類風濕性關節(jié)炎分期診斷和TGF-β1分子表達的相關性研究

類風濕性關節(jié)炎分期診斷和TGF-β1分子表達的相關性研究

[摘要]目的：探究轉化生長因子β1（TransformingGrowthFactor-Beta1，TGF-β1）分子表達與類風濕性關節(jié)炎（RheumatoidArthritis，RA）分期診斷的相關性，為早期RA分期診斷提供新的診斷指標和理論依據。方法：收集2018年01月至2018年12月在成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院就診的RA患者樣品60例以及同期正常樣品20例，根據臨床診斷打分和實驗診斷結果對RA患者樣品60例分活動Ⅰ期14例，活動Ⅱ期18例，活動Ⅲ期28例。運用流式細胞術（FCM）、反轉錄-熒光定量聚合酶鏈反應（RT-Q-PCR）方法、酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）方法對所有樣本Th17細胞亞型，血液TGF-β1mRNA，血清TGF-β1蛋白進行檢測分析。結果：研究表明，RA樣本和正常樣品相比，TGF-β1表達具有顯著差異（P<0.05）。Th17細胞亞型，TGF-β1蛋白，TGF-β1mRNA結果與RADAS28活動分期的相關性分別為r=0.482，r=-0.256，r=0.490。結論：通過血液樣本對TGF-β1分子表達檢測，發(fā)現(xiàn)其與RA分期診斷具有相關性。且TGF-β1mRNA比Th17細胞亞型和TGF-β1蛋白結果更具有參考性，TGF-β1mRNA分子表達檢測可以作為RA早期分期診斷指標，為臨床RA早診斷早治療提供理論依據。[關鍵詞]類風濕性關節(jié)炎；分期診斷；TGF-β1；分子表達[通信作者]王近吳，女，碩士生，基礎研究，E-mail：jinwuwang95@163.com；TelorrelationbetweenstagingdiagnosisandTGF-β1expressioninrheumatoidarthritisWang-Jinwu1,Zhang-Xinmao1（ChengduMedicalCollege,Chengdu,Sichuan,610500,P.R.China）【Abstract】Objective:Toinvestigatethecorrelationbetweentheexpressionoftransforminggrowthfactor-β1(TGF-β1)andthediagnosisofrheumatoidarthritis(RA),andtoprovidenewdiagnosticindicatorsandtheoreticalbasisfortheearlystagediagnosisofRA.Methods:WeCollected60RApatientsand20normalsamplesfromthesameperiodintheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollegefromJanuary2018toDecember2018.Accordingtoclinicaldiagnosisscoresandexperimentaldiagnosisresults,60patientswerepidedintodeseaseactivities.Therewere14casesinstageI,18casesinstageII,and28casesinstageIII.WehaddetectedTcellsubtypes,TGF-β1proteinandTGF-β1mRNAexperessionlevelforallsamplesbyFlowcytometry(FCM),enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA),fluorescencequantitativepolymerasechainreaction(RT-Q-PCR)methods.Results:StudiesshowthatthereisasignificantdifferenceintheexpressionofTGF-β1proteinandTGF-β1mRNAbetweenRAsamplesandnormalsamples(P<0.05).ThecorrelationofTh17cellsubtype,TGF-β1protein,mRNAandRADAS28activitystagewasr=0.482,r=-0.256,r=0.490.Conclusion:WefoundthattheexpressionofTGF-β1moleculehasacorrelationwiththediagnosisofRAstaging.Moreover,TGF-β1mRNAisbetterthanproteinresults.TGF-β1moleculeexpressioncanbeusedasanearlydiagnosticmarkerforRAanditprovideatheoreticalbasisforearlydiagnosisandearlytreatmentofRA.