第二部分 提高性實(shí)驗(yàn)

第二部分提高性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)十三核酸的制備及定量測(cè)定

I.動(dòng)物肝臟DNA的提取

一、目的：

了解分離提取DNA的一般原理，掌握從動(dòng)物肝臟中提取DNA的方法。

二、原理：

在濃氯化鈉（l-2mol-L'）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的

溶解度很小。在稀氯化鈉（0.14moi?L“）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖

核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核

蛋白從樣品中分別抽提出來(lái)。

將抽提得到的核蛋白用SDS（十二烷基磺酸鈉）處理，DNA（或RNA）即與蛋白質(zhì)

分開，可用氯仿一異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適

量乙醇，DNA即析出。

為了防止DNA（或RNA）酶解，提取時(shí)加EDTA（ethy-lenediaminetetraceticacid,

乙二胺四乙酸）。

三'器材及試劑：

1.器材：

①新鮮豬肝（一次用不完一定要冷凍保存）

②勻漿器

③離心機(jī)5000r,min-1

④量筒50ml（XI）、10ml（XI）

⑤水浴鍋

⑥紗布

⑦真空干燥器

2.試劑：

①5moi-L'NaCl溶液：將292.3gNaCl溶于水，稀釋至1000ml0

@0.14mol-L'NaCl-O.lOmol?L'EDTA-Na溶液：溶8.18gNaCl及37.2gEDTA-Na于

蒸儲(chǔ)水，稀釋至1000ml?

③25%SDS溶液：溶25g十二烷基磺酸鈉于100ml45%乙爵。

@0.015mol?L'NaCl-0.0015mol-L-1檸檬酸三鈉（salineitrate）溶液：氯化鈉0.828g

及檸檬酸三鈉0.341g溶于蒸僧水，稀釋至1000mlo

⑤氯仿一異戊（丙）醇混合液：氯仿：異戊（丙）醇=24：1（V/V）

@1.5mol-L'NaCl-0.15mol-L-1檸檬酸三鈉溶液：氯化鈉82.8g及檸檬酸三鈉34.1g

溶于蒸儲(chǔ)水，稀釋至1000mla

⑦3moi?1/乙酸鈉-0.001mol?L-iEDTA-Na溶液：稱取乙酸鈉408g、EDTA-NaO.372g

溶于蒸儲(chǔ)水，稀釋至1000ml?

⑧70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇。

四'操作步驟：

1.取豬肝20~30g,用適量0.14mol?L」NaCl-0.10mol?L」EDTA溶液洗去血液，剪碎，

加入約30~50ml0.14mol?L'NaCl-O.lOmol?L'EDTA溶液，置勻漿器或研缽中研磨，研磨

一定要充分，待研成糊狀后，用單層紗布濾去殘?jiān)?，將濾液離心10分鐘（4000r-min'）

棄去上清液，沉淀用0.14mol?L'NaCl-O.lOmol?L'EDTA溶液洗二、三次。所得沉淀為

脫氧核糖核蛋白粗制品。

2.向上述沉淀物加入0.14moH/NaCl-0.10mol?L'EDTA溶液,使總體積為37ml,

然后滴加25%SDS溶液3ml,邊加邊攪拌。加畢，置60℃水浴保溫10分鐘（不停攪拌）

溶液變得粘稠并略透明，取出冷至室溫。此步操作系使核酸與蛋白質(zhì)分離。

3.加入5mol-L-'NaCl溶液10ml,使NaCl最終濃度達(dá)到1mol-L1,攪拌10分鐘，

加入約一倍體積的氯仿-異戊（丙）醇混合液，振搖10分鐘，靜置分層，取上、中兩層液

離心10分鐘（4000r-min-'）o去掉沉淀，上層清液徐徐加入1.5—2倍95%乙靜:，DNA沉

淀即析出，用玻璃棒順著一個(gè)方向慢慢攪動(dòng)，則DNA絲狀物即纏在玻棒上。

4.將DNA粗品置于27mI0.015mol?L'NaCl-O.OOlSmol?L"檸檬酸三鈉溶液中，再

加入3mll.5mol?L'NaCl-0.15mol?L"檸檬酸三鈉溶液，攪勻，加入一倍體積氯仿一異戊

（丙）醇混合液,振搖10分鐘,離心（4000r?min”，10分鐘）,傾出上層液（沉淀?xiàng)壢ィ?

加入1.5倍體積95%乙醇，DNA即沉淀析出。離心，棄去上清液，沉淀（粗DNA）按本

操作步驟重復(fù)一次。

5.將上步所得沉淀溶于27m10.0l5moiL」NaCl-0.0015moi檸檬酸三鈉溶液中，然

后以線狀徐徐加入2倍95%乙醉，邊加邊攪，取出絲狀DNA,依次用70%、80%、95%及

無(wú)水乙醇各洗一次，真空干燥。保存待用。

五、結(jié)果與討論：

1.所提取的DNA是否是純品？如何進(jìn)一步提高其純度？

2.DNA提取過(guò)程中的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)有哪些？

II.酵母RNA的提取

一、目的：

學(xué)習(xí)稀堿法提RNA的原理與技術(shù)。

二'原理：

由于RNA的來(lái)源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法

和鹽酸IM法。其中苯酚法又是實(shí)驗(yàn)室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶

于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以

白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)。上述方法提取的RNA具有生物活

性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA,用這2種方法所提取的核酸均為變性的RNA,

主要用作制備核甘酸的原料?，其工藝比較簡(jiǎn)單。濃鹽法是用10%左右氯化鈉溶液，90℃提

取3—4h,迅速冷卻，提取液經(jīng)離心后，上清液用乙醇沉淀RNA。

稀堿法使用稀堿(本實(shí)驗(yàn)用0.2%NaOH溶液)使酵母細(xì)胞裂解，然后用酸中和，除去

蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙僧:沉淀RNA(本實(shí)驗(yàn))或調(diào)pH2.5利用等電點(diǎn)沉淀。提取的

RNA有不同程度的降解。

酵母含RNA達(dá)2.67—10.0%,而DNA含量?jī)H為0.03—0.516%,為此，提取RNA多

以酵母為原料。

三'器材與試劑：

1.器材：

①干酵母粉(市售)。

②鮮酵母(市售)。

③pH試紙(pHl—10)?

