色譜分析法液相

關于色譜分析法液相3.1概述（P355）第2頁,共92頁，星期六，2024年，5月第3頁,共92頁，星期六，2024年，5月高效液相色譜法對比氣相色譜法的相同點基本理論一致：保留值、分配系數(shù)、分配比、塔板理論、速率理論等定性、定量原理和方法一致儀器結構和操作技術一致均可與其他儀器聯(lián)用，以研究復雜混合物第4頁,共92頁，星期六，2024年，5月高效液相色譜法對比氣相色譜法的優(yōu)點對于高沸點（＞500℃）、熱穩(wěn)定性差，相對分子質(zhì)量大（M＞400）的有機物（占有機物總數(shù)的75～80%）原則上都可分離流動相選擇余地廣固定相是新型吸附劑，以化學鍵合固定相居多樣品的回收比較容易第5頁,共92頁，星期六，2024年，5月高效液相色譜法對比氣相色譜法的缺點儀器原理及結構有差別流動相性質(zhì)不同，使速率理論參數(shù)不同缺少通用型檢測器“柱外效應”對柱效率及色譜分離影響較大流動相價格較高流動相有毒第6頁,共92頁，星期六，2024年，5月高效液相色譜法的特點高壓：150～350×105Pa高速：高效：氣相色譜n約為2000塔板/米液相色譜n約為30000塔板/米高靈敏度：紫外檢測器：10-9g

熒光檢測器：10-11g第7頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.2高效液相色譜的基本理論(P356)色譜分離的基本理論塔板理論

速率理論第8頁,共92頁，星期六，2024年，5月速率理論

式中A，B，C為三個常數(shù)，其中A稱為渦流擴散項，B為分子擴散系數(shù)，C為傳質(zhì)阻力系數(shù)。范弟姆特方程式的簡化式第9頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.2.1氣相色譜的速率理論

渦流擴散示意圖

渦流擴散項A第10頁,共92頁，星期六，2024年，5月

渦流擴散引起的峰展寬的大?。?/p>

A=2λdP

式中：λ為填充不規(guī)則因子，它由填料顆粒直徑dP、粒度范圍和柱填充狀況決定。對于空心毛細管柱，A項為零。

第11頁,共92頁，星期六，2024年，5月

填料粒徑對A項的影響

篩目dp(cm)λA(cm)20～400.04～0.0810.1250～1000.15～0.0330.14200～4000.004～0.00780.09第12頁,共92頁，星期六，2024年，5月縱向分子擴散使峰展寬(a)柱內(nèi)譜帶構型(b)相應的響應信號分子擴散項B/u(縱向擴散項)第13頁,共92頁，星期六，2024年，5月縱向擴散與組分在柱內(nèi)的保留時間有關。Dg為組分在氣相中的擴散系數(shù)（單位為cm2·s-1）。Dg

反比于載氣密度（相對分子質(zhì)量）的平方根。

Dg隨柱溫增高而增加，但反比于柱壓。第14頁,共92頁，星期六，2024年，5月γ是因載體填充在柱內(nèi)而引起氣體擴散路徑彎曲的因數(shù)（彎曲因子）。彎曲因子γ為與填充物有關的因素。若組分通過空心毛細管柱，γ=1；在填充柱中，γ<1。對于硅藻土擔體，γ=0.5~0.7。第15頁,共92頁，星期六，2024年，5月

氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg

液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl傳質(zhì)阻力項系數(shù)C第16頁,共92頁，星期六，2024年，5月

傳質(zhì)阻力引起非平衡過程示意圖

第17頁,共92頁，星期六，2024年，5月所謂氣相傳質(zhì)過程（Cg

）是指試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程，在這一過程中試樣組分將在兩相間進行質(zhì)量交換，即進行濃度分配。

對于填充柱

第18頁,共92頁，星期六，2024年，5月所謂液相傳質(zhì)過程（Cl

）是指試樣組分從固定相的氣液界面移動到液相內(nèi)部，并發(fā)生質(zhì)量交換，達到分配平衡，然后又返回氣液界面的傳質(zhì)過程。液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl為

df為固定相的液膜厚度第19頁,共92頁，星期六，2024年，5月對于填充式色譜柱，填充均勻程度、擔體粒度、保留時間、載氣種類、載氣流速、柱溫、柱壓、固定相液膜厚度等對柱效、峰擴張的影響。

