DB54T-絳蟲蚴病地方標準

ICSFORMTEXT11.220FORMTEXTB41FORMTEXTDBFORMTEXT54DBFORMTEXT××/TFORMTEXT××××—FORMTEXT××××FORMTEXTFORMTEXT絳蟲蚴病防治技術(shù)規(guī)程FORMDROPDOWNFORMTEXT××××-FORMTEXT××-FORMTEXT××發(fā)布FORMTEXT××××-FORMTEXT××-FORMTEXT××實施FORMTEXT西藏自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB××/T××××—××××前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14臨床診斷 15實驗室診斷 26防治措施 27人員防護 4附錄A（資料性附錄）假絳蟲蚴包囊 5附錄B（資料性附錄）絳蟲蚴包囊 6附錄C（規(guī)范性附錄）酶聯(lián)免疫吸附試驗 7附錄D（規(guī)范性附錄）PCR檢測 8附錄E（規(guī)范性附錄）絳蟲蚴病藥物治療及使用規(guī)定 9前??言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由西藏自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)標準技術(shù)委員會提出并歸口。本文件起草單位：西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本文件起草人：趙霞玲、夏晨陽、石斌、單曲拉姆、唐文強、劉增強。絳蟲蚴病防治技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了牛、羊絳蟲蚴病的防治技術(shù)規(guī)范，包括診斷、預(yù)防及防治。本文件適用于牛、羊絳蟲蚴病的防治。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB17013包蟲病診斷標準及處理原則WS/T664包蟲病控制《中華人民共和國動物防疫法》術(shù)語和定義絳蟲蚴病絳蟲蚴病是由絳蟲的幼蟲寄生于家畜(或人體)而引起的一類蠕蟲病，是絳蟲成長到中絳期時使中間宿主發(fā)生的疾病。腦包蟲病腦包蟲病又稱腦多頭蚴病，是由多頭帶絳蟲的中絳期幼蟲寄生于牛、羊腦和脊髓內(nèi)引起的疾病。棘球蚴病棘球蚴病又名包蟲病，是由寄生于犬、狼、狐貍等動物小腸的棘球絳蟲中絳期幼蟲棘球蚴感染中級宿主而引起人獸共患寄生蟲病。細頸囊尾蚴細頸囊尾蚴是泡狀帶絳蟲的中絳期幼蟲，寄生于綿羊、山羊﹐偶見于牛及其他野生反芻動物的肝漿膜、大網(wǎng)膜﹑腸系膜及其他器官中。臨床診斷流行特點終末宿主主要是犬、狼、狐貍等；中間宿主主要是牛、羊等哺乳動物，人也是易感宿主。該病主要分布在牧區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)。蟲卵隨感染犬糞便排出，借助空氣塵埃傳播，中間宿主食入蟲卵被感染。臨床癥狀腦包蟲病患病牛羊：寄生于腦內(nèi)時，呈現(xiàn)神經(jīng)癥狀，因蟲體寄生部位不同，可出現(xiàn)頭偏向一側(cè)的轉(zhuǎn)圈運動,對側(cè)視覺障礙。棘球蚴患病牛羊：消瘦、咳嗽、呼吸困難、脫毛、當(dāng)大量寄生于肝臟時，腹右側(cè)膨大，觸診表現(xiàn)疼痛。細頸囊尾蚴患病牛羊：機體消瘦，被毛逆立失去光澤，眼結(jié)膜及皮膚的顏色逐漸變淡，出現(xiàn)黃疸。病理變化腦包蟲病患病牛羊：頭骨萎縮、變薄，腦壓迫性壞死、充血，顱腔積液。棘球蚴患病牛羊：肝、肺腫大，有包囊組織；包囊內(nèi)充滿液體，可見生發(fā)囊與原頭蚴。細頸囊尾蚴患病牛羊：肝漿膜、腸系膜、大網(wǎng)膜上有蟲體泡囊，嚴重者在肺和胸腔處有蟲體。臨床結(jié)果判定綿羊、山羊、牦牛等出現(xiàn)上述臨床癥狀，并有上述流行病學(xué)史時可判定為絳蟲蚴病疑似病例。在剖檢或病理學(xué)檢查時發(fā)現(xiàn)被檢組織器官中觸診有包囊，剖開有囊壁、囊液或原頭蚴，即可確診為絳蟲蚴病例。假絳蟲蚴包囊形態(tài)學(xué)見附錄A，絳蟲蚴包囊見附錄B。