④臺(tái)天平(100g)。

⑤燒杯100ml(Xl)?

⑥量筒50ml(X1)、10ml(XI)。

⑦抽濾瓶500ml(X1)、布氏漏斗。10cm(XI),

⑧吸管0.5ml(XI)、1ml(義2)、2ml(X2)、5ml(XI)。

⑨離心機(jī)5000r?min」。

2.試劑：

①0.2%氫氧化鈉溶液：2gNaOH溶于蒸儲(chǔ)水并稀釋至1000ml0

②乙酸（A?R）。

③95%乙醇。

④無(wú)水乙醛（C?P）。

⑤氨水（C?P）。

⑥10%硫酸溶液：濃硫酸（比重1.84）10mh緩緩傾于水中，稀釋至100ml。

⑦5%硝酸銀溶液：5gAgNO3溶于蒸儲(chǔ)水并稀釋至100mL貯于棕色瓶中。

⑧苔黑酚一三氯化鐵試劑：將lOOmg苔黑酚溶于100ml濃鹽酸中，再加入

lOOmgFeCh,6H2O.臨用時(shí)配制。

四'操作步驟：

1.RNA的提取：置4g干酵母粉于100ml燒杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml,沸水

浴加熱30分鐘，經(jīng)常攪拌。加入乙酸數(shù)滴，使提取液呈酸性（石蕊試紙），離心10—15

分鐘（4000r?min」）。取上清液，加入95%乙醛30ml,邊加邊攪。加畢，靜置，待完全沉

淀，過(guò)濾。濾渣先用95%乙醇洗2次（每次約10ml）,繼用無(wú)水乙醛洗2次（每次10ml）,

洗滌時(shí)可用細(xì)玻棒小心攪動(dòng)沉淀。乙醛濾干后，濾渣即為粗RNA,可作鑒定。

2.鑒定：取上述RNA約0.5g,加10%硫酸液5mL加熱至沸1一2分鐘，將RNA7K

解。

（1）取水解液0.5ml,加苔黑酚一FeCb試劑1mL加熱至沸1分鐘，觀察顏色變化。

（2）水解液2ml,加氨水2ml及5%硝酸銀溶液1ml,觀察是否產(chǎn)生絮狀喋吟銀化合

物（有時(shí)絮狀物出現(xiàn)較慢，可放置十幾分鐘）。

五、結(jié)果與討論：

1.所得RNA是否是純品？如何進(jìn)一步純化？

2.RNA提取過(guò)程中的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)有哪些？

m.核酸的定量測(cè)定（一）一一定磷法

一、目的：

掌握定磷法測(cè)定核酸的含量。

二、原理：

在酸性環(huán)境中，定磷試劑中的鋁酸鏤以鋁酸形式與樣品中的磷酸反應(yīng)生成磷鋁酸，當(dāng)

有還原劑存在時(shí)磷鉗酸立即轉(zhuǎn)變藍(lán)色的還原產(chǎn)物一一銅藍(lán)。

H3PO4+12H2Mo04fH3P（M03C）10）4+12H2O

I還原劑

鋁藍(lán)

鋁藍(lán)最大的光吸收在650—660nm波長(zhǎng)處。當(dāng)使用抗壞血酸為還原劑時(shí)，測(cè)定的最適

范圍為1-10微克無(wú)機(jī)磷。

測(cè)定樣品核酸總磷量，需先將它用硫酸或過(guò)氯酸消化成無(wú)機(jī)磷再行測(cè)定?？偭琢繙p去

未消化樣品中測(cè)得的無(wú)機(jī)磷量，即得核酸含磷量，由此可以計(jì)算出核酸含量。

三'器材及試劑：

1.器材：

①分析天平。

②容量瓶（50及100毫升）。

③臺(tái)式離心機(jī)。

④離心管。

⑤凱氏燒瓶（25毫升）。

⑥恒溫水浴鍋。

⑦200℃烘箱。

⑧硬質(zhì)玻璃試管。

⑨吸量管。

⑩分光光度計(jì)。

2.試劑：

以下試劑均用分析純，溶液要用重蒸水配制。

①標(biāo)準(zhǔn)磷溶液：將分析純磷酸二氫鉀（KH2P。4）預(yù)先置于105℃烘箱烘至恒重。然后

放在干燥器內(nèi)使溫度降到室溫，精確稱取0.2195克（含磷50毫克），用水溶解，定容至

50毫升（含磷量為1毫克/毫升），作為貯存液置冰箱中待用。測(cè)定時(shí)，取此溶液稀釋100

倍，使含磷量為10微克/毫升。

②定磷試劑3mol?1?硫酸：水：2.5%銅酸鐵：10%抗壞血酸=1：2：1：1（體積比）］：

配制時(shí)按上述順序加試劑。溶液配制后當(dāng)天使用。正常顏色呈淺黃綠色，如呈棕黃色或深

綠色不能使用，抗壞血酸溶液在冰箱放置可用1個(gè)月。

③沉淀劑：稱取1克鋁酸鍍?nèi)苡?4毫升70%過(guò)氯酸中，加386毫升水。

④5moi,L"硫酸。

⑤30%過(guò)氧化氫。

四'操作步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取12支洗凈烘干的硬質(zhì)玻璃試管，按下表加入標(biāo)準(zhǔn)磷溶液、水

