單克隆抗體與基因工程抗體的制備

第四章

單克隆抗體與基因工程抗體的制備第二節(jié)單克隆抗體的制備一、單克隆抗體的產(chǎn)生二、單克隆抗體的純化三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性思考題小結(jié)抗體種類(lèi)：第一代抗體多克隆抗體〔polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體〔monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體〔geneticengineeringantibody)B淋巴細(xì)胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng)，單克隆抗體流程不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同〔一〕小鼠骨髓瘤細(xì)胞動(dòng)物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重〔二〕免疫脾細(xì)胞細(xì)胞性抗原：〔1~2〕×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強(qiáng)免疫免疫小鼠。淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞發(fā)育。漿細(xì)胞。抗原接種培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液〔三〕細(xì)胞融合細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易翻開(kāi)而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊防止細(xì)胞返祖：定期用8-AG處理細(xì)胞本卷須知：切忌過(guò)多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中飼養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞密度過(guò)低不利于細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖常用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞其中MQ還有去除死亡細(xì)胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過(guò)2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化。飼養(yǎng)細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞(1:3)50%PEG1min內(nèi)加完;2min內(nèi)加10ml培養(yǎng)液融合方法SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為1：2～51ml50%的PEG〔無(wú)菌，預(yù)溫37℃〕在1分鐘內(nèi)滴完,靜置90秒,時(shí)間一到,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)液一滴一滴參加,停止PEG作用根據(jù)細(xì)胞數(shù)量參加HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時(shí)每孔細(xì)胞數(shù)為〔0.5～1.5〕×105個(gè)。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液細(xì)胞融合10～20天出現(xiàn)克隆HAT篩選挑克隆融合細(xì)胞的早期培養(yǎng)HGPRT酶與TK酶：次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶胸腺嘧啶核苷激酶〔四〕雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)應(yīng)用液：8-雜氮鳥(niǎo)嘌呤聚乙二醇HAT培養(yǎng)基：H〔Hypoxanthine〕:次黃嘌呤A〔Aminopterin〕：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體〞，供細(xì)胞通過(guò)替代途徑合成DNAHAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻SP2/O:HGPRT-，TK-;長(zhǎng)命脾細(xì)胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)雜交瘤細(xì)胞:HGPRT+，TK+;長(zhǎng)命骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞：長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力有限稀釋法(limitingdilution)顯微操作法(micromanipulation)FACS法〔fluorescenceactivatedcellsorter〕軟瓊脂平板法(softagarmethod)

二、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過(guò)系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞有限稀釋法效率最高價(jià)格昂貴FACS配制方案：雜交瘤細(xì)胞〔〔1～5〕x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍〞：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融〞：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇防止污染防止染色體喪失防止非分泌細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)防止細(xì)胞密度過(guò)高而死亡細(xì)胞冷凍的意義

第二節(jié)單克隆抗體的制備經(jīng)過(guò)反復(fù)克隆化獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)〔除及時(shí)凍存的細(xì)胞外〕。因?qū)掖蝹鞔滓鹑旧w逐漸喪失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。一、單克隆抗體的產(chǎn)生動(dòng)物體內(nèi)誘生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，〔5～10〕×105/只體外培養(yǎng)法：中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)

單抗含量不高，牛血清Ab難以去除腹腔注射法前5天進(jìn)行,預(yù)先腹腔注射pristane〔1～5〕×106細(xì)胞1～3w形成腹水高滴度腹水可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的抗原：免疫熒光法〔用丙酮和甲醇按1:1比例固定細(xì)胞〕二、 單克隆抗體的純化ELISAELISA多頭加樣槍。免疫熒光法鹽析沉淀親和層析離子交換層析McAb的純化Ig類(lèi)型、亞類(lèi)測(cè)定：雙擴(kuò)法或ELISA法特異性測(cè)定：抗原類(lèi)似物的交叉反響效價(jià)測(cè)定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

表位測(cè)定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競(jìng)

爭(zhēng)抑制法，相加指數(shù)法及微機(jī)集群分析親和性測(cè)定：測(cè)定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細(xì)胞染色體40條，SP2/0細(xì)胞68條，雜交瘤細(xì)胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性弱凝集反響和不呈現(xiàn)沉淀反響對(duì)環(huán)境敏感性〔一〕單克隆抗體的特性?xún)?yōu)點(diǎn)：在體外“永久〞地存活并傳代用相對(duì)不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療〔二〕單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)與局限性McAbPcAb抗原要求可以不純純度高得量高低特異性高低穩(wěn)定低高沉淀反響無(wú)有本錢(qián)高低McAb與PcAb的比較McAbandPcAb第三節(jié)基因工程抗體制備基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。一、人源化抗體方法：從雜交瘤細(xì)胞別離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性保存了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力〔一〕嵌合抗體嵌合抗體〔二〕改型抗體Fab：抗原結(jié)合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：?jiǎn)捂溈勺儏^(qū)片段SdAb：?jiǎn)螀^(qū)抗體

