《如何建立高效的重組蛋白真核表達(dá)平臺(tái)》VIP

北京義翹神州·在線講座一一《如何建立優(yōu)質(zhì)、高效的重組蛋白真核表達(dá)平臺(tái)》答疑環(huán)節(jié)匯總非常感謝大家對(duì)北京義翹神州在線講座的大力支持，本次講座已圓滿結(jié)束，我們對(duì)直播過(guò)程中答疑環(huán)節(jié)大家的問(wèn)題以及老師的解答進(jìn)行整理如下。如果有需要補(bǔ)充的，有任何建議或想聽(tīng)到其他更多相關(guān)主題的講座，歡迎來(lái)信和我們交流，我們會(huì)根據(jù)您的寶貴意見(jiàn)不斷完善，以后給大家?guī)?lái)更多更精彩的在線講座！marketing@問(wèn)題1：噤呤篩選的時(shí)候需要逐步增加濃度么？答：通常是先確定—個(gè)臨界濃度，這個(gè)濃度下空細(xì)胞會(huì)死，然后在此濃度的基礎(chǔ)上逐漸加壓。問(wèn)題2:CHO和293細(xì)胞表達(dá)是胞外形式還是胞內(nèi)形式表達(dá)？答：我們建議，像哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，盡量讓它分泌表達(dá)，這樣這些蛋白分泌出去之后，不會(huì)在細(xì)胞質(zhì)里面積累；如果是胞內(nèi)表達(dá)的話，我們也試過(guò)，像這樣的細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)的量不會(huì)很多。問(wèn)題3：老師有沒(méi)有用293細(xì)胞純化過(guò)核蛋白？CHO做的穩(wěn)定株可以用來(lái)純化核蛋白嗎，效果好嗎？答：如果是核蛋白的話，尤其是胞內(nèi)表達(dá)的話，我們建議盡量用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)，CHO、293細(xì)胞可能都不太好弄，也是用于分泌表達(dá)，表達(dá)核蛋白的話量就是會(huì)少—些。如果是想大量表達(dá)的話，可以試—下昆蟲(chóng)細(xì)胞來(lái)做。問(wèn)題4：貼壁293t細(xì)胞能用來(lái)表達(dá)分泌蛋白嗎？答：理論上是可以的，也會(huì)表達(dá)出來(lái)—些，但是如果您大量用的話，盡量建立懸浮表達(dá)系統(tǒng)；如果您只是少量的用—點(diǎn)的話，其實(shí)貼壁的也可以表達(dá)。問(wèn)題5:CHO和293細(xì)胞哪個(gè)更適合表達(dá)抗體藥類型抗體？／用293或者CHO細(xì)胞能直接表達(dá)單克隆抗體么？與雜交瘤的單抗區(qū)別是什么？答：293或者CHO細(xì)胞都可以直接表達(dá)單克隆抗體，很多人都在用，大量的抗體生產(chǎn)肯定都用CHO細(xì)胞來(lái)表達(dá)這個(gè)單抗的。它和雜交瘤的區(qū)別就是，雜交瘤如果凍存時(shí)間太長(zhǎng)，或者傳代次數(shù)太多的話，有時(shí)候里面的抗體基因也會(huì)丟失，但是如果我們拿到這個(gè)抗體基因的序列，用293瞬轉(zhuǎn)，或者構(gòu)建CHO穩(wěn)定細(xì)胞株的話就比較穩(wěn)定，可以長(zhǎng)期保存了。問(wèn)題6:生產(chǎn)抗體藥，為什么需要先在293F細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，再在CHO細(xì)胞穩(wěn)定株轉(zhuǎn)染呢？假如只是為了提高表達(dá)量得到細(xì)胞株，可以直接用CHO做穩(wěn)定株篩選嗎？答：抗體藥通常是這樣，拿到—株抗體序列之后，先在293細(xì)胞上進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，先表達(dá)出來(lái)—些，對(duì)這個(gè)抗體藥的各種活性進(jìn)行檢測(cè)，確定就要這株了，然后再構(gòu)建CHO的穩(wěn)定株。剛才提到的后面穩(wěn)定株構(gòu)建肯定是用CHO細(xì)胞，所以有的客戶希望在瞬時(shí)表達(dá)階段也用CHO細(xì)胞。所以現(xiàn)在有這么—個(gè)趨勢(shì)，就是在前期瞬時(shí)表達(dá)階段，也用CHO的瞬時(shí)表達(dá)來(lái)代替293的瞬時(shí)表達(dá)。我們也有CHO的瞬時(shí)表達(dá)培養(yǎng)基，也是我們正在研發(fā)的產(chǎn)品，如果您有需要的話也可以單獨(dú)聯(lián)系我們進(jìn)行試用。問(wèn)題7:293細(xì)胞表達(dá)的蛋白和CHO細(xì)胞表達(dá)的蛋白有很大區(qū)別嗎？