實驗室診斷家畜酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測犬糞抗原水平及牛羊等中間宿主動物血清抗體水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢查法具體操作程序見附錄C。PCR診斷采用PCR方法更加準確的鑒定是否存在絳蟲蚴的感染。PCR診斷具體操作程序見附錄D。實驗室結(jié)果判定符合5.1結(jié)果陽性者判為疑似患病動物；符合5.2結(jié)果陽性者判定為患病動物。防治措施犬只防治絳蟲蚴病的防治關(guān)鍵在于預(yù)防，避免動物的感染。因絳蟲蚴病的感染源主要來自犬，從消除感染源著手采取預(yù)防措施，只要消滅犬體內(nèi)絳蟲，絳蟲蚴病可得到有效的控制。犬只驅(qū)蟲犬只按5mg～10mg/kg的劑量一次性口服吡喹酮，每4～6周驅(qū)蟲一次。投藥前犬禁食1天，然后將吡喹酮夾在食物中進行投喂，確認犬吞服后進行犬只驅(qū)蟲登記。犬只驅(qū)蟲后糞便的處理收集犬只驅(qū)蟲后5天內(nèi)的糞便，采用深埋、焚燒或10%的氫氧化鈉溶液消毒等方式進行無害化處理，防止蟲卵污染環(huán)境。嚴格犬只數(shù)量管理犬只管理機構(gòu)應(yīng)加強犬只的管理和登記，實行拴養(yǎng)、圈養(yǎng)制度，應(yīng)及時撲殺陽性犬，嚴格管控犬只數(shù)量。免疫疫苗選擇主要是免疫羊棘球蚴疫苗。疫苗的保存、運輸在2～8℃下保存，避免高溫和陽光直射，忌劇烈搖蕩。疫苗稀釋后，不能當(dāng)日用完，可在-20℃凍存，只能凍融1次，不可反復(fù)凍融使用。免疫程序按瓶簽注明的頭份，用滅菌生理鹽水稀釋，每只羊頸部皮下注射1mL；免疫程序的制定應(yīng)以羊群棘球蚴病血清抗體水平的高低為依據(jù)；妊娠母羊可以進行免疫，以使羔羊獲得良好的免疫力;未用本疫苗免疫過的羊，常間隔4周進行加強免疫；免疫過的母羊所產(chǎn)羔羊應(yīng)在16周齡進行首次免疫，20周齡進行2次免疫；未免疫過的母羊所產(chǎn)羔羊應(yīng)在8周齡進行首次免疫，12周齡進行強化免疫；免疫過的羊每12個月加強免疫1次。免疫要求體弱或患病羊禁用，疫苗注射當(dāng)日早晨應(yīng)禁飼。疫苗使用前要逐瓶檢查，確保藥瓶無破損、真空包裝完整，瓶簽上疫苗的名稱、批號、有效日期、檢驗號碼等清楚。疫苗使用前應(yīng)置于22℃～25℃環(huán)境2h，使用時充分搖勻，保持勻質(zhì)。疫苗啟封后，24h內(nèi)用完。免疫質(zhì)量控制安排專人負責(zé)監(jiān)督接種過程，發(fā)現(xiàn)漏免羊要及時補免，對免疫抗體水平不合格的羊要及時強化免疫。做好免疫記錄工作。記錄內(nèi)容包括：羊品種、年齡、疫苗的來源、批次、接種時間等。免疫效力的評價羊群在同批次疫苗接種前和免疫后3周，分別靜脈采血3mL-5mL分離血清，檢測羊的免疫抗體水平，評價免疫效果。屠宰管理按國家有關(guān)規(guī)定對牛、羊進行屠宰檢疫和產(chǎn)品檢驗。不得出售病變臟器，以及將病變臟器隨意丟棄，以免犬科動物采食。不得在屠宰場內(nèi)養(yǎng)犬，并防止犬只進入屠宰場。對病變臟器、污染物應(yīng)進行高溫高壓、焚燒或深埋等無害化處理。治療藥物治療所用藥物應(yīng)符合《獸藥管理條例》的規(guī)定。定期預(yù)防性驅(qū)蟲，要選擇對優(yōu)勢蟲種均有效的藥物。休藥期要嚴格按照說明書執(zhí)行，對未規(guī)定休藥期的藥物，休藥期不應(yīng)少于28d，具有治療方法見附錄E。手術(shù)治療腦包蟲可以采樣手術(shù)摘除，當(dāng)腦包蟲位于頭部前方表層時可實施外科手術(shù)摘除。其他管理合理搭配飼料和投喂量，保持養(yǎng)殖環(huán)境的清潔衛(wèi)生，定期清理糞便和雜草。圈舍、場地、車輛每月用3.75%次氯酸鈉溶液進行全面的殺蟲滅卵，防止犬糞污染。人員防護應(yīng)穿防護服、長筒靴子，戴手套、口罩和護目鏡等開展絳蟲蚴病相關(guān)防控工作。使用過的防護服、口罩和一次性手套采用高溫或焚燒等方式進行無害化處理，護目鏡、靴子用10%次氯酸鈉溶液消毒或者高溫進行殺蟲滅卵。

