基因工程制藥-復習課件

簡答題（1）如何克隆微生物的纖溶酶基因？（2）獲得目的基因的途徑有哪些？（3）限制性內切酶的特點（掌握如何從給出的序列中尋找酶切位點）。（4）PCR的類型及其應用（舉例介紹）。（5）電泳上樣緩沖液的作用有哪些？基因工程制藥-復習（6）如何估算引物的Tm值？（7）基因文庫的特點是什么？（8）藥物蛋白分離純化的技術要求有哪些？（9）包涵體及其形成的原因是什么？基因工程制藥-復習名詞解釋雜交；探針；粘粒；同尾酶（同裂酶）;cDNA文庫；基因工程藥物；鹽析；星活性;基因工程制藥-復習什么是基因工程？

基因工程（geneticengineering）：又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。基因工程制藥-復習教學內容I

基因工程制藥概論(2學時）

II基因工程制藥原理及技術（25學時）

1)基因工程概論（2學時）

2)基因工程的基本技術（6學時）

3)基因工程的工具酶和載體（6學時）基因工程制藥-復習

4)目的基因的獲取方法（4學時）

5)目的基因的表達系統(tǒng)（3學時）

6)基因工程菌株的發(fā)酵（2學時）

7)藥物蛋白的分離純化與質量控制（2學時）III基因工程藥物實例介紹（3學時）IV

練習與復習（2學時）基因工程制藥-復習

基因工程藥物（Geneticengineeringdrugs）指利用基因工程技術研制和生產的藥物，主要包括重組蛋白(多肽)藥物、反義核酸藥物、DNA藥物和基因工程抗體等。重組人生長激素重組人白細胞介素

重組人干擾素

重組人胰島素一、基因工程藥物及其重要性1、定義基因工程制藥-復習2、種類：激素類及神經遞質類藥物細胞因子類藥物酶類藥物與凝血因子基因工程疫苗基因工程制藥-復習基因工程制藥-復習基因工程制藥-復習c)

酶類藥物與凝血因子

酶類藥物

有些酶類對人體疾病有特異性治療價值,其中最被重視的是能預防和治療急性心肌梗死等血栓性疾病的鏈激（SK）,尿激酶(UK),及組織纖溶酶原激活劑(t-PA)?；蚬こ讨扑?復習凝血因子甲型血友病是缺乏Ⅷ因子所致,乙型血友病是缺乏Ⅸ因子所致,在血友病發(fā)病率中甲型占80%。以往治療血友病用凝血因子是從血液中提取的,血友病人有遭受病毒等病毒感染的危險、用重組技術來生產凝血因子將克服血源性產品的缺點。基因工程制藥-復習d)

基因工程疫苗基因缺失活疫苗（減法疫苗）目前這類疫苗中研究最多的是病毒疫苗，如流感病毒。偽狂犬病毒、單純孢疹病毒（HSV）等?；蚬こ袒钶d體疫苗（加法疫苗）

通過表達外源保護性抗原基因，提供免疫保護?；蚬こ讨扑?復習確定對某種疾病有預防和治療作用的蛋白質；獲得該蛋白質對應的基因；將該基因放入可以大量生產的受體細胞中（細菌、酵母菌、動物或動物細胞、植物或植物細胞）；利用受體細胞大規(guī)模生產這些蛋白質，即基因疫苗或藥物。3、基因工程藥物制備的基本過程基因工程制藥-復習目的基因的克??；構建DNA重組體；構建工程菌（或細胞）；目的基因表達；外源基因表達產物的分離分析；除菌、過濾；半成品/成品檢定；包裝。

基本步驟基因工程制藥-復習●傳統(tǒng)制藥存在的問題：

A、材料來源困難或制造技術問題而無法付諸應用；

B、從動物臟器中提取出來，也因造價太高，或因來源困難而供不應求；

C、由于免疫抗原等緣故，使它們在使用上受到限制?！窕蚬こ碳夹g的特點：

能夠十分方便有效地生產許多以往難以大量獲取的生物活性物質，甚至可以創(chuàng)造出自然界中不存在的全新物質。4、基因工程制藥的重要性基因工程制藥-復習

治療侏儒癥的唯一方法，是向人體注射生長激素。而生長激素的獲得很困難。以前，要獲得生長激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長激素?，F可利用基因工程方法，將人的生長激素基因導入大腸桿菌中，使其生產生長激素。人們從450L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長激素，相當于6萬具尸體的全部產量?；蚬こ趟幤贰L激素基因工程制藥-復習二、基因工程藥物發(fā)展歷程DNA重組技術誕生——1972世界第一個基因工程藥物的誕生：美國Lilly公司的重組胰島素投放市場——19821996年，美國已擁有1300多家專門從事生物技術產品研究開發(fā)和生產的公司，70%從事生物醫(yī)藥開發(fā)；1、國外歷程基因工程制藥-復習Genentech公司1976年，27歲的風險投資人RobertSwanson與UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共飲了幾杯啤酒，討論了基因工程技術的商業(yè)前景。討論結束時，他們決定建立一個公司，并取名為Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一個基因工程公司在學術界和商業(yè)界的滿腹懷疑中誕生了！基因工程制藥-復習Genentech的驕人業(yè)績1976Genentech創(chuàng)立1977首次在微生物里生產了人蛋白生長激素抑制素1978克隆了人胰島素基因1979克隆了人生長激素素基因1980公司上市，募集$35million1982第一個基因重組藥（人胰島素）上市（轉讓給Lilly公司）1984第一個VIII因子，轉讓給CutterBiological1985第一個自己生產的產品（人生長激素）1987生產組織纖溶酶原激活劑（tPA）1990生產interferon