答：應(yīng)該不是很大的，畢竟都是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但是在—些抗體藥領(lǐng)域，大家認(rèn)為293細(xì)胞的糖基化和CHO細(xì)胞的糖基化稍微有—點(diǎn)區(qū)別，對(duì)于抗體藥糖基化很重要，決定了抗體Fe片段的活性。但區(qū)別不是很大。主要后期要用CHO細(xì)胞來(lái)構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)，他們擔(dān)心293瞬時(shí)表達(dá)出來(lái)的糖型和后期大量生產(chǎn)時(shí)候的糖型不—樣，所以也用CHO細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。但是我們認(rèn)為這兩個(gè)糖基化沒(méi)有太大影響，但是如果您有的選擇的話，瞬時(shí)表達(dá)優(yōu)先選擇293表達(dá)系統(tǒng)，CHO做瞬轉(zhuǎn)的表達(dá)量普遍不如293系統(tǒng)。問(wèn)題8:動(dòng)物來(lái)源的基因，密碼子優(yōu)化的必要性？答：密碼子優(yōu)化通常是在真核和原核之間相互切換的時(shí)候，比如—個(gè)真核蛋白要在原核里面表達(dá)，這就需要密碼子優(yōu)化；如果是動(dòng)物來(lái)源的基因，在293系統(tǒng)里面表達(dá)的話，就不需要進(jìn)行密碼子優(yōu)化了。問(wèn)題9：培養(yǎng)基中含有生物素，純化前需要用IBA封閉。這—塊沒(méi)有聽(tīng)明白。這個(gè)指的是如果培養(yǎng)基中含有生物素，都要提前對(duì)蛋白進(jìn)行封閉，再純化？答：游離的生物素會(huì)集合到純化介質(zhì)上，妨礙目的蛋白的結(jié)合，所以需要進(jìn)行封閉。問(wèn)題10:老師您好，貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞質(zhì)粒和PEI比例—般多少？除了PEI和質(zhì)粒的比例，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度這些。有其他辦法能提高轉(zhuǎn)染效率嗎？答：這個(gè)在我們的說(shuō)明書(shū)上有，貼壁細(xì)胞不同的孔的大小，我們都有—個(gè)舉例，用多少質(zhì)粒，用多少轉(zhuǎn)染試劑，當(dāng)然這個(gè)比例只是推薦的，您可以再進(jìn)行優(yōu)化。除了這些，尤其注意—下細(xì)胞的狀態(tài)，活率要高于90%。問(wèn)題11：用HEK293T做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染某膜蛋白表達(dá)的細(xì)胞系，需要懸浮培養(yǎng)馴化么？謝謝答：如果目的是純化蛋白建議懸浮馴化，如果目的是構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)某蛋白的細(xì)胞做—些細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)則不用馴化。問(wèn)題12：細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)候，換液可以直接向瓶里加入新鮮的培養(yǎng)液?jiǎn)?？答：我們傳代是直接稀釋，其?shí)也就相當(dāng)于加入新鮮培養(yǎng)基了，原來(lái)那點(diǎn)在里面帶著無(wú)所謂。問(wèn)題13:問(wèn)HEK293F懸浮細(xì)胞怎么做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染？答：關(guān)于穩(wěn)定株細(xì)胞，如果您是要大量表達(dá)蛋白的話，還是推薦用CHO細(xì)胞來(lái)做穩(wěn)定株，293這個(gè)基因組本身就不太穩(wěn)定，293做出來(lái)的穩(wěn)定株，表達(dá)蛋白的時(shí)候由于這樣頻繁傳代，可能基因會(huì)丟失。如果用293做穩(wěn)定株，用了做那種檢測(cè)細(xì)胞，比如表達(dá)—個(gè)膜蛋白，讓這個(gè)蛋白—直持續(xù)過(guò)表達(dá)的話，我們建議還是使用慢病毒感染，然后再進(jìn)行篩選，這樣整合的效率會(huì)高—些。問(wèn)題14:問(wèn)HEK293F是不是也是先在6孔板中轉(zhuǎn)染，藥物篩選穩(wěn)定株后，可在搖瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)？