及定磷試劑，平行作兩份。

標(biāo)準(zhǔn)磷溶液水相當(dāng)于無(wú)機(jī)磷量定磷試劑

編號(hào)

（毫升）（毫升）（微克）（毫升）

103.003

20.22.823

30.42.643

40.62.463

50.82.283

61.02.0103

將試管內(nèi)溶液立即搖勻，于45℃恒溫水浴內(nèi)保溫25分鐘。取出冷卻至室溫，于660nm

處測(cè)定光密度。

取兩管平均值，以標(biāo)準(zhǔn)磷含量（微克）為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.測(cè)總磷量：取4個(gè)微量凱氏燒瓶，1、2號(hào)瓶?jī)?nèi)各加0.5毫升蒸儲(chǔ)水作為空白對(duì)照，

3、4號(hào)各加0.5毫升制備的RNA溶液（約3毫克RNA）,然后各加毫升5mol-L-1

硫酸。將凱氏燒瓶置烘箱內(nèi)。于140—160℃消化2—4小時(shí)。待溶液呈黃褐色后，取出稍

冷，加入1—2滴30%過(guò)氧化氫（勿滴于瓶壁），繼續(xù)消化，直至溶液透明為止。取出，冷

卻后加0.5毫升蒸儲(chǔ)水，于沸水浴中加熱10分鐘，以分解消化過(guò)程中形成的焦磷酸。然后

將凱氏燒瓶中的內(nèi)容物用蒸儲(chǔ)水定量地轉(zhuǎn)移到50毫升容量瓶?jī)?nèi)，定容至刻度。

取4支硬質(zhì)玻璃試管，分成兩組，分別加入1毫升上述消化后定容的樣品和空白溶液,

如前法進(jìn)行定磷比色測(cè)定。測(cè)得的樣品光密度減去空白光密度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出磷的

微克數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)即得每毫升樣品中的總磷量。

3.測(cè)無(wú)機(jī)磷量：取4支離心管，于2支中各加水0.5毫升，另2支中各加0.5毫升制

備的RNA溶液，然后于4支離心管中各加0.5毫升沉淀劑，搖勻，以3500轉(zhuǎn)/分離心15

分鐘，取0.1毫升上清液，加2.9毫升水和3毫升定磷試劑，同上法比色，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查

出無(wú)機(jī)磷的微克數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)即得每毫升樣品中的無(wú)機(jī)磷量。

五、結(jié)果與討論：

1.繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.計(jì)算

RNA的含磷量為9.5%,因此可以根據(jù)磷含量計(jì)算出核酸量，即1微克RNA磷相當(dāng)于

10.5微克RNAo將測(cè)得的總磷量減去無(wú)機(jī)磷量即RNA磷量。如樣品中含有DNA時(shí)，RNA

磷量尚需減去DNA磷量，才得到RNA磷量。DNA的含磷量平均為9.9%。

RNA量=（總磷量一無(wú)機(jī)磷量一DNA量X9.9%）X10.5

核酸％=待測(cè)液中測(cè)得的如微克數(shù)義I。。

待測(cè)液中制品的微克數(shù)

思考題

定磷法的操作中有哪些關(guān)鍵環(huán)節(jié)？為什么所用水的質(zhì)量、消化時(shí)間、鋁酸鉉的質(zhì)量和顯色時(shí)酸的濃

度對(duì)測(cè)定結(jié)果影響很大？操作中應(yīng)如何控制？

IV.核酸的定量測(cè)定（二）一一紫外吸收法

一、目的：

學(xué)習(xí)和掌握應(yīng)用紫外分光光度法直接測(cè)定核酸含量的原理及技術(shù)。熟悉紫外分光光度

計(jì)的基本原理與使用。

二、原理：

DNA和RNA都有吸收紫外光的性質(zhì)，它們的吸收高峰在260nm波長(zhǎng)處。吸收紫外光

的性質(zhì)是喋吟環(huán)和口密噓環(huán)的共規(guī)雙鍵系統(tǒng)所具有的，所以喋吟和口密咤以及一切含有它們的

物質(zhì)，不論是核甘、核甘酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核昔酸的摩爾消光系數(shù)

（或稱吸收系數(shù)）用E（尸）來(lái)表示，E（P）為每升溶液中含有一摩爾原子核酸磷的消光

值（即光密度或稱光吸收）。RNA的E（P）260nm（pH7）為7700—7800。RNA的含磷量

約為9.5%,因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相當(dāng)于0.022—0.024。小牛胸腺DNA

鈉鹽的E（P）260nm（pH7）為6600,含磷量為9.2%,因此每毫升溶液含1微克DNA鈉

鹽的光密度值為0.020。

蛋白質(zhì)由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm

波長(zhǎng)處，在260nm處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質(zhì)含量較低

時(shí)對(duì)核酸的紫外測(cè)定影響不大。RNA的260nm與280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的

260nm與280nm吸收的比值則在1.9左右。當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)比值即下降。

三、器材與試劑：

1.器材：

①容量瓶（50毫升）。

②離心管。

③離心機(jī)。

④紫外分光光度計(jì)。

2.試劑：

①相酸筱-過(guò)氯酸沉淀劑［0.25%鋁酸錢-2.5%過(guò)氯酸溶液］:取3.6毫升70%過(guò)氯酸和

0.25克鋁酸鏤溶于96.4毫升蒸儲(chǔ)水中。

②樣品RNA或DNA干粉。

四、操作步驟：

將樣品配制成每毫升含5-50微克核酸的溶液，于紫外分光光度計(jì)上測(cè)定260nm和

280nm吸收值，計(jì)算核酸濃度和兩者吸收比值。

O-D

RNA濃度（微克/毫升）=—~"X稀釋倍數(shù)

0.024xL

DNA濃度（微克/毫升）=0.0260x稀釋倍數(shù)

