農(nóng)業(yè)部2122號公告-2-2014 轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品成分檢測 羊內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法

轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品成分檢測羊內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法2014-07-07發(fā)布2014-08-01實施工1農(nóng)業(yè)部2122號公告—2—2014本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了羊內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PHPAP的定性PCR檢測方法。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格PHPAP基因PHPAPgene編碼類遠(yuǎn)古內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因(putativeHERV-K_5q13.3provirusancestralEnvpolypro-根據(jù)羊PHPAP基因序列設(shè)計特異性引物，對試樣進行PCR擴增。依據(jù)是否擴增獲得預(yù)期的5.310mol/L氫氧化鈉溶液：在160mL水中加入80.0g氫氧化鈉(NaOH),溶解后再加水定容至25.11氯仿/異戊醇(24:1):將氯仿和異戊醇按照24:1的比例配制。PHPAP-F:5'-CGGTGTATCGGCAAGPHPAP-R:5'-CAAAAGGGGTGTCCT3農(nóng)業(yè)部2122號公告—2—20146.2PCR擴增儀：升降溫速度>1.5℃/s,孔間溫度差異<1.0℃。7分析步驟7.2.1血液樣品7.3.2加入0.5倍體積的Tris-飽和酚和0.5倍體積的氯仿/異戊醇(24:1),緩慢顛倒離心管10min,4℃,12000g離心10min,將上清液移至另一1.5mL離心管。7.3.3加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1),緩慢顛倒離心管10min,4℃,12000g離心10min。7.3.7將DNA適當(dāng)稀釋或濃縮，使其OD?6值在0.1～0.8的區(qū)間內(nèi)，測定并記錄其在260nm和凝膠電泳檢測DNA完整性。DNA溶液OD?6/OD?8o值應(yīng)在1.7～2.0,或質(zhì)量7.4.1試樣PCR反應(yīng)7.4.1.1每個試樣PCR反應(yīng)設(shè)置3次平行。水4農(nóng)業(yè)部2122號公告—2—201410×PCR緩沖液dNTPs混合溶液(各2.5mmol/L)總體積“—”表示體積不確定。如果PCR緩沖液中含有氯化鎂，則不加氯化鎂溶液。根據(jù)Taq酶的濃度確定其體積，并相應(yīng)7.4.1.4進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：94℃變性5min;94℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,7.4.2對照PCR反應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～1.0%的動物DNA作為陽性對照；以水作為空白對照。各對照PCR反應(yīng)體系中，除模板外其余組分及PCR反應(yīng)條件與7.4.1相同。增片段是否為目的DNA片段，按照7.7和7.8的規(guī)定執(zhí)行。按PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書回收PCR擴增的DNA片段。將回收的PCR產(chǎn)物克隆測序，與羊內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列(參見附錄A)進行比對，確定PCR擴增的DNA片段是否為目的DNA片段。陽性對照PCR反應(yīng)中，羊PHPAP內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因得到了擴增，且