答：293F細(xì)胞通常用于瞬時(shí)表達(dá)，如果要構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)，通常不會(huì)真的篩選到單細(xì)胞株，而是只構(gòu)建—個(gè)pool然后凍存，需要表達(dá)的時(shí)候復(fù)蘇表達(dá)，—次性使用，不進(jìn)行持續(xù)傳代。問(wèn)題15:穩(wěn)定株的篩選不管是即便是懸浮細(xì)胞也是先在6孔板里小量表達(dá)做藥物篩選，后期再搖瓶大量培養(yǎng)，是嗎？答：通常我們是這樣，可以在懸浮里面進(jìn)行篩選，但是單克隆化還是得在96孔板里面進(jìn)行。問(wèn)題16:CHO穩(wěn)定株篩選是用CHO-Kl細(xì)胞嗎？懸浮培養(yǎng)的嗎？答：其實(shí)穩(wěn)定株最好的情況是用CHO-Kl,課件中下面那些公司做的GS缺失的那個(gè)細(xì)胞，用那個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后進(jìn)行篩選之后得到，那個(gè)細(xì)胞確實(shí)可以懸浮培養(yǎng)。問(wèn)題17:CHO-Kl就是野生型的CHO細(xì)胞么？答：最早的CHO細(xì)胞被分離出來(lái)—株叫CHO-Kl,是營(yíng)養(yǎng)非缺陷型的，算是野生型的吧。后來(lái)基于它又做了很多細(xì)胞，CHO-S那套用于瞬時(shí)表達(dá)的，就是非缺陷型的，是直接可以養(yǎng)的；像DH-a缺陷型的細(xì)胞叫DG44,GS缺陷型的就是LONZA和SIGMA這兩個(gè)公司的缺陷型細(xì)胞。問(wèn)題18:CHO穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒需要線性化嗎？答：線性化會(huì)在—定程度上有利于基因的整合。問(wèn)題19:問(wèn)HEK293F細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒需要線性化嗎？答：這個(gè)是不需要線性化的。問(wèn)題20：大家的293F細(xì)胞哪里買的？答：這個(gè)gibco有，但比較貴，如果客戶手上有自己的其他293細(xì)胞株，義翹神州可以提供懸浮馴化服務(wù)。問(wèn)題21：使用離子交換的柱子去除核酸可以嗎？使用核酸酶會(huì)不會(huì)引入新的雜質(zhì)？答：關(guān)于核酸酶要不要清除的情況，在—些工業(yè)領(lǐng)域，核酸酶的加入之后確實(shí)需要檢測(cè)后期有沒(méi)有被清除干凈。核酸酶加入以后，隨著后期純化過(guò)程中，核酸酶自然會(huì)被清除，基本上不會(huì)有太多殘留，我們也有配套的核酸酶檢測(cè)試劑盒。關(guān)于核酸酶相關(guān)產(chǎn)品，我們會(huì)在下—期的講座中做詳細(xì)介紹。問(wèn)題22:SF9培養(yǎng)的時(shí)候可以使用密閉的搖瓶嗎？如果已經(jīng)購(gòu)買了密閉型的搖瓶，可能通過(guò)把蓋子松—點(diǎn)來(lái)培養(yǎng)SF9細(xì)胞嗎？答：SF9培養(yǎng)是不可以使用密閉搖瓶的，雖然不需要往里面通二氧化碳，但是細(xì)胞代謝也是要耗氧的，所以封閉的也不行，可以蓋子擰松—點(diǎn)。我們表達(dá)的時(shí)候有時(shí)候更簡(jiǎn)單，直接用那種玻璃的藍(lán)蓋的試劑瓶，把那個(gè)瓶蓋擰松—點(diǎn)，放到搖床里面也可以表達(dá)，瓶子上也沒(méi)有那種透氣的膜。問(wèn)題23:SF9細(xì)胞直接懸浮復(fù)蘇可以嗎，—直復(fù)蘇不起來(lái)？答：如果您凍存的時(shí)候就懸浮了，那就懸浮復(fù)蘇，如果您凍存的時(shí)候是貼壁的，那就貼壁復(fù)蘇之后再進(jìn)行懸浮馴化，其實(shí)SF9細(xì)胞懸浮馴化還是比較簡(jiǎn)單的，直接用懸浮培養(yǎng)基養(yǎng)幾代就可以了。問(wèn)題24:180kda的大蛋白，應(yīng)該怎么表達(dá)？／用懸浮293T表達(dá)180kda左右的蛋白，能表達(dá)出來(lái)嗎？答：這個(gè)建議用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)里面表達(dá)可能得到的還多—點(diǎn)，這么大的蛋白，如果想分泌出來(lái)，確實(shí)費(fèi)勁。問(wèn)題25:懸浮293T轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度為多少比較好？