SC∕T 7227-2017 傳染性造血器官壞死病毒轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增(RT-LAMP)檢測方法

F傳染性造血器官壞死病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增(RT-LAMP)檢測方法 I1SC/T7227—2017傳染性造血器官壞死病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增(RT-LAMP)檢測方法本標準規(guī)定了傳染性造血器官壞死病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法的試劑和材料、器材和設(shè)本標準適用于傳染性造血器官壞死病毒的初檢2規(guī)范性引用文件PUB下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用女件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，具最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB/T15805.2傳染性造血器官壞死病診斷規(guī)程GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學檢測SC/T7103水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范OIE《水生動物疾病診斷手冊》(2016版)下列縮略語適用于本文件。工dNTPs:脫氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)RT-LAMP:逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增(reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplifica-RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)在IHNV基因組5401bp~5701bp區(qū)域設(shè)計6條特異引物(參見附錄A),在Bst酶的作用下，65℃恒溫擴增30min～60min,即可實現(xiàn)IHNV核酸擴增。反應(yīng)結(jié)束后，加入熒光顯色液即可通過顏色變化判定結(jié)果。5.1水：符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。220mmol/LMgSO?和0.1%TritonX-100,-20℃保存。310×ThermoPol緩沖液硫酸鎂(MgSO?)(150mmol/L)1甜菜堿(5mol/L)441111Bst酶(8U/μL)1AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/pμL)將PCR管上下顛倒，使顯色液和RT-LAMP反應(yīng)體系充分接觸。在黑色背景下觀察反應(yīng)管液體5傳染性造血器官壞死病毒RT-LAMP方法循環(huán)示意圖和擴增序列傳染性造血器官壞死病毒RT-LAMP方法循環(huán)示意圖和擴增序列見圖A.1。33-ACTGGAATCTATTTGCACAACTGAGGGCAATTCTCCTCCAGAGCCAAAAGATCAA-TGACCTTAGATAAACGTGTTGACTCCCGTTAAGAGGAGGTCTCGGTTTTCTAGTTC-GGGTAGTCTTGTACTTCACAGATCGAGGATCGAAAGAGGAATTCACCAAGTCAGGA-CCCATCAGAACATGAAGTGTCTAGCTCCTAGCTTTCTCCTTAAGTGGTTCAGTCCT33-TCCCAAGTGTAACACCGTATGCGGACTTCCTTGCCTGGATCAAGATCATCTCCCAA5'-CCCAGGCCGTGTTGATGGCAGTCATCCTCAGAGTGACCGACAAGG5'-CCCAGGCCGTGTTGATGGCAGTCATCCTCAGAGTGACCGACAAGG3'-GGGTCCGGCACAACTACCGTCAGTAGGAGTCTCACTGGCTGTICC67