1

2009瑞士Roche醫(yī)藥公司并購基因工程制藥-復習2.我國基因工程藥物的發(fā)展歷程20世紀70年代初開始將DNA重組技術應用到醫(yī)學上。第一個批準的我國生產的基因工程藥物——重組人干擾素ɑ1b(RhuIFNɑ1b),1989年開始申報，1993年批準試生產，也是唯一的獨創(chuàng)的一類新藥?；蚬こ讨扑?復習基因工程藥物研發(fā)事例

—以胰島素為例基因工程制藥-復習糖尿?。禾悄虿∈莻€歷史悠久的慢性代謝性疾病，有文字記載的歷史已有上千年。但對糖尿病病因的了解和治療上有實質上的進展還不到一百年?；蚬こ讨扑?復習胰島素的研發(fā)史

自18世紀至今，在諸多研究者不斷進取的努力下，胰島素的研究經歷了五個階段：

發(fā)現胰島素

得到胰島素

了解胰島素

合成胰島素

改造胰島素基因工程制藥-復習1788年ThomasCanley(英)—證實胰腺損傷可導致糖尿病1869年Langerhans(德)

—發(fā)現胰腺內具有分泌功能的細胞團1889-1893年Vonmering和Minkowski(德)—證實胰腺細胞團產生降血糖物質1893年EdouardLaguesse(法)—將胰腺細胞團命名為胰島1909年JeandeMeyer(比利時)—將胰島分泌的降糖物質命名為胰島素1.發(fā)現胰島素基因工程制藥-復習2.得到胰島素1921年

——從狗的胰臟提取了胰島素并用于臨床JamesBCollip(化學家)FrederickG.Banting(醫(yī)生)

獲1923年諾貝爾醫(yī)學獎ChariesHBest(學生助理)J.J.RMacleod(生理學家)獲1923年諾貝爾生理學獎為紀念四位科學家為糖尿病治療做出的杰出貢獻將班?。˙anting）醫(yī)生的生日（11月14日）定為世界糖尿病日基因工程制藥-復習3.了解胰島素1955年——

FrederickSanger(英國)

——

闡明牛胰島素的氨基酸排列順序獲得1958年諾貝爾化學獎基因工程制藥-復習1965年王應睞，鄒承魯，龔岳亭等

(中)KatsoyannisPG(美)Meienhorer(德)

——

人工合成牛胰島素1967年DonaldF.Steiner(美)

——

發(fā)現胰島素原1969年DorothyHodgkin(英)

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確定胰島素氨基酸排列的三維空間結構1971年PierreFreychet(美)

——

確認胰島素受體基因工程制藥-復習

1958年，由中科院上海生物化學所、有機化學所和北京大學聯(lián)合進行人工合成胰島素研究，1965年獲得人工合成牛胰島素。牛胰島素晶體結構模型我國科學家與諾貝爾獎擦肩而過基因工程制藥-復習RosalynYalow(andSolomonBerson)（美國）1959年開始用放射免疫方法測定血液中胰島素含量1977年，獲諾貝爾生理學或醫(yī)學獎

基因工程制藥-復習4.合成胰島素1979年Ullrich和Itakura

——

闡明了胰島素質粒的分子序列1979-1981年Goeddel和Chance

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開始用DNA技術生物合成人胰島素1981年–今

——

基因合成重組人胰島素系列制劑基因工程制藥-復習20世紀末，人胰島素類似物研制成功！5.改造胰島素胰島素的蛋白質空間結構對維持其生物活性有很重要的意義，人工合成的胰島素制劑受此影響在皮下注射后需有一定的解離時間才能發(fā)揮效力，故治療時需提前20-30分鐘注射胰島素。糖尿病人需要更接近生理狀態(tài)、使用方便的胰島素制劑。利用基因重組技術，修飾胰島素的氨基酸組合：基因工程制藥-復習三、基因工程制藥的現狀與發(fā)展前景基因工程制藥-復習1.國內外研究現狀國外現狀上市藥類種類多，幅面廣；研發(fā)機制成熟；投資規(guī)模大，抗風險能力強；利潤大，投資回報率高。基因工程制藥-復習國內現狀藥品生產多以仿制為主,自主開發(fā)產品少

1989年,我國科學家成功研制出具有我國自主知識產權的基因工程一類新藥α1b干擾素,成為我國批準生產的第一個基因工程藥物,也是到目前為止惟一一個由我國自主研制成功的擁有自主知識產權的基因工程一類新藥?；蚬こ讨扑?復習同種產品生產廠家過多新藥研發(fā)創(chuàng)新的體制尚未形成醫(yī)藥市場混亂基因工程制藥-復習

我國研發(fā)和生產基因工程藥物都有較大的發(fā)展?jié)摿?，基因工程藥物的市場需求量巨大，以重組人干擾素為例，其治療的主要適應癥患者，目前我國乙肝病毒攜帶者超過1.2億人，乙肝患者有3000萬人，丙肝患者有1000萬人，結核患者超過450萬人，另外，居民高血壓、糖尿病、惡性腫瘤和心腦血管疾病的發(fā)病率不斷增加，對新生物醫(yī)藥的需求非常迫切;2、我國基因工程藥物市場前景廣闊，主要體現：一、從市場容量和產業(yè)利潤來看基因工程制藥-復習2009年末，我國重組人干擾素的生產企業(yè)僅有20多家，國產重組人生長激素生產企業(yè)也僅有5家；“十二五”863計劃首批生物醫(yī)藥和基因工程項目的正式啟動，標志著我國生物醫(yī)藥和基因工程行業(yè)將迎來新一輪的發(fā)展契機，我國基因工程藥物市場存在較大的發(fā)展空間。二、從市場格局來看基因工程制藥-復習