0.020xL

式中：O.D260為260nm波長(zhǎng)處光密度讀數(shù)；L為比色杯的厚度；0.024為每毫升溶液內(nèi)含

1微克RNA的光密度；0.020為每毫升溶液內(nèi)含1微克DNA鈉鹽時(shí)的光密度。

如果待測(cè)的核酸樣品中含有酸溶性核甘酸或可透析的低聚多核甘酸，則在測(cè)定時(shí)需加

鋁酸鍍-過(guò)氯酸沉淀劑，沉淀除去大分子核酸，測(cè)定上清液260nm處吸收值作為對(duì)照。具

體操作如下：

取兩支小離心管，甲管加入0.5毫升樣品和0.5毫升蒸儲(chǔ)水；乙管加入0.5毫升樣品和

0.5毫升鋁酸銹-過(guò)氯酸沉淀劑，搖勻，在冰浴中放置30分鐘，以3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，

從甲、乙兩管中分別吸取0.4毫升上清液到兩個(gè)50毫升容量瓶?jī)?nèi)，定容到刻度。于紫外分

光光度計(jì)上測(cè)定260nm處吸收值。

五、結(jié)果與討論：

A。匕

RNA（或DNA）濃度（微克/毫升）=x稀釋倍數(shù)

0.024（或0.020）xL

式中：△O.D260為甲管稀釋液在260nm波長(zhǎng)處吸收值減去乙管稀釋液在260nm波長(zhǎng)處吸

收值。

核酸％方測(cè)液中測(cè)得的核酸微克鰲X1。。

待測(cè)液中制品的微克數(shù)

思考題

1.用該法測(cè)定樣品的核酸含量，有何優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)？

2.若樣品中含有蛋白質(zhì)，如何排除干擾？你認(rèn)為最簡(jiǎn)便的方法是什么？

V.核酸的定量測(cè)定（三）一一二苯胺法

一、目的；

學(xué)習(xí)并掌握二苯胺法定量測(cè)定DNA含量的原理與方法。

二'原理：

脫氧核糖核酸中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在

595nm處有最大吸收。DNA在40—400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比。在反

應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)靈敏度。除DNA外，脫氧木糖，阿拉伯糖也有同樣

反應(yīng)。其它多數(shù)糖類，包括核糖在內(nèi)，一般無(wú)此反應(yīng)。

DNA分子中的脫氧核糖基，在酸性溶液中變成3-羥基-Y-酮基戊醛，與二苯胺試劑作

用生成藍(lán)色化合物（Amax=595nm）?？捎帽壬y(cè)定。

H+

DNA（脫氧戊糖基）11.HO—CH2—C—CH2—CH2—CHO

II

二苯胺O

-＞藍(lán)色化合物

三、器材與試劑：

1.器材：

①分析天平。

②恒溫水浴鍋。

③試管。

④吸量管（2毫升和5毫升）。

⑤分光光度計(jì)。

2.試劑：

①DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液（須經(jīng)定磷確定其純度）：取小牛胸腺DNA鈉鹽以5mmol?L-1氫氧

化鈉溶液配成200微克/毫升的溶液。

②樣品待測(cè)液：準(zhǔn)確稱取DNA干燥制品以5mmol?L”氫氧化鈉溶液配成50-200微

克/毫升的溶液。在測(cè)定RNA制品中的DNA含量時(shí)，要求RNA制品的每毫升待測(cè)液中至

少含有20微克DNA,才能進(jìn)行測(cè)定。

③二苯胺試劑：

A液：稱取1克重結(jié)晶二苯胺，溶于100毫升分析純的冰乙酸中，再加入10毫升過(guò)

氯酸（60%以上），混勻貯于棕色瓶中待用。

B液：配制1.6%的乙醛液，臨用前配制。

臨用時(shí)將A液20ml與B液0.1ml混合即得二苯胺試劑。

四、操作步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取干燥試管7支，按下表0—6號(hào)管操作。

2.樣液測(cè)定：取2支試管按下表中7、8兩號(hào)管操作。

管號(hào)

試劑（肅尸012345678

DNA標(biāo)準(zhǔn)液

00.40.81.01.21.62.000

(200ug?ml1)

蒸儲(chǔ)水2.01.61.21.00.80.4000

二苯胺試劑4.04.04.04.04.04.04.04.04.0

DNA待測(cè)液00000002.02.0

搖勻，70匕水浴保溫lh,在595nm處測(cè)吸光度（OD值或A值）

OD595

DNA含量(Ug)080160200240320400

五、結(jié)果與討論:

1.DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:

根據(jù)測(cè)定數(shù)據(jù)，以DNA含量（ug）為橫坐標(biāo)，OD595值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.DNA含量的計(jì)算：

按下式計(jì)算樣品中DNA的百分令量

樣液中測(cè)得的DNA置〃g）

產(chǎn)樣液中所含樣品量（爆）X100

思考題

利用二苯胺法測(cè)定DNA含量時(shí)，若DNA樣品中混有DNA或蛋白質(zhì)、糖類時(shí)，是否會(huì)有干擾？

VI.核酸的定量測(cè)定（四）一一地衣酚（苔黑酚）法

一、目的：

了解并掌握地衣酚法測(cè)定RNA含量的基本原理和具體方法。

二'原理：

RNA含量測(cè)定，除可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法測(cè)定。其反應(yīng)原理是:

當(dāng)RNA與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，后者與3,5-二羥基

甲苯（地衣酚orcinol）反應(yīng)，在Fe3+或Cd+催化下，生成鮮綠色復(fù)合物。反應(yīng)產(chǎn)物在670nm

處有最大吸收。RNA濃度在20—250ug?mH范圍內(nèi)，光吸收與RNA濃度成正比。地衣

酚法特異性差，凡戊糖均有此反應(yīng)，DNA和其他雜質(zhì)也能與地衣酚反應(yīng)產(chǎn)生類似顏色。

因此，測(cè)定PNA時(shí)可先測(cè)得DNA含量再計(jì)算RNA含量。

三'器材與試劑：

1.器材：

①分析天平。

②沸水浴鍋。

③試管。

④吸量管。

⑤分光光度計(jì)。

2.試劑

①RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液（須經(jīng)定磷確定其純度）：取酵母RNA配成100微克/毫升的溶液。