答：這個(gè)跟培養(yǎng)基有關(guān)，培養(yǎng)基能容納的細(xì)胞越多，轉(zhuǎn)染的起始細(xì)胞數(shù)量就越多，表達(dá)效率就更高，義翹的M293TII培養(yǎng)基，推薦此密度為3xl06個(gè)／mL。問(wèn)題26:純化后的蛋白用超濾管濃縮沉淀了，應(yīng)該怎么處理，是蛋白濃度過(guò)高嗎？答：這可能蛋白本身就是不穩(wěn)定，還有就是您在濃縮的時(shí)候，不要—直離心，—直離心的話肯定會(huì)下邊濃度高上邊濃度低，可以離—會(huì)吹—下，讓它這個(gè)濃度均勻—下再繼續(xù)離，如果這個(gè)buffer本身就不穩(wěn)定的話，可以考慮在洗脫的時(shí)候換個(gè)buffer。問(wèn)題27:表達(dá)的重組蛋白長(zhǎng)期應(yīng)該如何保存？答：如果蛋白比較穩(wěn)定可以直接－80°C保存，如果容易沉淀就加甘油。問(wèn)題28:293在表達(dá)過(guò)程中會(huì)分泌其他蛋白嗎？答：會(huì)分泌—些其他蛋白，但是很少，而且加上后期我們還會(huì)純化，所以基本上可以忽略。問(wèn)題29:293表達(dá)如何確定收樣時(shí)間？答：最好是從轉(zhuǎn)染之后3天開(kāi)始，每天收—點(diǎn)進(jìn)行蛋白量的檢測(cè)，可以第3、4、5、6、7天這么收，收完之后看看在哪天蛋白表達(dá)量達(dá)到—個(gè)峰值，不再增加了，就收哪天的樣。另外還有就是注意細(xì)胞活率的問(wèn)題，活率不要降的太低，最好在降到50%-70％以下的時(shí)候就開(kāi)始收了，如果活率降的太低，細(xì)胞會(huì)死的很多，很多細(xì)胞裂解之后，內(nèi)融的—些蛋白會(huì)釋放出來(lái)，影響后面的純化。問(wèn)題30:耐受型的his柱有推薦嗎？答：GE的NiSepharoseexcel。問(wèn)題31:昆蟲(chóng)細(xì)胞，分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)在純化工藝上，有什么優(yōu)缺點(diǎn)，請(qǐng)比較分析—下？—般用什么方式和步驟純化？答：昆蟲(chóng)細(xì)胞我們盡量建議進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)，昆蟲(chóng)細(xì)胞不好往外分泌，我們也試過(guò)分泌表達(dá)，就是加信號(hào)膚或蛋白自身的信號(hào)膚讓它分泌表達(dá)，純化是好純化，但是它表達(dá)量特別低，跟胞內(nèi)表達(dá)表達(dá)能差出來(lái)1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。步驟：首先收到細(xì)胞之后，要用超聲的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，破碎完之后再上柱子進(jìn)行純化。問(wèn)題32：信號(hào)膚如何選擇？怎么判斷是否已經(jīng)切割，您是用什么軟件預(yù)測(cè)切割的？準(zhǔn)確度如何？如果切割不完全，有什么影響？有沒(méi)有常用的信號(hào)膚？答：優(yōu)先選用蛋白自身信號(hào)膚，ppt中有提到預(yù)測(cè)網(wǎng)站，如果預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)切割概率太低，可以考慮用別的信號(hào)膚，如果不能切割就不能分泌。常用的信號(hào)膚有CD33信號(hào)膚或者抗體信號(hào)膚。問(wèn)題33：?jiǎn)柪ハx(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)時(shí)，表達(dá)信號(hào)膚如何選擇？信號(hào)膚的選擇會(huì)影響蛋白表達(dá)量嗎？答：如果蛋白本身是分泌表達(dá)的，可以用蛋白本身信號(hào)膚；如果本身是胞內(nèi)表達(dá)，不建議加信號(hào)膚分泌。如果不能正確分泌，表達(dá)量也會(huì)受到影響。問(wèn)題34：在HEK293F細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，確定載體以及信號(hào)膚類型后，再用CHO細(xì)胞做穩(wěn)定株篩選，這樣不會(huì)因?yàn)閾Q了細(xì)胞導(dǎo)致信號(hào)膚對(duì)細(xì)胞選擇導(dǎo)致表達(dá)不理想嗎？答：根據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)，信號(hào)膚在不同細(xì)胞里面影響不是很大。問(wèn)題35:求信號(hào)膚設(shè)計(jì)方法？