T-CVMA 164-2024 口蹄疫A型病毒磁微?；瘜W(xué)發(fā)光抗體檢測方法

T/CVMA164—2024口蹄疫A型病毒磁微?；瘜W(xué)發(fā)光抗體檢測Magneticparticlechemiluminescencemethodfordetectionofantibodyagainstfoot-and-mouthdiseasevirustypeA2024-5-23發(fā)布2024-5-23實(shí)施中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I1本文件適用于動物血清中的口蹄疫A型病毒抗體檢測，適用于A型口蹄疫的血清學(xué)監(jiān)測、流行病學(xué)2規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范激發(fā)液excitationflu4符號和縮略語MES溶液：4-嗎啉乙磺酸溶液（4-Morpholineethanesulfonicacidsolution）2MEST溶液：4-嗎啉乙磺酸吐溫溶液（4-MorpholineEthylsulfonicAcidTweenPBST：磷酸鹽吐溫溶液（PhosphatebuffersalineinTween）NHS溶液：N-羥基丁二酰亞胺溶液（N-hydroxysuccinimidesolution）采用競爭法的磁微粒直接化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)檢測口蹄疫病毒A型抗體。將待測樣品、口蹄疫A型病混合；孵育一段時間洗滌后，加入激發(fā)液A和激發(fā)液B；發(fā)光強(qiáng)度和抗體含量成反比，通過測量的發(fā)光7.32℃~8℃冰箱，-20℃冰箱。38.1.1進(jìn)行靜脈無菌采血，不少于8.1.2將血液室溫（15℃~25℃)靜置于斜面2h～4h，待血液自然凝固后，置離心機(jī)4,000r/min離8.1.3吸出上層血清保存?zhèn)溆?。血清?yīng)清亮，8.2.1血清樣品若在一周內(nèi)檢測，可置2℃~8℃條件下保存。若超過一周檢測，應(yīng)置于-20℃以下冷4A.1.1從超低溫冰箱取出大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，于冰上融化，加入5μg合成質(zhì)粒pet28a-FMDV-A-VP1，輕輕混勻后，立16h。mL含卡那霉素（50μg/mL）LB液體培養(yǎng)基A.1.48,000r/min離A.2磁性微球溶液的制備A.2.1取0.2mg口蹄疫病毒VP1重組蛋白，裝入透析袋中，置0.15moL/LpH值7.4的PBS溶液中室溫（15℃~25℃)透析4h。），5min）移除上清。重復(fù)用MES溶液磁分離洗滌2次，用0.5mLMES溶液重懸。溶液，搖勻后固定在混勻器上室溫（15℃~25℃)反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，磁分離，移除上清，用總體積1mL，搖勻后固定在混勻器上室溫（15℃~25℃)反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后，磁分離，移除上清，56取500μL口蹄疫A型病毒單克隆抗體（濃度2mg/mL裝入透（15℃~25℃)透析4h。取出透析后的抗體溶液，加入潔凈玻璃瓶中，再將吖啶酯溶液（濃度5.0mmoL溶液中，避光，室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)后入10%（m/V）賴氨酸封閉，室溫反應(yīng)1h。B.1.5保存加入0.02%Proclin-300混勻后經(jīng)0.22μm濾器過濾，無菌分裝，于2℃~8℃保存。7C.1.1采血室溫（15℃~25℃)待血液凝固后，37℃靜置2h，然后2℃~8℃靜置1h，將析出的血清轉(zhuǎn)移到離心瓶中，以2,000r/min離心5將制備的血清混合均勻后，0.22μm濾膜過濾除菌，將血清與凍干保護(hù)劑按8量分裝，1mL/瓶，冷凍真空干燥，置-70℃以下保存，標(biāo)記為“口蹄疫A型病毒抗體陰性免疫間隔1個月，最后免疫一次后，無菌采血，用商品化口蹄疫A型ELISA抗體阻斷檢測試劑盒檢測蹄室溫（15℃~25℃)待血液凝固后，37℃靜置2h，然后2℃~8℃靜置1h，將析出的血清轉(zhuǎn)移到離心瓶中，以2,000r/min離心5將制備的血清混勻后，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，將血清與凍干保護(hù)劑按8.5:分裝，1mL/瓶，冷凍真空干燥，置-70℃下保存，標(biāo)記為“口蹄疫A型病毒抗體陽8量取200mL純化水，加入37%濃鹽酸溶液8.33mL，加入3化水定容至1,000mL。定量分裝，2℃~8℃保存。2.5mL，攪拌均勻加純化水定容至1,000mL。定量分裝，2℃~8℃保存。稱取十二水合磷酸氫二鈉72.5g、磷酸二氫鉀5g、氯化鈉200g、氯化鉀5g，加入700mL雙蒸水加熱攪拌溶解，再加入12.5mL的吐溫-20，而后加雙蒸水定容至1,00純化水?dāng)嚢枞芙?，再加純化水定容?,000mL，經(jīng)0.22μm過濾，置2℃~8℃保存。過濾，置2℃~8℃保存。稱取10mg的NHS，溶于1mLMES溶液中，臨用配制10min內(nèi)使用。稱取10mg的EDC溶于1mLMES溶液中，臨用配制10min內(nèi)使用。），），攪拌均勻，PBS定容至1,000mL，經(jīng)0.22μm過濾，置2℃~8℃保存。），PBS定容至1,000mL。9掃描配套的試劑盒、對照品、激發(fā)液A和激發(fā)液B的二維碼，將批號和檢測方法疫分析儀(H