【Keywords】RheumatoidArthritis；stagingdiagnosis；transforminggrowthfactor-beta1；molecularexpression類風濕關節(jié)炎（（RheumatoidArthritis，RA）是一種常見的骨關節(jié)滑膜炎系統(tǒng)性自身免疫性疾病，多見于女性[1，2,3]，多見于女性，全球患病率達到1%[4]。其主要表現(xiàn)為關節(jié)滑膜的慢性炎癥、增生形成血管翳，侵犯關節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等[1，5-9]，是一種對稱性、慢性、進行性多關節(jié)炎。RA造成關節(jié)結構破壞，最終導致關節(jié)畸形和功能喪失，對患者生活自理能力產生嚴重影響，給國家醫(yī)療造成嚴重負擔。現(xiàn)行研究RA發(fā)病機制除與遺傳和環(huán)境相關外，涉及復雜的細胞免疫及體液免疫反應，具體致病機制不清楚[10]。多項研究表明RA患者外周血Th1、Th2、Treg和Th17亞細胞群間存在的動態(tài)平衡及交互抑制作用被打破，RA的早期發(fā)生與Th1/Th2細胞的失衡有關，后期發(fā)展與Th17/Treg細胞的失衡有關系[11-13]。我們推測機體處于Th1/Th2/Treg/Th17其中一種或幾種細胞占優(yōu)勢的漂移現(xiàn)象，這可能是導致RA全身及關節(jié)局部炎癥持續(xù)的原因之一。臨床主要通過定量的實驗診斷結果和定性的患者病理情況對RA患者進行診斷和分期，由于RA活動期癥狀和靜止期不同，且表現(xiàn)多樣，實驗診斷和病理情況不能很好地對處于活動期的RA進行分期診斷。免疫初始T細胞分化不平衡與參與RA致病過程的眾多關鍵細胞因子分泌紊亂有關，前人研究表明參與RA致病過程的關鍵細胞因子很多，包括了多種白介素（如IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10，IL-17，IL-21，IL-23）、干擾素（Interferon，IFN）、轉化生長因子β1（TransformingGrowthFactor-Beta1，TGF-β1）和腫瘤壞死因子（TumorNecrosisFactor，TNF）等[14,15]。其中轉化生長因子（TGF-β1）的表達異常與Th1/Th17和Th17/Treg細胞的分化失衡密切相關[10,16]。轉化生長因子β1（TGF-β1）是一種對細胞成熟、增值，分化具有雙重調節(jié)作用的多功能因子[17]。TGF-β1通過smads蛋白傳遞信號，它的表達幾乎關系到RA病情發(fā)生、發(fā)展、治療、預后及轉歸的全過程，其作用復雜多樣。所以TGF-β1基因的表達與RA患者的免疫狀態(tài)息息相關，并影響RA的病程[18,19]。1資料與方法1.1一般資料收集成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院RA病人60例(全部為女性，平均年43±8.7)，健康人群20例（全部為女性，年齡在40±7.6歲之間）清晨空腹靜脈血2ml左右兩管，活動期必須同時滿足下列條件：（1）4個或以上的關節(jié)腫脹；（2）6個或以上的關節(jié)觸痛；（3）符合下面兩條標準中任意1條：隨訪當日晨僵持續(xù)時間≥45min，血沉（魏氏法）≥28mm/h，C反應蛋白（C-Reactiveprotein，CRP）>10mg/L[20,21]。所有病人均符合2010年美國風濕病學會的RA分類標準[22]；排除非RA標準：無其他嚴重病史者；3個月以內未接受過生物制劑或關節(jié)皮質類固醇治療。臨床評估包括壓痛和腫脹關節(jié)數，DAS28評分和實驗室指標紅細胞沉降率（ErythrocyteSedimentationRate，ESR）[6]、CRP、類風濕因子（RF）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（AntiCyclicCitrullinatedPeptideAutoantibody,ACPA）。