據估算，我國生物制藥的總體產業(yè)規(guī)模僅為80億元上下(具體為血液制品30億元、診斷試劑5億元、生物基因藥物15億元、生化制藥30億元)。三、從產業(yè)規(guī)模來看基因工程制藥-復習

基因工程制藥原理及技術第一章基因工程概論第二章基因工程的基本技術第三章基因工程的工具酶和載體第四章制藥基因的獲取方法第五章制藥基因的表達系統(tǒng)第六章基因工程菌株的發(fā)酵第七章藥物蛋白的分離純化與質量控制基因工程制藥-復習是指將重組對象的目的基因插入病毒,質?；蚱渌d體系統(tǒng)中，拼接后轉入新的宿主細胞，構建成工程菌（或細胞），實現遺傳物質的重新組合，并使目的基因在工程菌內進行復制和表達。一、基因工程的定義第一章基因工程概論基因工程制藥-復習有關術語解釋：DNA嵌合體（DNAchimera）：內、外源DNA插入載體分子所形成的雜合分子（嵌合DNA)。重組（recombination）：構建DNA嵌合體分子的過程。基因工程制藥-復習克隆(Clone)

從一個共同祖先無性繁殖下來的一群同一DNA分子,細胞或個體所組成的特殊的生命群體?？寺?Cloning)

指上述的過程。基因工程制藥-復習基因工程的主要研究內容:獲得具有遺傳信息的目的基因;選擇基因載體獲得重組DNA;將重組DNA分子導入宿主細胞;鑒定帶有目的基因的克隆;目的基因的擴增及獲得目的產物。基因工程制藥-復習基因克隆的核心:DNA體外重組(Recombination):人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。2.DNA的擴增(Amplification)

?；蚬こ讨扑?復習基因克隆示意圖基因工程制藥-復習基因工程大事記1973，Cohen第一例成功的克隆實驗；1978，Genetech公司，人胰島素，世界上第一種基因工程蛋白藥物；1982，第一個基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準使用；1985，第一批轉基因家畜（兔、豬和羊），轉基因魚；基因工程制藥-復習1993，基因工程西紅柿在美國上市;1997，英國羅斯林研究所，多莉羊;1999.9，中國獲準加入人類基因組計劃，負責測定人類基因組全部序列的1%;2000.6.26，科學家公布人類基因組工作草圖;2001.2.11，公布人類基因組基本信息?；蚬こ讨扑?復習基因工程蛋白質工程酶工程細胞工程生物工程包括：基因工程制藥-復習自然界的基因轉移和重組基因重組(geneticrecombination)——整段DNA在細胞內或細胞間,甚至不同物種間進行交換,并能在新的位置上復制,轉錄和翻譯?；蚬こ套匀唤绲幕蜣D移和重組無目的有目的基因工程制藥-復習接合作用(conjugation)

質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一個細胞（細菌)。轉導作用(transduction)

由噬菌體將一個細胞的基因傳遞給另一細胞的過程,其具體含義是指一個細胞的DNA或RNA通過病毒載體的感染轉移到另一個細胞中。轉化作用(transformation)

通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型的過程?；蚬こ讨扑?復習二、基因的基本概念基因：

DNA分子中含有特定遺傳信息的核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位。合成有功能的蛋白質多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）?；蚬こ讨扑?復習編碼蛋白質肽鏈或RNA的核酸序列；保證轉錄所必需的調控序列；5′非翻譯序列；內含子；3′非翻譯序列等所有的核酸序列。基因包含：基因組：攜帶生物體全部遺傳信息的核酸量。基因工程制藥-復習基因工程制藥-復習３．基因的重疊與可變性１．基因及其產物的共線性一個基因的核苷酸序列與其產物的氨基酸序列一一對應２．基因及其產物的非共線性interruptedgene,intron基因工程制藥-復習轉錄：在細胞核內，以DNA的一條鏈為模板，按照堿基互補配對的原則合成RNA的過程。基因控制蛋白質的合成基因工程制藥-復習AG

TAC

AA

A

TUCAUGAUUAmRNA

細胞質

細胞核

核孔DNAmRNA在細胞核中合成基因工程制藥-復習AG

TAC

AA

A

TUCAUGAUUAmRNA

細胞質

細胞核mRNA通過核孔進入細胞質基因工程制藥-復習UCAUGAUUAmRNA

密碼子

密碼子

密碼子密碼子密碼子：mRNA上決定氨基酸的三個相鄰的堿基基因工程制藥-復習AAU

亮氨酸ACU

天門冬氨酸AUG

異亮氨酸

反密碼子基因工程制藥-復習

翻譯:

在細胞質中,以mRNA為模板,合成具有一定氨基酸順序的蛋白質的過程?；蚬こ讨扑?復習UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天門冬酰氨

tRNA上的反密碼子與mRNA上的密碼子互補配對基因工程制藥-復習UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天門冬酰氨AUG

異亮氨酸

tRNA將氨基酸轉運到mRNA上的相應位置基因工程制藥-復習UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天門冬酰氨AUG

異亮氨酸

兩個氨基酸分子縮合縮合基因工程制藥-復習UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天門冬酰氨AUG

異亮氨酸

核糖體隨著

mRNA滑動，另一個

tRNA上的堿基與mRNA上的密碼子配對。

基因工程制藥-復習UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天門冬酰氨AUG

異亮氨酸

一個個氨基酸分子縮合成鏈狀結構基因工程制藥-復習UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天門冬酰氨AUG

異亮氨酸

tRNA離開，再去轉運新的氨基酸基因工程制藥-復習UCAUGAUUAAAUACUAUG

亮氨酸

天門冬酰氨

異亮氨酸以mRNA為模板形成了有一定氨基酸順序的蛋白質基因工程制藥-復習蛋白質合成過程示意圖基因工程制藥-復習基因工程過程示意圖①從細胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質粒④DNA重組⑤用重組質粒轉化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因