第20頁,共92頁，星期六，2024年，5月填充柱的u最佳和H最佳第21頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.2.2毛細管色譜柱

Golay方程

H=B/u+Cg?u+Cl?u式中，A=0，B=2Dg氣相傳質(zhì)系數(shù)r0為空心柱內(nèi)徑液相傳質(zhì)系數(shù)同填充柱。第22頁,共92頁，星期六，2024年，5月第23頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.2.3液相色譜(P356)

He=2λdp

渦流擴散項He(A)第24頁,共92頁，星期六，2024年，5月

0

影響峰擴散的主要物理性質(zhì)

參數(shù)氣體液體擴散系數(shù)Dm/cm2?s-110-110-5密度ρ/g?cm-310-31粘度η/g?(cm?s)-110-410-2分子擴散項Hd(B)

常數(shù)第25頁,共92頁，星期六，2024年，5月

固定相傳質(zhì)阻力項(Hm)

流動相傳質(zhì)阻力項(Hs＋Hsm)傳質(zhì)阻力項(C)第26頁,共92頁，星期六，2024年，5月固定相傳質(zhì)阻力項Hs

式中，df為液膜厚度，Ds為試樣分子在固定液內(nèi)的擴散系數(shù)，Cs為與容量因子k有關的系數(shù)。

第27頁,共92頁，星期六，2024年，5月流動相傳質(zhì)阻力項

流動的流動相中的傳質(zhì)阻力項Hm

滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力項Hsm

第28頁,共92頁，星期六，2024年，5月流動的流動相中的傳質(zhì)阻力項Hm

式中Cm是一常數(shù)，是容量因子k的函數(shù)，其值取決于柱直徑、形狀和填充的填料結構。第29頁,共92頁，星期六，2024年，5月滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力項Hsm

式中Csm是一常數(shù)，它與顆粒微孔中被流動相所占據(jù)部分的分數(shù)以及容量因子有關。

第30頁,共92頁，星期六，2024年，5月懸浮聚合產(chǎn)生苯乙烯基二乙基苯聚合物的單體顆粒第31頁,共92頁，星期六，2024年，5月第32頁,共92頁，星期六，2024年，5月Giddings方程第33頁,共92頁，星期六，2024年，5月

液相色譜的H-u曲線

第34頁,共92頁，星期六，2024年，5月固定相粒度大小對板高的影響

H近似正比于dp2，減小粒度是提高柱效的最有效途徑。第35頁,共92頁，星期六，2024年，5月LC和GC的H－u圖

第36頁,共92頁，星期六，2024年，5月柱外效應柱前峰展寬：主要由進樣所引起柱后展寬：主要由接管、檢測器流通池體積所引起第37頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.3.1

液-固色譜

其作用機制是溶質(zhì)分子（X）和溶劑分子（S）對吸附劑活性表面的競爭吸附：

這種競爭吸附達到平衡時：3.3高效液相色譜的類型及其分離原理(P358)第38頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.3.2

液-液分配色譜及化學鍵合相色譜第39頁,共92頁，星期六，2024年，5月正相液-液色譜法（normalphaseliquidchromatography）：一般為了避免固定液的流失，對于親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性。反相液-液色譜法（reversphaseliquidchromatography）：流動相的極性大于固定液的極性，出峰順序正好與正相液－液色譜相反。

多分類第40頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.3.3

離子交換色譜陽離子交換陰離子交換第41頁,共92頁，星期六，2024年，5月溶劑中的陰離子X-與樹脂中的Cl-進行交換，達平衡后，此濃度表示的平衡常數(shù)Kx

為：

分配系數(shù)Dx

（陰離子交換）為

第42頁,共92頁，星期六，2024年，5月溶劑中的陽離子M+與樹脂中的Na＋進行交換，達平衡后，此濃度表示的平衡常數(shù)Kx

為：分配系數(shù)Dx

（陽離子交換）為第43頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.3.4空間排斥（排阻）色譜第44頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.3.5高效液相色譜分離類型的選擇(P359)