RA組與健康對照組兩組間的性別以及年齡比均衡性檢驗皆顯示無差異[20]。1.2方法分別對血液樣本進行了T細胞亞型FCM分析、TGF-β1蛋白ELISA檢測和mRNA熒光定量PCR檢測。1.3相關統(tǒng)計學處理所有數據采用GraphPadPrism7.0軟件分析和作圖。結果數值用(x±s)表示，不同組間比較采用t檢驗和方差分析，不同組間數據相關性分析采用Spearman相關分析[23]，最終統(tǒng)計結果以(P<0.05)為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1樣本分類和實驗診斷指標結果收集成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院RA病人60例，健康人群20例血液樣本。對60例RA患者標本應用疾病活動評分DAS28分成RA活動期Ⅰ期（DAS28≤3.2），RA活動期Ⅱ期（3.2<DAS28≤5.1）和（DAS28>5.1）。正常樣本和RA活動期樣本之間，年齡，疾病持續(xù)時間并無統(tǒng)計差異，血沉ESR，類風濕因子RF和抗環(huán)瓜氨酸肽自身抗體(ACPA）在RA活動期Ⅱ期和Ⅲ期并無統(tǒng)計學差異。(見表2-1)表2-1樣本分類和實驗診斷指標正常樣品RA活動Ⅰ期RA活動Ⅱ期RA活動Ⅲ期例數（例）20141828年齡（歲）37±5.236±3.538±4.742±4.1疾病持續(xù)時間（年）--3±1.23±1.44±1.1血沉(mm/h)--32±8.447±6.548.5±16.0內風濕因子（陽性率）--6/14(42.9%)14/18(77.8%)22/28(78.6%)抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（陽性率）--4/14(28.6%)8/18(44.4%)11/28(39.3%)DAS-28score--DAS28≤3.23.2<DAS28≤5.1DAS28>5.1注：數值用平均值±標準差表示，數據統(tǒng)計用t-檢驗方法,--表示無或未檢測到結果，?P<0.05表示具有統(tǒng)計學差異。2.2血液樣本T細胞亞型FCM處理結果收集成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院RA病人60例，健康人群20例血液樣本，通過流式細胞術對Th1，Th2,Th17和Treg細胞進行分選和計數。以同型對照標記為對比，計算各血液T細胞亞型相對頻率。Th1和Treg細胞亞型RA活動Ⅲ期對正常樣本具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），Th2細胞亞型無統(tǒng)計學差異。Th17細胞亞型RA活動Ⅰ期，Ⅱ期，Ⅲ期對正常樣本都具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。(見表2-2)表2-2血液樣本T細胞亞型相對頻率組別Th1cell(%)Th2cell(%)Th17cell(%)Tregcell(%)RA樣本7.2±4.8?1.6±0.81.2±0.9?1.9±1.1?RA活動Ⅰ期6.1±3.71.9±0.50.9±0.5?2.6±0.6RA活動Ⅱ期5.8±4.51.8±0.41.1±0.6?1.7±1.3RA活動Ⅲ期6.9±4.8?1.8±1.01.3±1.0?1.5±1.1?正常樣品2.6±1.31.6±0.90.6±0.32.7±1.7注：數值用平均值±標準差表示，數據統(tǒng)計用t-檢驗方法,?P<0.05表示具有統(tǒng)計學差異。2.3血清樣本TGF-β1蛋白ELISA檢測結果對收集到RA病人60例，健康人群20例血清樣本ELISA檢測TGF-β1蛋白結果顯示，總體RA樣本TGF-β1蛋白濃度表達和健康對照組相比低40pg/ml，但P>0.05無統(tǒng)計差異。RA活動Ⅰ期和Ⅲ期跟健康對照組相比也無差異，值得注意的是RA活動Ⅱ期TGF-β1蛋白濃度表達較低，跟健康對照組相比，P<0.05有統(tǒng)計學差異。(見表2-3)表2-3血清RA活動組與健康對照組TGF-β1水平比較（x±S）組別例數TGF-β1（pg/ml）RA樣本60328.36±16.89RA活動Ⅰ期14367.55±23.06RA活動Ⅱ期18286.28±12.58?RA活動Ⅲ期28321.24±14.20?健康對照組20368.36±15.45注：數值用平均值±標準差表示，數據統(tǒng)計用t-檢驗方法,?P<0.05表示具有統(tǒng)計學差異。2.4血液mRNA熒光定量PCR檢測結果對收集到的60例RA病人血樣和20例健康人群血樣，提取RNA,反轉錄熒光定量PCRTGF-β1后，根據CFX96本身軟件采用2-??Ct的相對定量計算方法，結果表明RA樣本TGF-β1轉錄子相對表達量低于正常樣本組。而且根據RA活動期加強，TGF-β1轉錄子相對表達量成負相關性，都差異低于正常樣本組，而且組間差異P<0.05,有統(tǒng)計學差異。(見圖2-1)圖