答：信號(hào)膚這個(gè)不是設(shè)計(jì)出來(lái)的，它有自己的序列特征，如果您表達(dá)的這個(gè)蛋白是沒(méi)有信號(hào)膚的話，找其他的蛋白信號(hào)膚往上安，然后預(yù)測(cè)—下看看切割效率怎么樣。問(wèn)題36:表達(dá)蛋白時(shí)什么情況添加信號(hào)膚？答：就是想讓它分泌表達(dá)的時(shí)候添加信號(hào)膚，通常是先看這個(gè)蛋白是分泌的還是胞內(nèi)的，如果它分泌表達(dá)，您剛好也是想讓它分泌表達(dá)，就讓它帶著自身信號(hào)膚就行；如果是—個(gè)跨膜蛋白，你想表達(dá)它的胞外域，跨膜蛋白胞外域往往也是帶自己信號(hào)膚的，你可以帶著自己信號(hào)膚然后表達(dá)胞外域，直接讓它表達(dá)分泌出來(lái)也可以。問(wèn)題37:哺乳表達(dá)系統(tǒng)，為什么有些蛋白加了信號(hào)膚也不分泌？／用293表達(dá)的分泌蛋白，但是很多蛋白未分泌出來(lái)，在胞內(nèi)，怎么解決，是什么原因?qū)е碌哪?？答：如果蛋白本身是胞?nèi)表達(dá)的，加了信號(hào)膚也經(jīng)常出現(xiàn)不分泌的清況，建議胞內(nèi)蛋白直接用昆蟲(chóng)細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)。—般是分泌的問(wèn)題，有的加了信號(hào)膚也分泌不出來(lái)，—個(gè)原因是信號(hào)膚沒(méi)有發(fā)揮該發(fā)揮的作用，沒(méi)有正確的切除；另—個(gè)可能就是蛋白表達(dá)的時(shí)候構(gòu)象不對(duì)，這樣也會(huì)導(dǎo)致分泌不出來(lái)。問(wèn)題38:昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建系統(tǒng)，怎么選？有什么有缺點(diǎn)。Bae-to-Bae系統(tǒng)構(gòu)建的桿狀病毒穩(wěn)定嗎？答：我們常說(shuō)的就是Bae-to-Bae系統(tǒng)，它的穩(wěn)定性是這樣的，我們包裝出來(lái)的病毒，第—代很少，要擴(kuò)增到P3量就足夠可以用了。不要再用往后的了，因?yàn)椴《倦S著傳代，后面確實(shí)會(huì)不穩(wěn)定，表達(dá)量會(huì)慢慢降低，病毒的滴度也會(huì)慢慢變得不行，如果再需要病毒的話，需要再重新包裝。問(wèn)題39:Bae-to-Bae系統(tǒng)構(gòu)建的病毒，P3代使用，大概能用多少代？—般疫苗生產(chǎn)中，要構(gòu)建病毒庫(kù)。Bae-to-Bae系統(tǒng)構(gòu)建的P3病毒能滿足嗎？答：P3代收完之后就感染細(xì)胞，然后就收病毒了，不是說(shuō)這個(gè)P3代還可以繼續(xù)傳，就直接用到P3代。如果大量的表達(dá)，P3代用完的話，就要重新包裝病毒。如果是構(gòu)建P3代病毒庫(kù)，估計(jì)也就夠批生產(chǎn)的，如果要長(zhǎng)期保存的話，還得是保存質(zhì)粒，需要的時(shí)候再包裝病毒。如果長(zhǎng)期保存的話，病毒庫(kù)也不是—個(gè)好的保存辦法，即使保存在－80°C，保存好幾年的話，病毒的滴度也會(huì)受到—些影響。問(wèn)題40:昆蟲(chóng)細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)，—般什么時(shí)候收樣？答：看課件P30那—頁(yè)，那是我們普遍的—個(gè)經(jīng)驗(yàn)性的時(shí)間，如果是胞內(nèi)表達(dá)蛋白的話，肯定不能等到細(xì)胞都裂解了再收，就是等到細(xì)胞都出現(xiàn)空泡化病變了，但還不至于有太多細(xì)胞裂解的時(shí)候收就行。問(wèn)題41:昆蟲(chóng)細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)，破碎之后，比較粘稠，而且蛋白容易沉淀，損失。請(qǐng)問(wèn)具體純化過(guò)程中，有哪些注意事項(xiàng)？推薦的—般步驟能詳細(xì)講解—下嗎？答：這就是剛才提到的，由于核酸釋放出來(lái)了，導(dǎo)致樣品比較粘稠，我們建議用核酸酶處理—下，就是在超聲這個(gè)步驟加進(jìn)去，稍微處理半個(gè)小時(shí)就可以有明顯的核酸降解的效果，就不那么粘稠了，上樣也好上，純化得率也會(huì)提高。問(wèn)題42:麻煩介紹下昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)中病毒滴度測(cè)定吧，謝謝？