藥物基因:人的胰島素基因胰島素基因工程制藥-復習轉基因植物獲得新的性狀基因工程的應用現狀基因工程制藥-復習轉基因動物作為生物發(fā)生器基因工程制藥-復習轉基因動物和植物

轉基因動物首先在小鼠獲得成功?，F在轉基因動物技術已用于牛、羊，使得從牛/羊奶中可以生產蛋白質藥物。稱為“乳腺反應器”工程。

轉基因植物亦已在大田中廣為播種?；蚬こ讨扑?復習

美國GE公司構造成功具有巨大烴類分解能力的工程菌，并獲專利，用于清除石油污染?；蚬こ叹诃h(huán)境工程中應用基因工程制藥-復習基因本身也是一個產業(yè)Rockfeller大學將人肥胖基因出售0.2億美元（1995年3月）Amgen公司將FKBP神經免疫因子配體轉讓達3.29億美元（1997年）Millennium公司以4.65億美元向Bayer公司轉讓225種基因的開發(fā)權（1998年9月）基因工程制藥-復習什么是PCR?多聚酶鏈式反應(polymerasechainreaction)簡稱ＰＣＲ技術，是利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶在體外快速擴增(復制)某一特定DNA片段的方法。

PCR技術操作簡便，可在短時間獲得數百萬個特異的目的ＤＮＡ序列的拷貝。80年代中期PCR技術的發(fā)明，引起了生物技術發(fā)展的一次革命，目前已被廣泛應用于與分子生物學相關的各個領域。基因工程制藥-復習一、PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長基因工程制藥-復習ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物基因工程制藥-復習ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶基因工程制藥-復習94℃變性50-65℃退火XX℃延伸基因工程制藥-復習Taq

DNA聚合酶來自水生棲熱菌Thermusaquaticus良好的耐熱性

在70～80℃具有最高聚合活性在95℃仍然可以有50%活性其它特性:Mg2+依賴性無校正功能基因工程制藥-復習72℃94℃55℃PCR循環(huán)基因工程制藥-復習二、PCR的原理與操作（一）原理基因工程制藥-復習模板DNA95℃變性(denaturaion)基因工程制藥-復習50℃引物1引物2DNA引物退火(annealing)基因工程制藥-復習引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶延伸(extension)基因工程制藥-復習第1輪結束95℃第2輪開始基因工程制藥-復習PCR過程1.模板變性(Denaturation)

雙鏈DNA模板在95

C變性為單鏈DNA。2.引物退火(Annealing)

引物與單鏈DNA互補并退火。3.延伸反應(Extention)

耐熱的DNA聚合酶催化子鏈的合成?；蚬こ讨扑?復習基因工程制藥-復習（二）PCR的基本操作1、PCR反應五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）

dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）基因工程制藥-復習1）長度：18-24個核苷酸；2）G＋C％：40-60％；2、引物設計的原則Tm=69.3+0.41(G+C%)引物長度為18-24個堿基：

Tm(

C)＝4(G＋C)＋2(A＋T)5’ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG3’ G＋C＝12；A＋T＝8 Tm＝4X12＋2X8＝64

C基因工程制藥-復習3）四種堿基隨機分布；4）引物自身不應存在互補序列，以防形成發(fā)夾結構；5’GTTGACTTGATAT3’GAACTCT5’GTTGACTTGATATTCTCAAG3’

引物的自身互補序列形成發(fā)夾結構2、引物設計的原則基因工程制藥-復習5’ACCGGTAGCCACGAATTCGT3’

3’TGCTTAAGCACCGATGGCCA5’5’ACCGGTAGCCACGAATTCGT3’

兩個引物分子形成二聚體5）引物之間不應存在互補序列，以防形成二聚體(dimer)；引物設計軟件：Primer5,Oligo2、引物設計的原則基因工程制藥-復習6）引物的5’端可添加限制性內切酶識別位點，便于PCR產物的定向克隆。5’CATATG3’3’TTCGAA5’NdeIHindIII2、引物設計的原則基因工程制藥-復習3’5’3’5’限制性內切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標記引物模板基因工程制藥-復習（1）反應成分1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。3、PCR反應條件基因工程制藥-復習

2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導致模板與引物錯配,反應特異性下降。

3）TaqDNA聚合酶

0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產量?；蚬こ讨扑?復習

4）dNTP

dNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應相等濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產量

dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。基因工程制藥-復習5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑，0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系；

Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產量下降；Mg2+過高影響反應特異性；

Mg2+可與負離子結合，所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。基因工程制藥-復習（6）緩沖液（Buffer）10mmol/LTrisHCl調節(jié)pH，使Taq酶活性作用環(huán)境維持在扁堿性（pH8.3,室溫）

50mmol/LKCL有利于引物的退火，但過高會抑制Taq酶活性

0.01%BSA，保護酶不變性失活?；蚬こ讨扑?復習1）變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

95oC，20-30秒2）退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合;降低溫度可增加反應的靈敏性。2）循環(huán)參數基因工程制藥-復習3）延伸

70-75oC，延伸時間由擴增片段長度決定。4）循環(huán)次數主要取決于模版DNA的濃度；一般為25-35次；次數過多：擴增效率降低，錯誤摻入率增加?；蚬こ讨扑?復習PCR反應曲線基因工程制藥-復習抑制PCR反應的物質基因工程制藥-復習DNA聚合酶來源PCR產物末端3’