②樣品待測(cè)液：配成每毫升溶液含RNA干燥制品50-100微克。

③地衣酚試劑：先配0.1%三氯化鐵的濃鹽酸（分析純）溶液，實(shí)驗(yàn)前用此溶液作為溶

劑配成0.1%地衣酚溶液。

四、操作步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取12支干凈烘干試管，按下表編號(hào)及加入試劑。平等作兩份。加畢置沸水浴加熱

25min,取出冷卻，以零號(hào)管作對(duì)照，于670nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值。取兩管平均值，以

RNA濃度為橫坐標(biāo)，光吸收為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Jj組(X2)

012345

試劑

標(biāo)準(zhǔn)RNA溶液/ml00.40.81.21.62.0

蒸儲(chǔ)水/ml2.01.61.20.80.40.0

地衣酚-Cu2+/ml2.02.02.02.02.02.0

2.樣品的測(cè)定

取兩支試管，各加入2.0ml樣品液，再加2.0ml地衣酚-Ci?+試劑。如前述進(jìn)行測(cè)定。

五、結(jié)果與討論：

1.繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.RNA含量的計(jì)算

根據(jù)測(cè)得的光吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)該光吸收的RNA含量，按下式計(jì)算出

制品中RNA的百分含量：

=待測(cè)液中測(cè)得的含量(〃g/4)ion

產(chǎn)待測(cè)液中制品的含量(爆/血)一

注意事項(xiàng)

(1)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，應(yīng)先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白質(zhì)后再測(cè)定。

(2)本法特異性較差，凡屬戊糖均有反應(yīng)。微量DNA無(wú)影響，較多DNA存在時(shí)，

亦有干擾作用。如在試劑中加入適量CuCl2-2H2O可減少DNA的干擾，甚至某些已糖在

持續(xù)加熱后生成的羥甲基糖醛也能與地衣酚反應(yīng)，產(chǎn)生顯色復(fù)合物。此外，利用RNA和

DNA顯色復(fù)合物的最大光吸收不同，且在不同時(shí)間顯示最大色度加以區(qū)分。反應(yīng)2min后,

DNA在600nm呈現(xiàn)最大光吸收，而RNA則在反應(yīng)15min后，在670nm下呈現(xiàn)最大光吸

收。

思考題

利用本法測(cè)定RNA的含量，靈敏度較高，但特異性較差，有哪些干擾因素？如何排除干擾？

實(shí)驗(yàn)十四離子交換柱層析分離核昔酸

一、目的：

學(xué)習(xí)離子交換柱層析法分離核昔酸的原理及方法。

二'原理：

離子交換作用一般指在固相和液相之間發(fā)生的可逆的離子交換反應(yīng)，它可用于分離各

種可解離的物質(zhì)。通常離子交換劑是在一種高分子的不溶性母體上引入若干活性基團(tuán)。這

樣人工會(huì)成的離子交換劑具有各種各樣的性能。作為不溶性母體的離分子有樹脂、纖維素、

葡聚糖、瓊脂糖或無(wú)機(jī)聚合物等，引入的活性基團(tuán)可以是酸性基團(tuán)，如強(qiáng)酸型的含有磺酸

基（-S03H）、中強(qiáng)酸型的含磷酸基（一PO3H2）、亞磷酸基（一PChH）、弱酸型的含有竣

基（一COOH）或酚竣基（-0H）等。也可以是堿性基團(tuán)，如強(qiáng)堿型的含季較［-N+（CH3）3］、

弱堿型的含叔胺［―N（CH3）2］、仲胺（一NHC%）、伯胺（一NH2）等。

在一定條件下，離子交換樹脂吸附的物質(zhì)數(shù)量和在溶液中的物質(zhì)數(shù)量達(dá)到平衡時(shí)，兩

者數(shù)量之比叫分配系數(shù)（平衡常數(shù)）。理想的情況是洗脫曲線和分配系數(shù)相符合，待分離

的各種物質(zhì)的分配系數(shù)，應(yīng)有足夠的差別，以K”表示分配系數(shù)：

式中M和M分別代表單位重量離子交換樹脂和單位體積溶液中溶質(zhì)的摩爾數(shù)。當(dāng)有4、

B兩種溶質(zhì)進(jìn)行離子交換柱層析時(shí)，吸附在離子交換樹脂上的溶質(zhì)為高濃度的競(jìng)爭(zhēng)性離子

所交換并被洗脫下來(lái)。溶質(zhì)的遷移速度與分配系數(shù)成反比，因此由原點(diǎn)到A、8兩種物質(zhì)