答：可以測(cè)—下TCIDSO,把這個(gè)病毒有限稀釋之后，在96孔板上去感染這個(gè)細(xì)胞，感染之后等上幾天，看這個(gè)細(xì)胞病變情況，如果出現(xiàn)病變就認(rèn)為是有病毒，如果沒(méi)有出現(xiàn)病變就認(rèn)為是沒(méi)病毒，然后有—個(gè)公式進(jìn)行換算，就會(huì)算出—個(gè)TCIDSO。問(wèn)題43:用CHO細(xì)胞做穩(wěn)定株轉(zhuǎn)染，能用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染嗎？效果和慢病毒包裝比，會(huì)差很遠(yuǎn)嗎？答：CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比較高，如果用質(zhì)粒的話，雖然沒(méi)有整合機(jī)制，但是也有—定幾率整合到基因組里面，相對(duì)可以接受。問(wèn)題44：有沒(méi)有可能用病毒表達(dá)載體感染293細(xì)胞，做成高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞株，可以的話有沒(méi)有推薦的質(zhì)粒？答：是指用謾病毒感染嗎？需要先轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒然后感染細(xì)胞，義翹的pLV質(zhì)?？梢耘浜?質(zhì)粒系統(tǒng)或者4質(zhì)粒系統(tǒng)使用。問(wèn)題45:請(qǐng)講—下如何利用慢病毒載體穩(wěn)轉(zhuǎn)293T,謝謝！答：慢病毒載體系統(tǒng)有三質(zhì)粒、四質(zhì)粒系統(tǒng)，就是幾個(gè)質(zhì)?！獕K轉(zhuǎn)染這個(gè)293T細(xì)胞之后，這個(gè)細(xì)胞會(huì)包容慢病毒，然后再用收到的漫病毒去感染細(xì)胞，慢病毒本身具有—個(gè)整合機(jī)制，會(huì)把你的目的基因整合到293細(xì)胞里面，再經(jīng)過(guò)這么—個(gè)藥物篩選得到—個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞株。問(wèn)題46:老師你好，我包裝假病毒，是用懸浮293細(xì)胞還是貼壁，轉(zhuǎn)染試劑怎么選擇，貴公司有產(chǎn)品嗎？答：您是想要假病毒基于慢病毒的那種，假病毒替換它的表面膜蛋白那種，里面帶個(gè)報(bào)告基因的吧，那個(gè)和慢病毒—樣，懸浮、貼壁的都可以，看您的用量了?！〤AR-T的公司會(huì)直接在懸浮的293細(xì)胞上進(jìn)行病毒的包裝，這樣產(chǎn)量會(huì)高—些。如果您只是做科研用的話，貼壁的就可以。如果是懸浮的話，我們有配套的培養(yǎng)基，可以適用于慢病毒的懸浮包裝；同時(shí)我們還有陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑可以選。問(wèn)題47:問(wèn)在進(jìn)行病毒樣顆粒蛋白表達(dá)時(shí)，真核表達(dá)系統(tǒng)如何選擇？答：我們建議用昆蟲(chóng)細(xì)胞來(lái)表達(dá)，神州細(xì)胞的VLP的HPV疫苗就是用的昆蟲(chóng)細(xì)胞的，它本來(lái)就是—個(gè)病毒，表達(dá)病毒樣的顆粒會(huì)更符合這個(gè)病毒在天然狀態(tài)下的—個(gè)包裝環(huán)境。問(wèn)題48:請(qǐng)問(wèn)您離子通道蛋白用懸浮培養(yǎng)好還是貼壁生長(zhǎng)較好？答：其實(shí)離子通道蛋白是跨膜的，表達(dá)量都不會(huì)很高，而且純化起來(lái)會(huì)很難，無(wú)論是在轉(zhuǎn)染還是懸浮里面都是差不多的，您只要讓它轉(zhuǎn)染效率足夠高會(huì)給后面帶來(lái)很大優(yōu)勢(shì)。問(wèn)題49:蛋白沒(méi)有tag,純化怎么辦？答：盡量還是加上tag,沒(méi)有tag后期純化會(huì)比較麻煩，哪怕你加了tag之后，后期不想要再把它切了也行。問(wèn)題50：老師您好，我想問(wèn)下不同的陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑是不是會(huì)影響分泌蛋白的分泌水平？你們用的陽(yáng)離子聚合物哪款？答：這個(gè)是不會(huì)影響的，我們分泌蛋白也都是用陽(yáng)離子聚合物的轉(zhuǎn)染試劑，義翹自己的產(chǎn)品STF02:h fection-reagent-stf02。問(wèn)題51:老師，您好，我想請(qǐng)問(wèn)在哺乳動(dòng)物表達(dá)時(shí)啟動(dòng)子的選擇，有比較強(qiáng)的啟動(dòng)子嗎？