二、小分子抗體小分子抗體其它生物活性蛋白融合三、抗體融合蛋白許多抗原抗體反響要求雙價(jià)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，使抗原分子上的兩個(gè)表位交聯(lián)或使兩個(gè)抗原分子連接。將識(shí)別腫瘤抗原的抗體和識(shí)別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞外表分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識(shí)別，取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。四、雙特異性抗體分別別離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價(jià)抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價(jià)抗體通過(guò)化學(xué)試劑交聯(lián)起來(lái)，然后別離出目的組分。此法缺點(diǎn)是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳?；瘜W(xué)交聯(lián)BsAb將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤(quadroma)。但二次雜交瘤細(xì)胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機(jī)組合物。BsAb在其中的比例可為10%～50%不等。多倍雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，臨床應(yīng)用時(shí)存在人抗鼠抗體免疫反響(HAMA)，因此不適用于臨床。細(xì)胞工程BsAb多采用抗體分子片段,如Fab，F(xiàn)v或ScFv,經(jīng)基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達(dá)分泌型的BsAb。基因工程BsAb用PCR擴(kuò)增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼外表用抗原抗體反響篩選出表達(dá)所需要抗體的克隆并擴(kuò)增。使抗體基因以分泌的方式表達(dá)，獲得可溶性的抗體片段?？贵w庫(kù)：組合抗體文庫(kù)：在建庫(kù)過(guò)程中如果將VH和VL隨機(jī)組合人天然抗體庫(kù)：抗體mRNA來(lái)源于未經(jīng)免疫的正常人〔一〕根本原理和程序噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)模擬天然全套抗體庫(kù)抗體文庫(kù)可以到達(dá)或超過(guò)1011庫(kù)容,能包含B細(xì)胞全部克隆建庫(kù)的外源基因來(lái)自人體多克隆細(xì)胞的總mRNA通用引物具有人的種屬普遍性抗體的VH和VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性第四節(jié)單克隆抗體的應(yīng)用病原微生物抗原、抗體的檢測(cè)腫瘤抗原的檢測(cè)免疫細(xì)胞及其亞群的的檢測(cè)激素測(cè)定細(xì)胞因子的測(cè)定一、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑病原體測(cè)定：肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH－弓形蟲(chóng),風(fēng)疹病毒,巨細(xì)胞病毒，單純皰疹病毒細(xì)胞外表CD測(cè)定：CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型激素的測(cè)定：

內(nèi)分泌疾病的診斷藥物測(cè)定(TDM)：抗排斥藥物抗腫瘤藥物地高辛研究工作中的探針：越來(lái)越多未知功能cDNA的克隆對(duì)復(fù)雜的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加免疫沉淀二、蛋白質(zhì)的提純單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個(gè)惰性的固相基質(zhì)〔如Speharose2B、4B、6B等〕上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時(shí)，待別離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH，欲別離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。MACS定義：分子量較小但具有抗原結(jié)合功能的分子片段優(yōu)點(diǎn)：分子量小,穿透性強(qiáng),抗原性低不含F(xiàn)c段，不會(huì)與帶有Fc段受體的細(xì)胞結(jié)合，不良反響少可在原核系統(tǒng)表達(dá)及易于基因工程操作半衰期短，有利于及時(shí)中和及去除毒素三、小分子抗體的應(yīng)用應(yīng)用：用于腫瘤的導(dǎo)向治療腫瘤的影像分布基因治療細(xì)胞內(nèi)抗體：在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特異性識(shí)別某一基因產(chǎn)物可干擾該基因產(chǎn)物的生物活性研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系腫瘤的體內(nèi)顯像診斷單鏈抗體排除速度快，穿透力強(qiáng)，在腫瘤組織中的分布指數(shù)較完整抗體分子高放射顯像時(shí)，放射性核素排除較快，對(duì)身體危害程度小，顯像的本底較低理想的顯像定位診斷載體病毒的診斷和抗病毒感染血液性疾病的診斷白血病的免疫診斷及分型四、抗體融合蛋白的應(yīng)用在體外免疫檢測(cè)中的應(yīng)用自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)快速檢測(cè)HBV和HIV病原體等防止化學(xué)交聯(lián)減低兩者的活性，從而提高酶免疫檢測(cè)的敏感度用雙特異抗體作為二抗，檢測(cè)限達(dá)1ng/ml五、雙特異抗體的應(yīng)用在體內(nèi)腫瘤放射免疫顯像診斷中的應(yīng)用方法：