四種及枝根相對(duì)分正系數(shù)與pH的美索（陰炸

波峰間距離的比值決定于它們分配系數(shù)的比值。各波峰的幅度和形狀由柱長(zhǎng)及其他因素

（如交換樹脂顆粒的大小形狀、交聯(lián)度、流速等）所決定。溶質(zhì)的分配系數(shù)不僅與其電荷

有關(guān)，也受到它與離子交換樹脂的非極性親和力以及兩者之間的空間關(guān)系等因素的影響。

在一定條件下，離子交換樹脂對(duì)不同單核甘酸的吸附能力是不同的，因此選擇適當(dāng)類

型的離子交換樹脂，控制吸附及洗脫的條件便可分離各種單核甘酸。

為了增加單核甘酸在離子交換樹脂上的吸附能力，需要：（1）控制條件，使單核甘酸

帶上大量相應(yīng)的電荷。這主要是通過(guò)調(diào)節(jié)pH值，使單核甘酸的一些可解離基團(tuán)（磷酸基、

氨基、烯醇基）解離，四種單核甘酸相對(duì)分配系數(shù)與pH的關(guān)系如圖14-1,（2）減少上柱

溶液中除單核甘酸外的其它離子的強(qiáng)度。洗脫時(shí)則相反：使被吸附的單核昔酸的相應(yīng)電荷

降低；增加洗脫液中競(jìng)爭(zhēng)性的離子的強(qiáng)度，必要時(shí)提高溫度使離子交換樹脂對(duì)單核甘酸的

非極性吸引作用減弱。

RNA可被堿水解成2'-或3'-核甘酸?？衫藐?yáng)離子交換樹脂（聚苯乙烯一二乙烯

苯，磺酸型）或陰離子交換樹脂（聚苯乙烯一二乙烯苯，季鏤堿型）分離單核甘酸。本實(shí)

驗(yàn)利用強(qiáng)堿型陰離子交換樹指（強(qiáng)堿型201X8、強(qiáng)堿型201X7、國(guó)產(chǎn)717、Dowexl、Amberlite

IRA-400或ZerolitFF等）將各類核甘酸分開，測(cè)定核甘酸的紫外吸收光譜的比值：

0.D250/O.D260、0.D280/O.D260、0.D290/O.D260對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)比值（表14-1）,可以確定

其為何種核甘酸，同時(shí)也能算出RNA中核昔酸的相對(duì)摩爾比。

三'試劑及器材：

1.試劑：

①RNA（酵母RNA,商品）

②強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂201X8（聚苯乙烯一二乙烯苯、三甲胺季筱堿型，全交換量

大于3毫摩爾/克干樹脂，100—200目）：用水浸泡并利用浮選法除去細(xì)小顆粒，使用時(shí)先

用0.5mol-1/氫氧化鈉溶液浸泡1小時(shí)，以除去堿溶性雜質(zhì)，然后用無(wú)離子水洗至中性。

再用1N鹽酸浸泡半小時(shí)，除去酸溶性雜質(zhì)，再用無(wú)離子水洗至中性，然后用lmol?L"

甲酸鈉溶液浸泡，使樹脂轉(zhuǎn)變成甲酸型。將樹脂裝入柱內(nèi)，繼續(xù)用甲酸鈉溶液

洗，直到流出液中不含氯離子（用1%硝酸銀溶液檢查）.最后用ImokU甲酸洗，直到

260nm處光密度值低于0.020,并用蒸儲(chǔ)水洗至接近中性，即可使用（裝置見(jiàn)圖14一2）。

@lmol?L“甲酸:取21.4毫升88%甲酸定容至500毫升。

@lmol-L-1甲酸鈉溶液：稱34.15克甲酸鈉用水溶解定容至500毫升。

@0.02mol?1/甲酸:取10毫升Imol?L」甲酸定容至500毫升。

(§)0.15mol?L"甲酸：取75毫升Imol?L-1甲酸定容至500毫升。

?0.01mol-L-1甲酸一0.05mol?L“甲酸鈉溶液(pH4.44)：取5毫升Imol?L-1甲酸、25

毫升Imol-L"甲酸鈉溶液定容至500毫升。

毫升Imol?L"甲酸鈉溶液定容至500亳升.

O,P

fAHCOOH-I—n-一LO.OIMHCOOH|-0.10MHCOOH_

4—0.02MHCUUH—|0.15MHCOOH—[—0,05MHCOON，-j^(M0MHCOON■一

n

12j*

CMPAMpjlUMPGMP

1.0

?O.lmol?L-1甲酸一O.lmol?L-1甲酸鈉溶液（pH3.74）：取50毫升Imol?L-1甲酸、

50毫升Imol-L-1甲酸鈉溶液定容至500毫升。

@0.3mol?L1氫氧化鉀溶液：取1.68克氫氧化鉀用水溶解定容至100毫升。

⑩2moi?L-1過(guò)氯酸：取17毫升70—72%過(guò)氯酸定容至100毫升。

?Imol,L-1鹽酸。

00.5mol?L-1氫氧化鈉溶液。

2.器材：

①玻璃柱（內(nèi)徑1.1厘米、高20厘米）。

②下口瓶。

③部份收集器。

④紫外分光光度計(jì)。

⑤紫外檢測(cè)儀。

⑥恒溫水浴鍋。

四、操作步驟：

1.樣品處理：取20毫克酵母RNA,溶于2毫升0.3mol氫氧化鉀溶液中，于37℃

水解20小時(shí)，RNA在堿作用下水解成單核甘酸，水解完成后，用2moi?U過(guò)氯酸溶液

高至pH2以下，以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液，用2mol?L」氫氧化鈉溶液調(diào)至

pH8,并用紫外分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)得含量后待用。

2.離子交換柱的安裝：取內(nèi)徑1.1—1.2厘米、高20厘米的玻璃管柱。下端橡皮塞中

央插入一玻璃滴管供收集流出液，橡皮塞上蓋以尼龍網(wǎng)和薄絹以防止離子交換樹脂流出9

見(jiàn)圖14-2）,

將處理好的強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂懸浮液一次倒入玻璃柱內(nèi)，使樹脂自由沉降至柱下

部，用一小片圓濾紙蓋在樹脂面上。緩慢放出液體，使液面降至濾紙片下樹脂面上。（注

意在整個(gè)操作過(guò)程中防止液面低于樹脂，當(dāng)液面低于樹脂表面時(shí)空氣將進(jìn)入，在樹脂柱內(nèi)

形成氣泡，妨礙層析結(jié)果）。經(jīng)沉積后離子交換樹脂柱床高7—8厘米。

3.加樣：將RNA水解液小心地用滴管加到離子交換樹脂柱上，待樣品液面降低到濾

紙片內(nèi)時(shí)，用50毫升蒸微水淋洗樹脂柱。堿基、核昔及其他不被陰離子交換樹脂吸附的

雜質(zhì)均被洗出。

4、核甘酸混合物的洗脫：收集蒸儲(chǔ)水洗脫液，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)260nm處光密