答：有關(guān)啟動(dòng)子的選擇，目前比較常用的就是CMA啟動(dòng)子。如果您是剛開(kāi)始做這個(gè)系統(tǒng)的話，找個(gè)商品化的質(zhì)粒，用他的啟動(dòng)子就可以，后期再考慮改造啟動(dòng)子的事。問(wèn)題52：對(duì)千抗體真核表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建時(shí)，重鏈和輕鏈啟動(dòng)子相同好還是不同好？答：以我們的經(jīng)驗(yàn)，我們重鏈、輕鏈的啟動(dòng)子用的都是—樣的，就是—個(gè)載體，我們構(gòu)建—個(gè)重鏈的表達(dá)載體，構(gòu)建—個(gè)輕鏈的表達(dá)載體，然后把他們共轉(zhuǎn)到細(xì)胞里，我們—般是這樣做的。問(wèn)題53:重鏈輕鏈共轉(zhuǎn)的話，不同質(zhì)量比共轉(zhuǎn)，有區(qū)別嗎？答：表達(dá)量會(huì)有所區(qū)別，但不會(huì)太大，不同抗體最適的比例會(huì)有區(qū)別，可以進(jìn)行—些滴度的摸索。問(wèn)題54:共轉(zhuǎn)染表達(dá)抗體，比例有什么建議嗎？答：我們建議是重輕鏈比是1:1.5的比例。問(wèn)題55:部分分泌會(huì)不會(huì)是轉(zhuǎn)染試劑的影響？答：轉(zhuǎn)染試劑和分泌沒(méi)有太大關(guān)系，轉(zhuǎn)染試劑是達(dá)到—個(gè)效果，轉(zhuǎn)進(jìn)去之后轉(zhuǎn)染效率足夠高就行，您可以拿—個(gè)GFP質(zhì)?？纯矗@方法只要轉(zhuǎn)染進(jìn)去陽(yáng)性細(xì)胞的比例足夠多就可以。問(wèn)題56:咱們的懸浮用培養(yǎng)基官網(wǎng)上有嗎？答：那個(gè)懸浮用培養(yǎng)基在我們官網(wǎng)上有，PPT中那個(gè)貨號(hào)也是，有昆蟲(chóng)、293培養(yǎng)基。問(wèn)題57:請(qǐng)問(wèn)你們昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基有無(wú)動(dòng)物成分的嗎？答：我們現(xiàn)在昆蟲(chóng)培養(yǎng)基有兩個(gè)版本，—個(gè)是有動(dòng)物源成分的，另—個(gè)是無(wú)動(dòng)物園成份的。說(shuō)實(shí)在的，有動(dòng)物源成份的表達(dá)確實(shí)量更高—些，但是由于申報(bào)需求，需要無(wú)動(dòng)物源成份的，所以我們也有這個(gè)產(chǎn)品。像神州細(xì)胞疫苗產(chǎn)品就用的我們這個(gè)無(wú)動(dòng)物源成份的培養(yǎng)基進(jìn)行的信息研發(fā)。問(wèn)題58:公司這邊有適合CHO的培養(yǎng)基嗎？以及轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑盒？答：我們公司有適合CHO的培養(yǎng)基，除了剛才課件中有提到的適用于DH-a系統(tǒng)、GS系統(tǒng)穩(wěn)轉(zhuǎn)培養(yǎng)基以外，還有適合CHO瞬轉(zhuǎn)的培養(yǎng)基。另外，我們轉(zhuǎn)染用的不是試劑盒只是—個(gè)試劑，都可以聯(lián)系我們申請(qǐng)?jiān)囉?。?wèn)題59:問(wèn)SMM293TII培養(yǎng)基能用千293T細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)嗎？答：我們這個(gè)培養(yǎng)基主要在懸浮系統(tǒng)里面，適合293T細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染；您要是貼壁培養(yǎng)的話建議用DMEMGI那個(gè)血清就行了。問(wèn)題60:實(shí)驗(yàn)室的293細(xì)胞轉(zhuǎn)染后才4天就死了，可能是什么原因，前兩年用同樣的細(xì)胞同樣方案還是能活七天呢？答：我們做過(guò)轉(zhuǎn)染之后細(xì)胞活率的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染之后4天的時(shí)候細(xì)胞活率在70％左右，7天的時(shí)候活率會(huì)降到30％左右。您這個(gè)4天就死了，—個(gè)原因可能是轉(zhuǎn)染試劑有—些毒性，另外就是看—下這個(gè)細(xì)胞不轉(zhuǎn)染的時(shí)候，4天是否還活著?；蛘呤寝D(zhuǎn)染之后這個(gè)細(xì)胞密度太高了，營(yíng)養(yǎng)耗盡死掉的，也注意下這個(gè)培養(yǎng)基的顏色，有沒(méi)有太黃。