5’外切酶活性(校正)TaqDNA聚合酶Thermusaquaticus3’A無PfxDNA聚合酶Thermococcussp.KOD平端有PfuDNA聚合酶Pyrococcufuriosus平端有PwoDNA聚合酶Pyrococcuwoesei平端有VentDNA聚合酶Thermococcuslitoralis平端有DeepVentDNA聚合酶Pyrococcusp.GB-D平端有UITmaDNA聚合酶Thermotogamaritima平端有TthDNA聚合酶Thermusthermophilus3’A無常用的熱穩(wěn)定DNA聚合酶基因工程制藥-復習（三）PCR的特點特異性強靈敏度高

PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平。簡便、快速

PCR反應一般在2～4小時完成擴增反應。對標本的純度要求低。擴增產物一般用電泳分析，無放射性污染、易推廣?；蚬こ讨扑?復習待擴增片段：1000bp引物Tm＝55℃DNA模板變性: 94℃,5分鐘;PCR循環(huán)(30次): 94℃,30秒;

50℃,30秒; 72℃,1分鐘;最終延伸: 72℃,7-10分鐘PCR反應條件的設定基因工程制藥-復習PCR產物的檢測-瓊脂糖凝膠電泳PCR產物PCR產物基因工程制藥-復習三、PCR常見問題1、無擴增產物（假陰性）2、非特異性擴增3、拖尾4、假陽性基因工程制藥-復習1、無擴增產物模板:含有抑制物，含量低；Buffer對樣品不合適；引物設計不當或者發(fā)生降解；反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短。

原因對策純化模板或者加大模板的用量；更換Buffer或調整濃度；重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物；降低退火溫度、延長延伸時間?，F象：正對照有條帶，而樣品則無?；蚬こ讨扑?復習2、非特異性擴增

現象：PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶?；蚬こ讨扑?復習引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數過多

原因對策重新設計引物或者使用巢式PCR適當降低模板或引物濃度適當減少酶量降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數非特異性擴增基因工程制藥-復習3、拖尾

現象：產物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。M12基因工程制藥-復習模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數過多

原因對策純化模板更換Buffer適當提高退火溫度適量用酶適當降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數拖尾基因工程制藥-復習4、假陽性原因：靶序列或擴增產物的交叉污染

現象：空白對照出現目的擴增產物。對策：

1）操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；

2）除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。

3）各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。

基因工程制藥-復習（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設立對照陽性對照：陽性模板陰性對照：陰性模板試劑對照：除模板外的所有組分其他注意的事項基因工程制藥-復習四、PCR的類型及應用重組PCR不對稱PCR反向PCR多重PCR原位PCRRT－PCR巢式PCR遞減PCR熱啟動PCR實時定量PCR一、PCR的類型基因工程制藥-復習1、巢式PCR用第2對引物來驗證用第1對引物所擴增的PCR產物基因工程制藥-復習PCR環(huán)化2、反向PCR基因工程制藥-復習3、熱啟動PCR（HotStartPCR）

熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR

儀達到變性溫度；

現在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，該酶具有熱啟動的性能，使用簡單方便，適合于高通量應用；

熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。基因工程制藥-復習

逆

(反)轉錄酶以mRNA為模板合成第1條

cDNA

鏈，然后通過

PCR反應擴增出許多cDNA分子拷貝。

RT-PCR

是擴增

mRNA

的快速及靈敏的方法。1.檢測某一基因在轉錄水平的表達2.克隆特異的cDNA4、RT-PCR基因工程制藥-復習5’3’AAAAA5’3’5’3’3’5’5’3’RT-PCR原理mRNA1stcDNA逆轉錄酶、下游引物、dNTPsDNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs5’5’3’3’特異PCR產物5’5’3’3’經30個循環(huán)，產生230個分子拷貝5’5’3’3’5’5’3’基因工程制藥-復習一步法RT-PCRRT反應與PCR反應在同一個試管中進行。兩步法RT-PCRRT反應與PCR反應在不同的試管中進行。下游引物特異性引物

Oligo(dT)基因工程制藥-復習-actinGAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)18SrRNA用作內參的管家基因基因工程制藥-復習5、RealTimeQuantitativePCR,qRT-PCR

在PCR反應體系中加入熒光報告基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測PCR反應進程，對擴增的PCR產物進行定量分析的方法。

具有高度敏感性：用于檢測微量的DNA或RNA樣品；

檢測每一次PCR循環(huán)中產物的積累；

擴增反應結束后不需要對PCR產物進行電泳。基因工程制藥-復習R=Reporter(熒光報告染料)Q=Quencher(淬滅物)TaqMan探針當TaqMan探針完整時，熒光報告染料發(fā)射的熒光被淬滅物所淬滅。在延伸反應中，熒光報告染料被DNA聚合酶切除后與淬滅物分離，其熒光信號被檢測。

基因工程制藥-復習QuantiProbe不與DNA分子結合時，熒光報告染料發(fā)射的熒光被淬滅物所淬滅。當引物退火時，QuantiProbe與單鏈DNA分子雜交，熒光報告染料與淬滅物分離，其信號被檢測。在延伸反應時，QuantiProbe被置換，熒光報告染料發(fā)射的熒光又被淬滅物淬滅。QuantiProbe不規(guī)則結構的探針基因工程制藥-復習MolecularBeacons發(fā)夾結構的探針基因工程制藥-復習研究：基因克隆，DNA測序，分析突變診斷：細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程：遺傳圖譜的構建，DNA測序，表達圖譜法醫(yī)：犯罪現場標本分析腫瘤：各種腫瘤檢測其他……二、PCR的應用基因工程制藥-復習用于克隆PCR產物的載體lacZPCR產物dA平端克隆載體:用于克隆平端PCR產物dAdTdTlacZ載體lacZPCR產物

lacZ載體TA克隆載體:用于克隆3’端攜帶A的PCR產物基因工程制藥-復習PCR定向突變基因1M和2M引物含有突變的堿基使用TouchdownPCR便于A和B的退火梯度(Gradient)PCR儀降落PCR(TouchdownPCR)

