymucosalRNA.Othertissuesincludingmulti-plebrainsubregions,dorsalrootganglion,heart,lung,kidney,liver,reproductiveandendocrineorgans,immuneorgans,muscle,andskinarefromageneralizedmousegeneexpressiondatabase.RNA提?。河肅O2吸入法處死小鼠解剖小鼠，迅速取出組織，液氮速凍將取自八只小鼠的組織在冰上勻漿TRIReagent提取總RNA總RNA用酒精、醋酸鈉沉淀總RNA在DEPC水中溶解基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)ProbepreparationandmicroarrayhybridizationwereperformedbyIncyteGenomics(PaloAlto,CA)usingtheGEMBrightrandomprimerreversetranscriptionlabelingkit(IncyteGenomics).LabeledcDNAwaspreparedfromeachpoly(A)+RNAsampleusingnucle-otideslabeledwiththe?uorescentdyeCy5.LabeledcDNAswerethensubjectedtocompetitivehybridizationtomouseGEM1microarrays,composedofspottedcDNAscorrespondingto8,638sequence-veri?edIMAGEexpressedsequencetag(EST)clones(500–5,000nucleotidesinlength)withalowredundancyratewithrespecttotheircorrespondinggeneproducts.Forallsamplesinthedatabase,hybridizationswereperformedincompetitionwithCy3-labeledmRNAfromwholepostnatalday1(P1)mouse.基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)ForeachmRNAsample,duplicatearrayswerehybridized.Additionaldye-?ipcontrolexperimentsindicatedalowdyeeffect,particularlycomparedwithotherCy3/Cy5labelingmethods(datanotshown).Dyeeffectwas,however,subtractedfromrelativesample-speci?cgeneexpressionbasedonpergenemediannormalizationacrossalargenumberofsamples.FluorescenceintensityanalysesandbackgroundsubtractionwereperformedusinganAxonInstrumentsscannerandGenePixsoftware.基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)的預(yù)處理：數(shù)據(jù)分析、點幾何學(xué)和背景熒光用IncyteGEMTools軟件處理。1、芯片上有缺陷的點（不規(guī)則的幾何形狀、有刮痕、點的面積小于平均面積的40%）在數(shù)據(jù)集中被刪除；2、數(shù)據(jù)的對數(shù)轉(zhuǎn)化：所有數(shù)據(jù)集用Cy5測量通道中值除去Cy3測量通道中值進行平衡系數(shù)歸一化；3、每張芯片包含192個對照基因，包括非哺乳動物單個基因和大多數(shù)細胞類型中表達的基因構(gòu)成的復(fù)雜靶標(biāo)。4、每個實驗中mRNA樣品用增加數(shù)量的非哺乳動物RNA（2-fold、4-fold、16-fold，etc）進行放大從而允許對從每張芯片中獲得的動態(tài)范圍進行評估。基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)第二階段的數(shù)據(jù)分析用Gene-spring軟件處理。1、基因的歸一化處理：①Cy5對數(shù)值/Cy3對數(shù)值②用LOWESS方法進行局部加權(quán)歸一化處理③一系列探針中每個基因的歸一化每個測量值/全部測量值中值>=0.01每個基因在每個樣本中的測量值/該基因在全部樣本中的測量中值>=0.012、找出在MO中高表達的基因基因表達量與在數(shù)據(jù)庫中所有其它組織中的表達中值之比>=1.7269個基因3、用分層樹聚類方法對269個基因進行分類基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)對芯片數(shù)據(jù)的實驗驗證&組織原位雜交

選取在MO中高表達的基因進行分析定位

(Sgpl1、Cyp2f2、Dmbt1、Ltf）&免疫組織化學(xué)

抗血清、二抗的制備、組織切片&Sgpl1蛋白活性測定

材料：maleLong-Evansrats方法：用sphinganine-1-phos-phate測定活力基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)共表達基因順式作用元件的確定&geneontology&選取三個亞分類(每個亞分類選取三個基因）進行分析&通過數(shù)據(jù)庫獲得選定的基因在人和小鼠中的全序列分析&序列比對找出保守的順式作用元件&通過TRANSFACTDatebase和DNA-bindingsitepro?les定位作用元件位點&找出選定基因的相同順式作用元件位點基因分類基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)SECTION2RESULTS基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)

RESULTS1、IdentificationofgeneshighlyexpressedinadultOM.

成熟OM組織中高表達基因的鑒定2、Sgpl1activitymeasurements.

Sgpl1基因活力的測定3、Insituhybridizationandimmunohistochemistrystudies.

原位雜交和免疫組化學(xué)分析4、Functionalclassificationofgeneshighlyexpressedintheadultmouseolfactorysystem.

成熟OM系統(tǒng)中高表達基因的功能分類5、Genediscoveryintheolfactorysystem.

嗅覺系統(tǒng)基因的發(fā)現(xiàn)6、Commoncis-elementsincoordinatelyexpressedgenes.

共表達基因共同順式作用元件的鑒出基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)GENEEXPRESSIONINOLFACTORYMUCOSAPEARSONcorrelation269/8734(1.7-foldhigher)ROW：geneCOLUMN:tissueRED:upregulatedBLUE:downregulated→temporallyandspatiallyrestrictedexpression基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)MaleLong-EvansratsNormalizedexpressionPvalue(UC-CHMCCgeneexpressiondatabase)Activity(VanVeldhovenPP.Sphingosine-1-phosphatelyase.MethodsEnzymol311:244–254,2000)→activityofSgpl1inOMwasindeedhigh基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)TheBowman’sglandstheepithelialsurfaceofthedorsalseptum&theturbinatesliningthedorsalmedialairwaysductandacinarcellsofBowman’sglandsapicalcytoplasmofsustentacularcellsantisenceCyp2f2anti-Cyp2f2antibody基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)***olfactoryepitheliallayer(olfactorysensoryneurons)subepithelialcompartmentsustentacular(supporting)cells***negativenegativeantisenseSgpl1senseSgpl1基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)perinuclearlayerofmatureolfactorysensoryneurons***olfactoryepithelialcompartmentsubepithelialstructuresanti-Sgpl1antibodyantisenseAlms1基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)lateralnasal

glandolfactoryepithelium(oftendisplayinghigh

expressionatthejunctionsofOMandrespiratory

mucosa)antisenceDmbt1antisencePlunc基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)*upstream3-kbregion*TraFaCserver基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)discussionsection3基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)特色一、充分運用了各種數(shù)據(jù)庫資源NCBI、ENSEMBLUC-CHMCCEST→全基因序列SwissProt、Geneontology基因功能注釋功能分類BlastNTransfact序列比對結(jié)構(gòu)域確定順式作用元件確定基于微陣列的嗅黏膜中高表達基因的發(fā)現(xiàn)特色二、就OM組織解剖學(xué)與生理學(xué)對其基因表達模式進行了細致分析1.OM中神經(jīng)細胞直接與外界接觸→高表達與解毒代謝相關(guān)的基因（與LungandLiver比較得出）2.OM有神經(jīng)細胞再生功能→高表達與神經(jīng)再生與神經(jīng)發(fā)育的基因芯片雜交結(jié)果顯示：OM、胚胎、出生一天小鼠腦都高表達一些與神經(jīng)分化、遷