QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)

QX200?微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)V4.0PCR技術的發(fā)展歷程普通PCR定性定量PCR相對定量數(shù)字PCR絕對定量數(shù)字PCR時代來臨2011/10數(shù)字PCR時代來臨2012/06數(shù)字PCR時代來臨2012/07數(shù)字PCR時代來臨2013/09微滴式數(shù)字PCR用于核酸標準物質定量微滴式數(shù)字PCR用于核酸標準物質定量數(shù)字PCR發(fā)展歷程V4.0數(shù)字PCR背景BertVogelstein著名腫瘤學家微陣列芯片式數(shù)字PCR均一性差成本高通量低BIO-RAD微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)微滴分析儀微滴發(fā)生器2011年7月2012年3月2012年6月2012年12月QX100上市2012年度讀者選擇實驗設備獎2012年度R&D100創(chuàng)新獎——美國科技界的奧斯卡2012年度北美數(shù)字PCR技術市場領導獎QX100/200?獲得獎項QX100/200?用戶分布全球各地微滴式數(shù)字PCR技術原理V4.0配制反應液將引物、探針、DNA模板、ddPCR

supermix配制成20ul反應液，加入到微滴發(fā)生卡上1引物和探針ddPCR反應液DNA模板DG8微滴發(fā)生卡檢測微滴將96孔板放入微滴分析儀，順序吸取每個樣品的微滴并隨載液流逐一通過雙色檢測器4

分析數(shù)據(jù)有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的微滴為陰性，軟件記錄每個樣品里陽性微滴的比例5微滴分析器

顯示結果軟件自動分析數(shù)據(jù)，并以多種方式顯示檢測結果6PCR擴增將微滴轉移到96孔PCR板上，于PCR儀上進行擴增3PCR熱循環(huán)儀制備微滴將微滴反生卡放入微滴生成器，在2.5分鐘內將每個20ul反應液分成20000個微滴2微滴生成器微滴式數(shù)字PCR的基本流程生成均一化的微滴將含有樣品的預混液和油加入微滴發(fā)生卡的指定位置，并放入微滴發(fā)生器內。每個樣品可生成20,000個微滴，8個樣品大約需2.5分鐘將PCR反應板直接放入微滴分析儀，自動對樣品進行逐個分析每個微滴逐個通過檢測器，每小時可完成32個樣品的檢測快速微滴檢測數(shù)字化結果——無需標準曲線實現(xiàn)絕對定量EverypartitionisanindividualreactionvesselEnd-pointPCRIfapartitionhasatargetmoleculeitwillbereadasapositiveIfapartitionhasnotargetmoleculesitwillbereadas

anegativeInquantitativePCR(qPCR)—timecourse,quantificationcycle(Cq)orthresholdcycle(CT),

standardcurves微滴式數(shù)字PCR提高檢測靈敏度為什么提高了靈敏度BulkSample–20μL40,000wildtypemolecules40mutantmolecules19,960dropletsw/omutant40dropletsw/mutantPartitionedSample–20,000×1nLMutantabundance0.1%Mutantabundance33%精準的定量結果和極佳的重復性精準的定量結果和極佳的重復性zoominEachdatapoint=metawell1S.aureusdilutions(copies/ul)ConstanthumangDNA(RPP30)88,0002倍梯度稀釋精準的定量結果和極佳的重復性S.aureusdilutions(copies/ul)ConstanthumangDNA(RPP30)zoomedin1.1倍梯度稀釋QX200?微滴式數(shù)字PCR特點絕對定量，不依賴Ct值，無需標準曲線

兼容染料法和探針法，同時滿足科學研究和臨床檢測要求適用復雜樣品檢測，不易受PCR擴增效率影響超高靈敏度，可檢測單拷貝模板精準的定量結果和極佳的重復性微滴式數(shù)字PCR應用介紹V4.0——稀有事件檢測（RED）方法：

采用ddPCR雙重檢測，引物/探針序列與qPCR相同 hmg基因作為野生型玉米內參基因

MON810引物探針用于特異性檢測MON810轉基因事件結論：

ddPCR的線性范圍足夠覆蓋日常的GMO檢測范圍，無需對樣品進行酶切aLOQ與aLOD方面，ddPCR的結果優(yōu)于qPCR

與qPCR相比，ddPCR結果的真實度更高微滴式數(shù)字PCR用于轉基因檢測ddPCR雙重實驗檢測轉基因物質的線性范圍涵蓋了實驗室常規(guī)GMO檢測的所有濃度范圍