度，待洗脫液不含紫外吸收物質(zhì)（光密度值低于0.020）時(shí)，可用甲酸及甲酸鈉溶液進(jìn)行

洗脫。

依次用下列洗脫液分段洗脫，500毫升0.02mol-L-1甲酸；500毫升0.15mol?L」甲

酸;500毫升0.01molL"甲酸-0.05molV甲酸鈉溶液（pH4.44）；最后用500毫升O.lmol<L"

甲酸-O.lmol-L-1甲酸鈉溶液（pH3.74）。用部份收集器收集流出液，控制流速8毫升/10

分，8毫升/管。

5、由層析柱所得各部分洗脫液的分析：以相應(yīng)濃度的甲酸或甲酸鈉溶液作為空白對(duì)

照，用紫外光分光光度計(jì)測(cè)定各管溶液在260nm波長(zhǎng)處光密度值，以洗脫液體積（或管數(shù)）

為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)作圖，分析各部分的波峰位置（見(jiàn)圖14-3）。

五'結(jié)果分析：

根據(jù)各部分核甘酸在不同波長(zhǎng)時(shí)光密度的比值（O.D250/O.D260、O.D280/O.D260>

O.D290/O.D260）,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)比值（見(jiàn)表14-1）以及洗脫時(shí)相對(duì)位置，確定其為何種核昔

酸。由洗脫液的體積和它們?cè)谧贤獠糠值墓饷芏戎?，?jì)算各種核甘酸的含量（各種核甘酸

的摩爾消光系數(shù)見(jiàn)表5-1）,

表14-1部分核甘酸的物理常數(shù)

紫外吸收光譜性質(zhì)

摩爾消光系數(shù)光密度比值

核甘酸分子量

E26OX10-3250/260280/260290/260

27272727

2'14.515.30.850.80.230.150.0380.009

腺喋吟核甘-

2-3「或5」347.23,14.515.30.850.80.230.150.0380.009

磷酸

5，14.515.30.850.80.220.150.030.009

12.312.00.901.150.680.680.480.285

鳥口票嶺核昔-2'

2'-、3'-或5'-363.23,12.312.00.901.150.680.680.480.285

磷酸

5'11.611.71.221.150.680.680.400.28

6.97.750.480.861.830.861.220.26

胞啼咤核昔-2,

2'-、3'-或5'-323.23，6.67.60.460.842.000.931.450.30

磷酸

5，6.37.40.460.842.100.991.550.30

尿嚓噬核昔-324.22'9.99.90.790.850.300.250.030.02

2'?、3'?或5'-

3(9.99.90.740.830.330.250.030.02

磷酸

5'9.99.90.740.730.380.400.030.03

思考題

本實(shí)驗(yàn)用陰離子交換樹脂分離各單核甘酸，若用陽(yáng)離子交換樹脂能否分離各單核甘酸？

實(shí)驗(yàn)十五聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）分離血清蛋白質(zhì)

（核黃素-TEMED聚合系統(tǒng)）

一、目的：

1.學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。

2.掌握聚丙烯酰胺園盤電泳的操作技術(shù)。

3.比較醋酸纖維薄膜電泳與本法分離血清蛋白質(zhì)的效果。

二、原理：

（-）盤狀電泳原理

盤狀電泳是在區(qū)帶電泳原理的基礎(chǔ)上，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠作為支持

物，采用電泳基質(zhì)的不連續(xù)體系（即凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、pH

的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性），使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)

帶（厚度為10-2厘米），然后再進(jìn)行電泳分離。

盤狀電泳名稱來(lái)源即由于此法的原理是依靠基質(zhì)不連續(xù)性（discontinuity）,湊巧分離

出的區(qū)帶也很象圓盤狀（discoidshape）,取“不連續(xù)性”及“圓盤狀”的英文字頭“disc”。

因此，英文名稱為discelectrophoresis,中文直譯為盤狀電泳。

儀器裝置：（見(jiàn)圖15-1）。上下兩個(gè)槽為圓形或方形，其中注入緩沖液。上下槽的緩沖

液中分別有正、負(fù)電極通入。上槽底部有很多小孔，可插入裝有聚丙烯酰胺凝膠的玻璃管。

這里僅以Davis和Orstein（1964）用分析血清蛋白的高pH的不連續(xù)系統(tǒng)為便說(shuō)明其

基本原理。此系統(tǒng)是一個(gè)高pH的堿性系統(tǒng)，或稱陰離子系統(tǒng)，最初用于分析血清蛋白，

但也適用于其他的酸性和中性蛋白。很多細(xì)胞蛋白質(zhì)，或病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在此系統(tǒng)中（pH8

-9）解離成陰離子，向陽(yáng)極移動(dòng)。系統(tǒng)由下列三種不連續(xù)的凝膠組成。即在每支玻璃管

中裝有三層不同的凝膠（見(jiàn)圖15-2）。最上層為樣品膠，中層為濃縮膠（又稱間隔膠或積

層膠），下層為分離膠（又稱電泳膠）。

n

H

u4

iB

O

慎絡(luò)皎（閏代皎或根層皎）uD

sE

s

在我席皆中要存三縣不同的RE!示直用

在盤狀電泳過(guò)程中有三種物理效應(yīng)：①樣品的濃縮效應(yīng)，②凝膠的分子篩效應(yīng)，③一

般電泳分離的電荷效應(yīng)。由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。例如人血清

用紙電泳（PH8.6）可以分成5-7個(gè)成分，而用盤狀電泳也可分成20-30個(gè)條帶清晰的成分

（參看圖15-3）。若采用不連續(xù)的濃度梯度凝膠柱，則可增至62個(gè)條帶。又如人的唾液經(jīng)