每隔一個循環(huán)降低1℃反應退火溫度，直至達到“Touchdown”退火溫度。基因工程制藥-復習正常人血紅蛋白亞基鐮刀型貧血病人血紅蛋白亞基鐮刀型貧血病人血紅蛋白亞基編碼基因正常人血紅蛋白亞基編碼基因PCRDdeI酶切瓊脂糖凝膠電泳基因工程制藥-復習變性PCR產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳1.一條染色體上的DNA發(fā)生突變2.正常對照PCR-SSCP基因工程制藥-復習第二章、基因工程的基本技術第一節(jié)核酸的提取與質量測定第二節(jié)PCR技術第三節(jié)核酸的凝膠電泳第四節(jié)核酸雜交技術基因工程制藥-復習核酸按戊糖分為兩大類：脫氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid核糖核酸（RNA）RibonucleicAcid*rRNA（ribosomalRNA）80%*tRNA（transferRNA）15%*mRNA（mesengerRNA）5%核酸的種類基因工程制藥-復習核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過3’，5’-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。

DNA主要儲存遺傳信息。

RNA主要傳遞遺傳信息?；蚬こ讨扑?復習

真核細胞

原核細胞DNA細胞核（95%）：線型雙鏈，一般與組蛋白結合成染色體線粒體、葉綠體（5%）：環(huán)狀雙鏈

線型雙鏈主要集中于核區(qū)質粒DNA：染色體外DNARNA細胞質（75%）線粒體、葉綠體（15%）細胞核（10%）

主要在細胞質核酸的分布基因工程制藥-復習核酸的理化性質RNA的純品都呈白色粉末或結晶；DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物；DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑?；蚬こ讨扑?復習裂解細胞（破細胞壁和細胞膜）—內容物釋放；分離出核酸—去除蛋白質和多糖及雜質；沉淀/吸附DNA,去除RNA；溶解DNA,并保存。2、基因組DNA的提取DNA提取的基本步驟：基因工程制藥-復習結構完整:

保持DNA結構相對完整；純度高:

盡量排除其他大分子的污染（蛋白質、多糖、及RNA等），保證樣品中不含有有機溶劑及高濃度的金屬離子；得率好:

選用合適的方法獲得足夠的樣品。DNA提取一般原則：基因工程制藥-復習機械方法使組織和細胞破碎；加入SDS、CTAB等離子型表面活性劑，溶解細胞膜和核膜蛋白，使細胞膜和核膜破裂；加入酚和氯仿等變性劑，充分振蕩，使蛋白變性;離心去沉淀;加入無水乙醇或異丙醇沉淀DNA；沉淀的DNA溶于TE溶液或超純水中保存?zhèn)溆谩?.1植物基因組DNA的提取材料:

植物各個部位都可用作總DNA抽提的材料，常用的材料一般為植物幼葉。基本步驟：基因工程制藥-復習CTAB法提取植物DNA的原理

(植物DNA提取經典方法）

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物；在低離子強度溶液中，CTAB能沉淀核酸與酸性多聚糖；基因工程制藥-復習高離子強度的溶液中(>0.7mol/LNaCl)，CTAB與蛋白質和（非酸性）多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸；通過有機溶劑去除蛋白、多糖、酚類等雜質，加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。

注：CTAB溶液在低于15℃時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于15℃。

基因工程制藥-復習CTAB提取緩沖液（2×）的經典配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入1、Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；

基因工程制藥-復習3、NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解，存在于液相中；4、CTAB溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離；5、β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。基因工程制藥-復習CTAB提取緩沖液（2×）的改進配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。

基因工程制藥-復習CTAB法流程圖

植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌乙醇沉淀DNA溶液基因工程制藥-復習操作步驟:（1）組織粉碎取少量樣品（0.5-2g)，吸干水分，加液氮冷凍后迅速研磨成細粉末。（2）細胞裂解取適量CTAB提取緩沖液懸浮樣品,移入離心管中，65oC溫育1-2h，間歇震蕩。離心（10,000rpm,10min)去沉淀，上清入新管。基因工程制藥-復習（3）純化DNA加入等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液抽提，除去蛋白質等污染。（4）沉淀DNA加入0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA（選擇性加1/10體積的3M醋酸鈉）。溫度：室溫/4℃/-20℃

；時間：10min-過夜。離心（10,000rpm,10min)收集DNA沉淀，室溫晾干。苯酚：強變性25氯仿：弱變性24異戊醇：消泡1基因工程制藥-復習（5）溶解DNA以適當TE溶液重懸DNA，可加入適量用RNaseA以去除RNA。（6）保存DNA4℃/-20℃/-80℃基因工程制藥-復習2.2細菌基因組DNA的提取2.3哺乳動物細胞基因組DNA的提取基因工程制藥-復習基因組DNA提取常見問題分析A)

DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應DNA中含有蛋白、多糖、多酚類物質

——抽提純化、高鹽洗滌DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應

——重新沉淀或進一步晾干DNA中殘留有金屬離子

——重新70%乙醇漂洗基因工程制藥-復習B)DNA降解材料不新鮮或反復凍融未很好抑制內源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染基因工程制藥-復習C)

DNA提取量少實驗材料不佳或量少

——選取新鮮（幼嫩）材料破壁或裂解不充分

——充分研磨、破壁酶、延長裂解時間沉淀不完全

——低溫、延長沉淀時間洗滌使得丟失DNA——小心操作，保留上清液基因工程制藥-復習重點介紹經典的提取方法：堿裂解法（三液法）。3、質粒DNA的提取基因工程制藥-復習

質粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb）的共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。常常編碼一些對宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產生抗生素、限制酶、修飾酶等質粒的復制：嚴緊型復制（1-n個）松弛型復制（20個以上）

基因工程制藥-復習堿裂解法提取質粒的原理在pH12.0~12.6堿性環(huán)境中，大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態(tài)。將pH調至中性并有高鹽存在的條件下，質粒DNA迅速復性，呈可溶狀態(tài)；大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA?；蚬こ讨扑?復習閉合環(huán)狀的質粒DNA，在變性后不會分離，復性快；原理DNA雙鏈變性DNA單鏈復性強堿中性基因工程制藥-復習染色體線性DNA和或有缺口的質粒DNA變性后雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結構，與蛋白質—SDS復合物結合在一起，在離心的時候沉淀下去。變性基因工程制藥-復習質粒提取——堿裂解法原理基因工程制藥-復習質粒提取的思路質粒的特性：共價、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA要去除的物質：蛋白/基因組DNA/脂類/小分子雜質/RNA

三個基本步驟：細菌的生長和質粒的擴增菌體的收集裂解及質粒DNA的分離質粒DNA的純化基因工程制藥-復習SolutionI

：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，（RNaseA）0.2MNaOH，1.0%SDS3M醋酸鉀/2M醋酸（pH4.8)

SolutionII

：SolutionIII

：三種溶液的配方注：現配現用基因工程制藥-復習質粒提取的步驟取1.5ml培養(yǎng)物倒入Eppendorf管中，12000r/min，4℃，30sec，吸去培養(yǎng)液，使細胞沉淀盡可能干燥；將細菌沉淀懸浮于100μl預冷的溶液I中，劇烈振蕩；加200μL溶液II（新鮮配制），蓋緊Eppendorf管，快速顛倒5次，混勻內容物，冰置3-5min;加入150μL溶液III（冰上預冷），蓋緊管口，顛倒數次使混勻，冰上放置3-5min；基因工程制藥-復習12000r/min，離心5min，將上清夜轉至新管中；向上清夜加入2倍體積乙醇，混勻后，室溫放置10min。12000r/min離心5min，去上清，Eppendorf管倒扣于吸水紙上，吸干液體。用1ml70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清夜，室溫干燥；50μLTE緩沖液，使DNA完全溶解，-20℃保存?；蚬こ讨扑?復習質粒DNA提取常見問題分析A)RNA殘留忘記加RNaseA？

I液中RNaseA失效？酶量不夠？基因工程制藥-復習B)

質粒斷裂

II液裂解時間過長？裂解時動作過于劇烈？質粒DNA提取常見問題分析基因工程制藥-復習C)

量少凝膠是否有問題？菌體量少菌體重懸不徹底裂解不完全菌株老化嚴謹型質粒質粒DNA提取常見問題分析基因工程制藥-復習嚴謹型：這些質粒的復制是在寄主細胞嚴格控制之下進行的，與寄主細胞的復制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個細胞中只有一份或幾份拷貝；松馳型：這些質粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下進行的，每個細胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成才會使質?？截悢翟鲋翈浊Х?。如較早的質粒pBR322即屬于松弛型質粒，要經過氯霉素處理才能達到更高拷貝數。基因工程制藥-復習離心柱型質粒DNA提取試劑盒工作原理改進的SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后用低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將DNA洗脫。基因工程制藥-復習4、RNA提取的基本原理與方法RNase是導致RNA降解的最主要物質！RNase的來源樣品試劑多次使用的器具裸露的手說話產生的唾沫空氣RNase非常穩(wěn)定，它在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除后有迅速復性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活?；蚬こ讨扑?復習1)

RNase的特點：抗酸、抗堿,具很廣pH作用范圍;抗高溫嚴寒(0-65℃均具活性）；抗變性劑。2)

解決辦法：

外源RNase：高溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處理幾乎所有溶液和器皿，操作者帶手套。

內源RNase：高溫抽提，強蛋白質變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等。制備RNA的關鍵—防止內外源RNase的作用

基因工程制藥-復習原理：細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的DNA和RNA由于低pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的有機相（DNA）和水相（RNA），從而得以分離；有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。

RNA提取的通用方法—異硫氰酸胍/苯酚法（商品試劑：Trizol)

基因工程制藥-復習總RNA提取——完整性檢測293細胞總RNA28S18S5S

細胞中70-80%的RNA為rRNA，后者又由28S（約4800nt），18S（約1900nt）和5.8S（約120nt）三種組成，所以電泳后應該在UV下看見三條清晰的rRNA帶。核酸長度與結合EB的數量成正比，所以28SrRNA條帶的熒光強度一般比18SrRNA條帶的熒光強度強1.5-2.3倍。如果這兩條rRNA帶不清晰或比例小于此范圍則表示RNA有降解（因為大的RNA被酶降解的可能更大）。電泳檢測基因工程制藥-復習RNA提取常見問題分析A)RNA降解外源RNase的污染裂解液質量裂解液用量不足樣品本身富含RNase環(huán)境溫度過高28S18S5S基因工程制藥-復習B)DNA殘留樣本量過多吸取到中間層及下層試劑解決辦法：

DNA酶（RNasefree）消化，再抽提純化處理。RNA提取常見問題分析基因工程制藥-復習RNA提取常見問題分析C)

電泳帶型異常上樣量超過3μg電壓超過8V/cm電泳緩沖液陳舊均可能導致28S和18S條帶分不開基因工程制藥-復習5、核酸提取過程中其他需要注意的事項基因工程制藥-復習(1）質量檢查酚通常是透明無色的結晶，如果酚結晶呈現粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。(2）安全操作酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應戴手套。5.1如何使用酚基因工程制藥-復習