2-1：TGF-β1mRNA的相對表達量比較注：control為正常對照組，RA1為RA活動Ⅰ期，RA2為RA活動Ⅱ期，RA3為RA活動Ⅲ期，?P<0.05表示具有統(tǒng)計學差異。2.5散點圖相關性分析根據RA患者分期樣本和正常對照組樣本的流式結果（Th17），ELISA結果，熒光定量PCR結果，對應DAS28分期樣本，運用采用Spearman相關分析方法，進行組間相關性分析。流式Th17細胞頻率結果顯示，和RA患者嚴重程度成正比，且各組間具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。ELISATGF-β1蛋白表達結果顯示，RA活動Ⅱ期、RA活動Ⅲ期和正常對照組相比表達降低，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。熒光定量PCRTGF-β1mRNA相對表達結果顯示，和RA患者嚴重程度成正比，且各組間具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。熒光定量PCR結果與流式（Th17）結果相比，與DAS28分期的相關性要高（r=0.490VSr=0.482）。(見圖2-2)圖2-2：檢測結果與DAS28分期的相關性散點圖注：control為正常對照組，RA1為RA活動Ⅰ期，RA2為RA活動Ⅱ期，RA3為RA活動Ⅲ期，?P<0.05表示具有統(tǒng)計學差異。3討論類風濕關節(jié)炎（RA）是一種較為常見的系統(tǒng)性自身免疫病，全球流行，但具體致病機制尚不清楚[24-26]。目前RA的臨床診斷一般是通過定性的臨床病理分析和定量的檢驗指標。本文通過定性病理分析，對照樣本，比較了RA與正常人的組間差異和不同活動期的相關性。TGF-β1低濃度時與IL-6聯(lián)合作用促進分化為Th17細胞，單獨高濃度時促進分化為Treg細胞，而Th17/Treg的平衡影響RA的病情進程[27,28]。同時TGF-β1蛋白表達受TGF-β1基因和mRNA表達的影響，而且與轉錄后修飾和翻譯調控有關。患者RA和正常樣本血細胞TGF-β1蛋白表達水平在不同的研究中，結果有差異。RA患者血液中TGF-β的水平明顯低于正常人,因此RA患者下調免疫活動的功能下降,自身免疫反應異常,自身抗體及免疫球蛋白合成增多[29,30]。TGF-β1對RA患者起到很重要的保護作用,它的減少導致RA患者自身免疫紊亂[29]。正常人群各細胞因子和T亞群細胞正常分泌行使功能，而RA患者各細胞因子分泌紊亂，導致T亞群細胞分化失衡，分化失衡反過來也影響各細胞因子的分泌[31-34]。TGF-β1基因的表達與RA患者的免疫狀態(tài)息息相關。其作用形式多樣，生物功能復雜，單獨存在時和與其他細胞因子共同作用的時候，對人體免疫細胞的分化和發(fā)展影響完全不一樣。因此，TGF-β1的分子表達與類風濕性關節(jié)炎的關系值得我們去研究。分析TGF-β1檢測結果與類風濕性關節(jié)炎不同活動期的相關性，鑒定分析對于評價RA早期診斷分期具有臨床意義的分子表達指標，有助于臨床早期診斷RA和其分析用藥，最終為探究RA的發(fā)生與發(fā)展關系，研究TGF-β1分子表達在RATh17/Treg細胞分化平衡中的作用機制，對早期診斷、評價病程發(fā)展提供借鑒，為治療RA提供實驗理論依據。參考文獻[1]左進紅.中成藥治療類風濕性關節(jié)炎的網狀Meta分析[D].廣州中醫(yī)藥大學,2018.[2]陳磊,汪元,潘惠,劉佳佳,梁紅.類風濕關節(jié)炎合并心血管疾病的危險因素分析[J].中華中醫(yī)藥雜志,2019,34(01):328-331.[3]胡筱娟,程紅衛(wèi),秦艷,劉恬園,劉亞東,張冠杰.青白通痹膠囊聯(lián)合小劑量甲氨蝶呤治療類風濕關節(jié)炎的臨床效果[J].臨床醫(yī)學研究與實踐,2019,4(02):111-112+121.