盤狀電泳?？煞殖?0多個(gè)蛋白質(zhì)條帶（參看圖15-4）。

下面就盤狀電泳過(guò)程中三種物理效應(yīng)的原理加以說(shuō)明。

1.樣品的濃縮效應(yīng)：由于電泳基質(zhì)的四個(gè)不連續(xù)性，使樣品在電泳開始時(shí)，得以濃

縮，然后再被分離。

（1）凝膠層的不連續(xù)性：三層不同的凝膠，其作用如下：

樣品膠：為大孔凝膠，用光聚合法制備，樣品預(yù)先加在其中再聚合起防止對(duì)流的作用，

避免樣品跑到上面的緩沖液中。

濃縮膠：為大孔凝膠，用光聚合法制備，有防對(duì)流作用。樣品在其中濃縮，并按其遷

移率遞減的順序逐漸在其與分離膠的界面上積聚成薄層。

分離膠：為小孔膠，一般采用化學(xué)聚合法制備。樣品在其中進(jìn)行電泳和分子篩分離。

也有防對(duì)流作用。

蛋白質(zhì)分子在大孔凝膠中受到的阻力小，移動(dòng)速度快。進(jìn)入小孔凝膠時(shí)遇到的阻力大,

速度就減慢了。由于凝膠層的不連續(xù)性，在大孔與小孔凝膠的界面處就會(huì)使樣品濃縮，區(qū)

帶變窄。

（2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性

在電場(chǎng)中如有兩種電荷符號(hào)相同的離子向同一方面泳動(dòng)，其遷移率不同，兩種離子若

能形成界面，則走在前面的離子稱為快離子（又稱先行離子），走在后面的離子稱為慢離

子（又稱隨后離子）。為使樣品達(dá)到濃縮的目的，需在電泳緩沖系統(tǒng)中加入有效遷移率大

小不相同的兩種離子。并使這兩種離子在緩沖系統(tǒng)中組成不連續(xù)的兩相。即在三層凝膠中

加入快離子，在電極緩沖液中加入慢離子。

為了保持溶液的電中性及一定的pH,需加入一種與快、慢離子符號(hào)相反的離子，稱

為緩沖配對(duì)離子。使緩沖配對(duì)離子分布于全部電泳緩沖系統(tǒng)中（即三層凝膠及電極緩沖液

中）。例如分離蛋白質(zhì)樣品時(shí)，通常用cr為快離子，NH2cH2co0-為慢離子，采用三羥甲

基氨基甲烷（簡(jiǎn)稱Tris）作為緩沖配對(duì)離子。

Hx上7爾6工W人0

電泳開始前，如圖15-5A所示，慢離子位于兩個(gè)電極槽中，快離子分布在三層凝膠中，

樣品在樣品凝膠中，緩沖配對(duì)離子位于全部系統(tǒng)中。電泳進(jìn)行中如圖15-5B所示，快離子

與慢離子的界面向下移動(dòng)，由于選擇適當(dāng)?shù)膒H緩沖液，使蛋白質(zhì)樣品的有效遷移率（有

效遷移率=機(jī)。，機(jī)為遷移率，a為解離度）介于快離子與慢離子的界面處，而濃縮成為極

窄的區(qū)帶。它們的有效遷移率按下列次序排列：恨1。4g,<^>恨!。6（0代表氯離子，

P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸負(fù)離子）。樣品若是有顏色的，可以看到樣品在界面處濃縮成

極窄的區(qū)帶。樣品的分離，如圖15-5C所示。當(dāng)樣品達(dá)到濃縮膠與分離膠界面處，離子界

面繼續(xù)前進(jìn)，蛋白質(zhì)被留在后面，然后分成多個(gè)區(qū)帶。

（3）電位梯度的不連續(xù)性

電位梯度的高低與電泳速度的快慢有關(guān)，因?yàn)殡娪舅俣鹊扔陔娢惶荻扰c遷移率的乘

積。遷移率低的離子，在高電位梯度中可以與具有高遷移率而處于低電位梯度的離子具有

相似的速度。在不連續(xù)系統(tǒng)中，電位梯度差異是自動(dòng)形成的。電泳開始后，由于快離子的

遷移率最大，就會(huì)很快超過(guò)蛋白質(zhì)，因此在快離子的后邊形成一個(gè)離子濃度低的區(qū)域即低

電導(dǎo)區(qū)。電導(dǎo)與電位梯度是成反比的：

9

Ij電極緩沖液

E=-

|樣品膠

7高電位梯度Ei

（不連續(xù)性）

式中E為電位梯度，I為電流強(qiáng)度，n為電導(dǎo)率.，濃縮膠

所以低電導(dǎo)區(qū)就有了較高的電位梯度。這種高電低電位梯度Ei

|分離皎

位梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動(dòng)。?

當(dāng)快離子、慢離子和蛋白質(zhì)遷移率和電位梯度的

乘積彼此相等時(shí)，則三種離子移動(dòng)速度相同.在回

快離子和慢離子的移動(dòng)速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立慢離壬快離子蛋白H

不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng)示意圖.

之后，則在快離子和慢離子之間形成一個(gè)穩(wěn)定而03

又不斷向陽(yáng)極移動(dòng)的界面。也就是說(shuō)在高電位梯度區(qū)和低電位梯度區(qū)之間的地方形成一個(gè)

迅速移動(dòng)的界面（圖15-6）o由于蛋白質(zhì)樣品的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間，因

此也就聚集在這個(gè)移動(dòng)的界面附近，被濃縮形成一個(gè)狹小的中間層。

（4）pH的不連續(xù)性

在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續(xù)性，這是為了控制慢離子的解離度，從而控制

其有效遷移率。要求在樣品膠和濃縮膠中，慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率低，以

使樣品夾