培養(yǎng)基變黃大多數(shù)情況下是因?yàn)槿苎醪蛔?，黃是因?yàn)槔锩嬗蟹蛹t，溶氧不足會(huì)產(chǎn)生乳酸，乳酸是酸性的，會(huì)使酚紅顯出黃色。問(wèn)題61：我收到你們SF9專用無(wú)血清培養(yǎng)基剛收到就挺黃的啊，比SF900II要黃—些是正常的嗎？答：這個(gè)使用之前黃沒(méi)關(guān)系，是正?，F(xiàn)象。因?yàn)槔锩鏇](méi)有酚紅，也沒(méi)有其他指示的東西，只是營(yíng)養(yǎng)成分自身的顏色。問(wèn)題62:問(wèn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞液有酸味怎么處理？答：先確認(rèn)—下是不是污染吧，如果不是污染很可能是因?yàn)榧?xì)胞無(wú)氧代謝，是通氣不足導(dǎo)致的，可以把瓶口再擰松—些試試。問(wèn)題63:請(qǐng)問(wèn)有些商用化的293細(xì)胞比如賽默飛的產(chǎn)品，它配套的培養(yǎng)基都很貴，請(qǐng)問(wèn)您上面提到的培養(yǎng)基產(chǎn)品可以代替使用嗎？答：那個(gè)確實(shí)挺貴的，我們了解到也是這樣。我們這款293二代培養(yǎng)基基本上就是對(duì)標(biāo)他們那個(gè)產(chǎn)品做的，您可以用我們這個(gè)替換—下試試，應(yīng)該是可以完美替代的。您等下可以跟我們申請(qǐng)培養(yǎng)基試用。問(wèn)題64:293t相較千293e或293f表達(dá)量怎么樣？答：我們通常不用293T細(xì)胞進(jìn)行大量表達(dá)，而是用它進(jìn)行病毒包裝，因?yàn)?93T細(xì)胞有—個(gè)大T抗原有利于病毒包裝，293E細(xì)胞有—個(gè)EBV的復(fù)制起點(diǎn)，293F細(xì)胞的生長(zhǎng)比較快，—般科研用戶用293f比較多，我們用293E、293F都挺多的。所以如果您要大量表達(dá)的話，盡量選擇293E、293F，如果只有293T細(xì)胞的話，也可以用。問(wèn)題65：我想問(wèn)，轉(zhuǎn)染過(guò)程中加雙抗對(duì)表達(dá)量影響大嗎？答：盡量在傳代的時(shí)候可以加，避免污染；轉(zhuǎn)染的時(shí)候盡量不要加，其實(shí)加了影響也不是很大，我們的習(xí)慣是盡量不要加，轉(zhuǎn)染之后24小時(shí)之后可以加。問(wèn)題66:質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，能整合進(jìn)基因組嗎？答：質(zhì)粒整合到基因組是可以發(fā)生的，但是整合的效率會(huì)比較低，所以我們會(huì)選擇用慢病毒來(lái)做這個(gè)穩(wěn)定細(xì)胞株，慢病毒本身自帶—個(gè)整合機(jī)制，所以整合效率會(huì)高—些。問(wèn)題67:CHO-S做穩(wěn)轉(zhuǎn)可以推薦用什么質(zhì)粒??？答：用于293細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的質(zhì)粒都可以，比如pCDNA3.4。問(wèn)題68:問(wèn)293分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)用的是相同的載體嗎，pcDNA3.l都能用嗎？答：分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)293細(xì)胞里面用同樣的載體就行了，pcDNA3.l是可以的，就是注意信號(hào)膚構(gòu)建的問(wèn)題就行。當(dāng)然293細(xì)胞盡量選分泌表達(dá)。問(wèn)題69:瞬轉(zhuǎn)系統(tǒng)的批間差的控制要點(diǎn)有哪些？答：您是要控制表達(dá)量還是想控制蛋白的質(zhì)量呢，如果是想控制表達(dá)量的話，注意—下這幾點(diǎn)：1)轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的活率、密度、以及轉(zhuǎn)染效率；2)收樣時(shí)，細(xì)胞的活率、細(xì)胞數(shù)量；3)收養(yǎng)液的濃度。問(wèn)題70：多次跨膜蛋白，我把胞外區(qū)拼接，做分泌表達(dá)，表達(dá)不出，是因?yàn)閯⒉┦縿倓傊v到的蛋白構(gòu)象不對(duì)，導(dǎo)致不能分泌表達(dá)嗎？答：多次跨膜蛋白，把胞外區(qū)拼接，那這個(gè)構(gòu)象就指不定是什么樣了，很可能會(huì)有分泌不出來(lái)的情況。這種多次跨膜蛋白這樣拼接效果確實(shí)不太好，如果有—個(gè)很感興趣的區(qū)段的話，可以只表