(0.1%to100%transgene/endogeneratiocp/cp).ddPCR雙重檢測MON810/hmg的線性范圍與qPCR用兩個單重實驗檢測的結果相近，與cdPCR（2－3個數(shù)量級）相比線性范圍更廣。.TheddPCRresponseforhmgwaslinearfrom5to118,000hmgcopies(R2=0.9990).TheddPCRresponseforMON810waslinearfrom6to4,340MON810copies(R2=0.9993)微滴式數(shù)字PCR用于轉基因檢測Intra-andinter-cartridgerepeatabilityoftheddPCRwasassessedbytwodifferentoperatorsandovertwodifferentdaysforMON810contentdetermination.Sevenreplicateswereappliedpercartridge.Lessthan10%variabilitywasobservedwithineachofthefivecartridgesforthedeterminationofMON810content.微滴式數(shù)字PCR用于轉基因檢測微滴式數(shù)字PCR用于外周血中基因突變檢測微滴式數(shù)字PCR用于外周血中基因突變檢測微滴式數(shù)字PCR應用介紹V4.0——拷貝數(shù)變異檢測（CNV）準確檢測MRGPRX1基因拷貝數(shù)ddPCRIndividual

WellsddPCRMergedWells(6wells)MeasureMRGPRX1genecopiesfromvarioussamples56Copynumber123456IncreasedprecisionwithmergedwellsSampleSampleSignificance:Neurologicaldiseaseandfemalefertilityhavebeenlinkedtoastructurallycomplexregionofchromosome17(17q21.31).Problem:17q21.31hasinversionsandCNVsthataredifficulttoevaluateacrosspopulationsbecauseoftechnologicallimitations.NGSisusefulbutveryexpensive.Solution:ddPCRenableseasyvalidationandstudyofCNVsdiscoveredbysequencingfromastructurallycomplexlocusacrosspatientcohorts.NatureGenetics2012ddPCRconfirmsNGSandscreenswithsensitivityforCNV.微滴式數(shù)字PCR用于NGS結果確認Copynumberanalysisof3regionsof17q21.31bywhole-genomesequencing(b–d)and

byddPCR(e–g)Copynumberdeterminationin234samplesbyNGSandddPCRis>99%concordant(h–j)ddPCRprovidesaneasy,inexpensive,andaccuratewaytovalidateandfurtherstudyCNVsdiscoveredbyNGSBoettgerLMetal.(2012).Structuralhaplotypesandrecentevolutionofthehuman17q21.31region.NatGenet

44,881–885.微滴式數(shù)字PCR與NGS結果高度吻合微滴式數(shù)字PCR用于22q11.2微缺失征檢測微滴式數(shù)字PCR用于22q11.2微缺失征檢測微滴式數(shù)字PCR應用介紹V4.0——病原微生物檢測微滴式數(shù)字PCR用于全球首例“功能性治愈”艾滋病嬰兒TheProblem

AninfantwasbornHIVpositivebut2yearslaterhasnodetectablevirusbytraditionalmethodsNeedextremelysensitivequantificationofHIVgenomesinpatientsTheSolutionDevelopanultra-sensitiveHIVgenomedetectionprotocolusingddPCRAllowforconfirmationofastateoffunctionalHIVcureFunctionalHIVCureafterVeryEarlyARTofanInfectedInfantDeborahPersaud*1,HGay2,CZiemniak1,YHChen1,MPiatak3,T-WChun4,MStrain5,DRichman5,andKLuzuriaga61JohnsHopkinsUnivSchofMed,Baltimore,MD,US;2UnivofMississippiMedCtr,Jackson,US;3FrederickNatlLabforCancerRes,MD,US;4NIAID,NIH,Bethesda,MD,US;5UnivofCaliforniaSanDiego,LaJollaandVASanDiegoHlthcareSystem,US;and6UnivofMassachusettsMedSch,Worcester,US微滴式數(shù)字PCR用于全球首例“功能性治愈”艾滋病嬰兒ApproachInfantinfectionconfirmedbypositiveHIVDNA/RNAtestingon2nddayoflifePlasmaviralloadtestspositiveondaysoflife7,12,20Reachedundetectablelevelsatage29daysUltrasensitiveHIVDNA(dropletdigitalPCR),plasmaviralload(singlecopy)assays,andquantitativeco-cultureassaysweredoneatage24and26monthstoassessHIVpersistenceAgeHIVDNAdetectedbyddPCRReplication-competentvi