牟曉月,梁一民,陶海英,金都.153例老年類風濕關節(jié)炎患者血清抗CCP抗體臨床意義分析[J].中華全科醫(yī)學,2018,16(12):2032-2034+2041.肖紅,姜泉,唐曉頗,焦娟,葛琳.姜泉治療類風濕關節(jié)炎組方用藥規(guī)律研究[J].中國中藥雜志,2019,44(02):381-387.何春曉,陳光耀,徐愿,張夏天,鄭思思,徐行,羅靜,陶慶文.補腎祛寒治尪湯聯(lián)合甲氨蝶呤治療類風濕關節(jié)炎系統(tǒng)綜述[J].世界中西醫(yī)結合雜志,2018,13(12):1643-1647.萬碧江,肖倩,許瑩,黃偉,陳麗川,段波.針刀松解術對類風濕關節(jié)炎肘關節(jié)僵硬患者關節(jié)液MMP-3、MMP-9、TIMP-1的影響[J].上海針灸雜志,2019,38(01):89-93.[8]蘇哲,張寧.托珠單抗治療中重度類風濕關節(jié)炎的臨床研究[J].實用藥物與臨床,2019,22(05):526-529.[9]趙夜雨,高明利,王麗敏,王恩隆.高明利益氣養(yǎng)陰法治療類風濕關節(jié)炎的經驗總結[J].中華中醫(yī)藥學刊,2019,37(06):1440-1442.X[10]翟麗華.免疫學檢驗聯(lián)合檢測在診斷類風濕關節(jié)炎診斷中的有效應用效果評價[J].世界最新醫(yī)學信息文摘,2018(A2):236-237.[11]王勇,牟方祥,鐘兵,乾燦,吳紅,游苘霞,方勇飛.活動期類風濕關節(jié)炎患者外周血T、B淋巴細胞及NK細胞表達變化的意義[J].中國醫(yī)藥導報,2017,14(11):12-14+21.[12]薛小敏.RF、AKA、抗CCP抗體在臨床診斷類風濕性關節(jié)炎中的作用[J].臨床檢驗雜志(電子版),2018,7(04):718-719.[13]BurmesterGR,FeistE,D?rnerT:Emergingcellandcytokinetargetsinrheumatoidarthritis.NatureReviewsRheumatology2014,10(2):77-88.[14]張承寧,孫彬,邢昌贏,趙秀芳,錢軍.腎小球源性血尿伴/不伴少量蛋白尿青年患者病理分析[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報,2013,34(03):338-339.[15]王文炎,馬志毅,熊源胤等：運用藤龍湯治療類風濕關節(jié)炎經驗[J].風濕病與關節(jié)炎,2018(12):37-39.[16]龍貞亦,袁浩,彭亞夢,吳思弦,周毅峰.類風濕性關節(jié)炎的免疫學指標的應用研究進展[J].廣西醫(yī)學,2018,40(12):1356-1359.[17]NoackM,MiossecP:Th17andregulatoryTcellbalanceinautoimmuneandinflammatorydiseases.AutoimmunRev2014,13(6):668-677.[18]AstryB,VenkateshaSH,MoudgilKD:InvolvementoftheIL-23/IL-17axisandtheTh17/Tregbalanceinthepathogenesisandcontrolofautoimmunearthritis.Cytokine2015,74(1):54-62.[19]GonzalogilE,GalindoizquierdoM:Roleoftransforminggrowthfactor-beta(TGF)betainthephysiopathologyofrheumatoidarthritis.ReumatolClin2014,10(3):174-179.[20]陳瑞林,陶怡,邱可為,黃文輝,黃成輝,李娟.類風濕關節(jié)炎患者Treg細胞變化及與病情活動度的關系[J].南方醫(yī)科大學學報,2012,32(06):886-889.[21]陳瑞林,陶怡,林澤英,黃成輝,黃文輝.阿達木單抗治療類風濕關節(jié)炎的療效和安全性[J].中國新藥雜志,2011,20(02):152-155+166.[22]鄒光美,黃朝任,陳武,吳博文.血清RF、抗CCP抗體、CRP