相對分子質(zhì)量較低，揮發(fā)性較高的試樣，適于用氣相色譜法。標準的液相色譜類型（液-固、液-液、離子交換、離子對色譜、離子色譜等）適用于分離相對分子質(zhì)量為200～2000的試樣。大于2000的則宜用空間排阻色譜法，作出相對分子質(zhì)量的分布情況。第45頁,共92頁，星期六，2024年，5月第46頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.4液相色譜法流動相(P60)

在選擇流動相時應注意下列幾個因素：流動相純度：一般為分析純試劑，必要時需進一步純化，以除去有干擾的雜質(zhì)。沸點合適，適應回收不與色譜柱或固定相起化學反應，不溶解固定相，不改變固體吸附劑的吸附活性，不與吸附劑起不可逆反應對試樣要有適宜的溶解度：否則會在柱頭易產(chǎn)生部分沉淀。溶劑的粘度小，擴散系數(shù)大，減小傳質(zhì)阻力應與檢測器相匹配第47頁,共92頁，星期六，2024年，5月在選用溶劑時，溶劑的極性為重要的依據(jù)

正相液-液色譜，選中等極性的溶劑為流動相。組分的保留時間太短：表示溶劑的極性太大；組分的保留時間太長：表示溶劑的極性太?。辉龠x極性在上述兩種溶劑之間的溶劑；多次實驗，以選得最適宜的溶劑。例第48頁,共92頁，星期六，2024年，5月正相色譜低極性流動相反相色譜高極性流動相中等極性流動相中等極性流動相時間時間時間時間待測物極性：A>B>C正、反相色譜中極性和保留時間的關系第49頁,共92頁，星期六，2024年，5月液-液色譜和液-固色譜常用溶劑的極性順序排列反相：水（極性最大），甲酞胺，乙腈，甲醇，乙醇，丙醇，丙酮，二氧六環(huán)，四氫呋喃正相：甲乙酮，正丁醇，醋酸乙酯，乙醚，異丙醚，二氯甲烷，氯仿，溴乙烷，苯，四氯化碳，二硫化碳，環(huán)己烷，己烷，庚烷，煤油（極性最小）注：為了獲得合適的溶劑強度（極性），常采用二元或多元組合的溶劑系統(tǒng)作為流動相。第50頁,共92頁，星期六，2024年，5月各種陰離子的滯留次序為：檸檬酸離子＞SO42-＞草酸離子＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3COO-＞OH->F-，所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。各種陽離子的滯留次序大致為:Ba2+＞Pb2+＞Ca2+>Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+>Zn2+>Mg2+＞Ag+＞Cs+>Rb+＞K+>NH4+＞Na+>H+>Li+，但差別不及陰離子明顯。

離子交換色譜第51頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.5液相色譜法固定相(P361)

3.5.1固定相的基本要求載體顆粒細小均勻固定液液膜薄填充劑應耐壓載體制作重復性好，壽命長，熱穩(wěn)定性好，耐溶劑，不與樣品其化學反應第52頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.5.2液－固色譜固定相全多孔型擔體（porousmicrobeadssupport）：氧化硅、氧化鋁、硅藻土制成的直徑為100μm左右的全多孔型擔體。目前粒度為5～10μm的全多孔微粒擔體是使用最廣泛的高效填料。表層多孔型擔體：又稱薄殼微珠擔體（pellicuarmicrobsadssupport）：直徑為30-40μm的實心核（玻璃微珠），表層上附有一層厚度約為1～2μm的多孔表面（多孔硅膠）。第53頁,共92頁，星期六，2024年，5月微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型離子交換層惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆第54頁,共92頁，星期六，2024年，5月堆積硅珠：納米二氧化硅凝積成30-40μm的堆積硅珠第55頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.5.3液－液分配色譜常用固定液強極性的β，β’－氧二丙腈中等極性的聚乙二醇－400弱極性的角鯊烷第56頁,共92頁，星期六，2024年，5月液-液色譜擔體

硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酞胺等。仍可分為全多孔型和薄殼型兩種，其特點如液固色譜的固定相。目前較常使用的是5～10μm的硅膠微粒（全多孔型）。

第57頁,共92頁，星期六，2024年，5月硅氧碳鍵型（≡Si-O-C）硅氧硅碳鍵型（≡Si-O-Si-C)硅碳鍵型（≡Si-C）硅氮鍵型（≡Si-N）3.5.4化學鍵合固定相多第58頁,共92頁，星期六，2024年，5月第59頁,共92頁，星期六，2024年，5月時間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。第60頁,共92頁，星期六，2024年，5月化學鍵合固定相的特點