（資料性附錄）

假絳蟲蚴包囊假絳蟲蚴包囊

（資料性附錄）

絳蟲蚴包囊棘球蚴病牦牛肺臟棘球蚴病藏羊肝臟細頸囊尾蚴絳蟲蚴包囊

（規(guī)范性附錄）

酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測病原針對腦包蟲、棘球蚴、細頸囊尾蚴進行檢測，不同的病原采用不同的包被板，其余操作方法一致。待檢樣品適用于檢測動物的血清及犬糞樣品。樣品須新鮮、無污染及未變質(zhì)。操作方法犬糞樣品處理：新鮮采集的犬糞樣品，于-80℃或液氮冷凍7d，以滅活蟲卵。室溫解凍，取1g犬糞樣品加入1mL工作濃度的稀釋液，混勻形成懸濁液，3000rpm離心10min，取上清備用。制備的樣品可在2～8℃保存7天，長期保存則應(yīng)儲存于-20℃。血液樣品處理：將采血管室溫放置2小時或4℃過夜，使血清析出。4℃3000rpm離心10min，收集上清。建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。加樣：按順序依次加入待檢樣品、2孔陰性對照和2孔陽性對照，100μL/孔，覆封板膜后，置37℃孵育30min。洗滌：無菌PBST洗滌5次。一抗結(jié)合：100μL/孔加入工作濃度的單抗液，覆封板膜后，置37℃孵育30min。洗滌：無菌PBST洗滌5次。。二抗結(jié)合：100μL/孔加入工作濃度的酶標抗體，覆封板膜后，置37℃孵育30min。洗滌：無菌PBST洗滌5次。顯色：每孔加入100μLTMB顯色液，避光顯色15min。終止：50μL/孔加入終止液。讀數(shù)：酶標儀10min內(nèi)測定450nm波長處的吸光度值。結(jié)果判斷同時滿足：陽性對照OD450nm平均值≥0.60，且陽性對照OD450nm平均值>陰性對照,OD450nm平均值×2.1，方可進行判定。當(dāng)陰性對照不足0.15時按0.15計算。陽性判定：樣品OD450nm值>陰性對照OD450nm平均值×2.1。陰性判定：樣品OD450nm值≤陰性對照OD450nm平均值×2.1。

（規(guī)范性附錄）

PCR檢測試劑電泳緩沖液、基因組DNA提取試劑盒、2×PCRMix、DL2000DNAMarker、Ts-GelRed、瓊脂糖等。操作方法可疑包囊采集采集中間宿主包括家畜和野生動物絳蟲蚴可疑包囊病灶作為待檢樣本，取其整個包囊或者病灶組直接至于-20℃冷凍保存?；蚪MDNA提取按基因組DNA提取試劑盒的操作說明從樣品中提取基因組。PCR操作方法參照文獻中提及的絳蟲蚴檢測參考所涉及的蟲種鑒定檢測引物(見表1)。引物信息蟲種基因名稱引物序列5′-3′退火溫度/℃產(chǎn)物大小/bp腦包蟲CobGGGTATGGCTTTGTATTATGGTAGTT58526ATCACTCAGGCTTAATACTAACAGGAG棘球蚴COX1GTTTAGGGGCTGGTGTTGGT55546CCGTCTTCACATCCAACCCA細頸囊尾蚴nad4GTCTATTACTCGTTTTCTAAACAG551254AATCTCAACCAGACACATAAGTG擴增體系（50μL）：2×TaqPCRMasterMix25μL，上下游引物各2μL，模板4μL，ddH２O補齊為17μL，混勻后稍加離心。擴增條件：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，退火溫度退火15s，72℃延伸35s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。同時，以ddH2O代替模板DNA作為空白對照，進行PCR擴增。反應(yīng)結(jié)束后，配制1%瓊脂糖凝膠和1×TAE緩沖液，取5μL的PCR擴增產(chǎn)物在電泳儀中電泳。結(jié)果判定在同一塊瓊脂糖凝膠板上電泳后,當(dāng)DNA分子質(zhì)量標準、陰性及陽性對照同時成立時，被檢樣本