沉淀是濃縮核酸最常用的方法，其優(yōu)點如下：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質。5.2核酸的沉淀基因工程制藥-復習表1核酸沉淀的鹽類及濃度鹽貯存液濃度（mol/L)終濃度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.85.2.1鹽的選擇基因工程制藥-復習（1）乙醇優(yōu)點：對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實驗。缺點：需要量大。（2）異丙醇優(yōu)點：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。缺點：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去（最后用70％乙醇漂洗數次）。5.2.2有機溶劑的選擇（3）其他基因工程制藥-復習5.2.2沉淀的時間和溫度

一般強調，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0℃冰水（或室溫），10-15min，DNA樣品足可達到實驗要求?；蚬こ讨扑?復習DNA：①DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②長期保存樣品中可加入1滴氯仿。RNA：①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，

-70℃保存;②長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復合物)凍貯于-70℃，可保存數年。

5.3核酸的保存基因工程制藥-復習6、核酸含量/純度的測定

紫外分光光度法

原理：根據核酸分子中的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)在λ=260nm處有最大吸收值，可采用紫外分光光度法測定核酸的含量。1μg/ml的DNA溶液的A260nm吸收值為0.020，1μg/ml的RNA溶液的A260nm吸收值為0.022，以此為標準，可測得溶液中的核酸含量?；蚬こ讨扑?復習DNA的OD260/OD280值大約為1.8。當OD260/OD280大于1.8則可能有RNA污染。當OD260/OD280小于1.8時則有蛋白質污染。在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。DNA的純度可用OD260與OD280的比值來衡量?；蚬こ讨扑?復習1.測DNA：

純的DNA樣品OD260/OD280應為1.8，OD260m／OD230應大于2.0。

1)OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。

2)小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質或酚污染；

3)OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質，如核苷酸、氨基酸、酚等。

注：可能出現既含蛋白質又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。

基因工程制藥-復習2.測RNA

純的RNA樣品其OD260／OD280約為2.0，OD260/OD230比值應大于2.0。

1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說明有蛋白質或酚的污染；

2）比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染；

3）OD260/OD230比值小于2.0時，表明有小分子及鹽存在。

基因工程制藥-復習帶電荷的分子在電場中會以一定的速率向與其電荷性質相反的電極移動，帶電分子在電場中的移動速度稱為電泳遷移率。2.電泳遷移率同電場的強度和分子本身所帶的凈電荷數目成正比。3.電泳遷移率同分子與介質的摩擦系數成反比。摩擦系數主要與分子的大小、形狀以及介質的粘度有關。

一、電泳的基本原理基因工程制藥-復習4.如果電場強度一定（電壓和電極距離）且電泳介質相同（電泳液和凝膠），分子在電場中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和形狀，形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關:分子量越大，移動越慢。5.因此，電泳可以：分離不同分子質量的DNA；分離相同分子質量但構型不同的DNA,以及帶電荷多寡的DNA；制備純化特定DNA片段。基因工程制藥-復習不同構像的質?；蚬こ讨扑?復習RelaxedsupercoiledIncreasingdegreeofsupercoiling相同分子量的質粒DNA:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，線性分子次之，伸展開環(huán)狀最慢?；蚬こ讨扑?復習二、瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖2.瓊脂糖凝膠

瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(或>90℃)后溶解，冷卻(<45℃后又凝固成均勻的的膠體。

是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產物瓊脂中提取而來。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。

濃度高空隙小基因工程制藥-復習瓊脂糖的濃度（%）分離DNA的片斷大小（bp）0.30.71.41000—500001000—20000300—6000濃度大，空隙小，分辨率高：小分子較易通過，而大分子難通過；濃度小，空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。3.瓊脂糖凝膠的分辨力濃度大小決定其分辨分子大小的能力?；蚬こ讨扑?復習DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。核酸為兩性分子，在pH3.5時，整個分子帶正電,pH8左右時，堿基幾乎不解離，整個分子帶負電。在堿性環(huán)境下，相同堿基數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈負電荷，能以同樣的速度向正極方向移動。具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系，可以近似用于估算分子的大小?？梢苑蛛x相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子。4.DNA在瓊脂糖凝膠的泳動原理基因工程制藥-復習5、凝膠染色溴化乙錠EB

主要有溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色法和SYBRGold染色法。

SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價格較昂貴。基因工程制藥-復習EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結合。EB在300nm紫外光照射下能發(fā)橙紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強度與DNA含量及大小成正比。染色原理基因工程制藥-復習

用已知分子量的標準DNA對DNA片斷大小的估算基因工程制藥-復習EB被認為是一種強致癌物質EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸EB使用時的配制、貯存及使用

EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml。

EB可以直接加入凝膠中,也可以在電泳后將帶DNA的凝膠放入EB溶液中浸泡，但當要知道DNA片段準確大小時，凝膠應在無EB情況下電泳，電泳結束后再用EB染色。凝膠的EB染色的注意事項

基因工程制藥-復習

凝膠介質:

聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和N，N′-甲叉雙丙烯酰胺聚合而成.

注意:

丙烯酰胺為白色結晶粉末，無味，分子量為71.08，為中樞神經毒物。N，N’-甲叉雙丙烯酰胺也為白色結晶粉末，無味，分子量為154.17，亦為中樞神經毒物。1%的稀溶液與皮膚接觸也會引起皮膚發(fā)炎，小鼠的確切致死量（LD50）為170mg/㎏，所以在實驗室操作時應盡量避免與之直接接觸和吸入粉塵。

聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE）三、聚丙烯酰胺凝膠電泳基因工程制藥-復習優(yōu)點：分辨率高。聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片斷大?。╞p）