表面沒有液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多；無固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命；可以鍵合不同官能團，能靈活地改變選擇性，應用于多種色譜類型及樣品的分析；有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的收集。第61頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.5.5離子交換色譜法固定相

薄膜型離子交換樹脂：以薄殼玻珠為擔體，在它的表面涂約1％的離子交換樹脂而成。離子交換鍵合固定相：用化學反應將離子交換基團鍵合在惰性擔體表面。第62頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.5.6排阻色譜法固定相

軟質(zhì)凝膠半硬質(zhì)凝膠硬質(zhì)凝膠第63頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.6

高效液相色譜儀(P363)

五個部分：

高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)記錄儀第64頁,共92頁，星期六，2024年，5月第65頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.6.1貯液器及流動相貯液器：耐腐蝕，能密封。常用不銹鋼、聚四氟乙烯、玻璃等。流動相（溶劑）：過0.45μm微孔濾膜，脫氣（加熱、抽真空、吹氮、超聲波）第66頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.6.2

輸液泵（高壓泵）

按性質(zhì)可分為恒流泵和恒壓泵兩類：往復式柱塞泵（reciprocatingpistonpump）

100次/min第67頁,共92頁，星期六，2024年，5月特點：不受整個色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動相?？烧{(diào)節(jié)流量。很適用于梯度洗提。不足之處是輸出有脈沖波動。第68頁,共92頁，星期六，2024年，5月氣動放大泵（pneumatiopressureintensifier）特點：不適用于頻繁更換流動相的選擇合適溶劑的試驗，也不便于梯度洗提（需要用兩臺泵）。但它能供給無脈沖的、穩(wěn)定流量的輸出。

第69頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.6.3洗脫方式

等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）梯度洗脫：在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例，即不斷改變其極性（兩個泵）

適于分析極性差別較大的復雜組分

類似GC的程序升溫（沸程較長樣品）第70頁,共92頁，星期六，2024年，5月第71頁,共92頁，星期六，2024年，5月第72頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.6.4進樣裝置

注射器隔膜進樣高分子有機硅膠墊→進樣室注射器隔斷式停流進樣

優(yōu)點：可以任意改變進樣體積，注射快速，不易造成峰擴張缺點：無法測定保留時間，重現(xiàn)性較差，試液容易滲漏GC系統(tǒng)壓力較小，可以HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進樣（早期）第73頁,共92頁，星期六，2024年，5月高壓定量進樣閥：六通進樣閥第74頁,共92頁，星期六，2024年，5月開始分析廢液樣品

淋洗液至分離柱進樣閥樣品裝樣廢液

淋洗液至分離柱定量環(huán)進樣（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）樣品環(huán)第75頁,共92頁，星期六，2024年，5月高壓定量進樣閥：

優(yōu)點：不必停泵，進樣量的可變范圍大，耐高壓，易于自動化

缺點：容易造成色譜峰擴張第76頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.6.5色譜柱

常用內(nèi)壁拋光過的不銹鋼制成標準柱型：內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm，長為15cm~30cm的直形不銹鋼柱。液相色譜填充柱的填充方法：干法和濕法兩種顆粒直徑大于20μm的可用干法填充顆粒直徑10μm以下的采用濕法裝柱濕法裝柱柱效可達3萬塔板/米第77頁,共92頁，星期六，2024年，5月3.6.6檢測器

示差折光檢測器（differentialrefractiveindexdetector）原理：利用折光率的差別進行檢測，是通用型檢測器缺點：靈敏度低，溫度要求嚴格通用性檢測器第78頁,共92頁，星期六，2024年，5月紫外光度檢測器（ultravioletphotometricdetector）：

常用型檢測器，檢測限可達10-9g·mL-1

優(yōu)點：這種檢測器對溫度和流速不敏感，適宜于梯度洗提

缺點：不能用于對紫外-可見光完全不吸收的試樣的檢測常用性檢測器第79頁,共92頁，星期六，2024年，5月第80頁,共92頁，星期六，2024年，5月

光電二極管陣列檢測器（photo-diodearraydetector）是紫外可見光度檢測器的一個重要進展。第81頁,共92頁，星期六，2024年，