轉(zhuǎn)染HO-1對酒精誘導的成骨細胞損傷的保護作用

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血紅素加氧酶1（HO-1）屬于一種熱休克蛋白，是血紅素分解的限速酶，能將血紅素分解為膽綠素、CO和NO等，能夠被多種氧化應激因素和細胞因子激活，在體內(nèi)具有抗氧化、抗炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)等重要作用[1]，對動植物均具有保護作用。大量臨床研究證實長期過量酒精暴露的人群，其發(fā)生骨代謝紊亂、骨質(zhì)疏松或股骨頭壞死的概率明顯高于正常人群[2-3]。另有研究發(fā)現(xiàn)酒精能夠增加骨折發(fā)生的風險并且減緩骨折的愈合[4]。近年有研究發(fā)現(xiàn)酒精對骨代謝的影響與酒精引起的氧化應激反應[5-6]有密切關系。因而本次研究嘗試將人HO-1轉(zhuǎn)染進入體外培養(yǎng)的人成骨細胞中，觀察轉(zhuǎn)染HO-1基因后人成骨細胞對酒精的耐受性及細胞分泌BMP-2和TGF-β1水平的影響，從而為HO-1能否用作治療酒精性骨代謝疾病的生物制劑提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）、MTT（Sigma公司），AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天），HO-1真核表達質(zhì)粒（BiovectorscienceLab），MDA、ROS檢和SOD檢測試劑盒（碧云天），BMP-2和TGF-β1ELISA檢測試劑盒（R&DSystems，Inc.），AccuriC6流式細胞儀（BDBiosciences），723分光光度計（上海光譜儀器有限公司），Sunrise酶標儀（Tecan公司），930A熒光分光光度計（上海三科儀器有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1人成骨細胞的分離培養(yǎng)參照楊玉生等[7]的方法分離培養(yǎng)正常人成骨細胞。將分離的成骨細胞充分打散后懸于DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.2人成骨細胞HO-1轉(zhuǎn)染和實驗分組取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度為1×104/mL接種于96孔板中，當細胞鋪滿>80%時，按照Lipofectamine2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行操作，設置空白對照組（未轉(zhuǎn)染）、100nmol/LHO-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，每組設6個平行樣。轉(zhuǎn)染24h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。實驗中設置陰性對照組（不加酒精、未轉(zhuǎn)染HO-1），陽性對照組（加100mmol/L酒精、未轉(zhuǎn)染HO-1）和HO-1轉(zhuǎn)染組（加100mmol/L酒精、轉(zhuǎn)染HO-1），實驗中酒精濃度參考文獻[5]。

1.2.3MTT檢測細胞活性各組細胞酒精暴露24h后，每孔加入20μL5mg/mLMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，加150μLDMSO，室溫下震蕩10min，用酶標儀于490nm測定各孔的吸光度值（OD值）。細胞活性=（實驗組OD值/陰性對照組OD值）×100%。

1.2.4細胞中ROS測定調(diào)整細胞濃度至2×105/mL，接種于已放有滅菌蓋玻片的6孔板中，細胞轉(zhuǎn)染及分組情況同1.2.2。酒精作用24h后，PBS緩沖液漂洗蓋玻片2次，按照ROS檢測試劑盒說明進行操作，熒光分光光度計測定各組細胞的熒光強度。

1.2.5細胞中MDA和SOD含量的測定調(diào)整細胞濃度至1×106/mL，接種于6孔板中，細胞轉(zhuǎn)染和分組同1.2.2。酒精作用24h后，首先收集細胞培養(yǎng)液上清液用于BMP-2和TGF-β1的檢測，然后收集細胞并超聲粉碎細胞，提取細胞蛋白。按照MDA和SOD試劑盒說明分別檢測細胞中MDA和SOD的含量。

1.2.6ELISA法檢測細胞上清液中BMP-2和TGF-β1將1.2.5中收集的細胞上清液采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測細胞分泌的BMP-2和TGF-β1。嚴格按照試劑盒說明配制標準品及樣品，用酶標儀測定各樣品的吸光度值，并計算細胞中BMP-2和TGF-β1相應的含量。

1.3統(tǒng)計學方法

計量資料均以均數(shù)±標準差（x±s）表示。采用spss13.0進行統(tǒng)計學分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），兩組間比較時，方差齊采用SNK法，方差不齊采用Games-Howell法。以P

2結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染HO-1后成骨細胞形態(tài)

轉(zhuǎn)染HO-1質(zhì)粒24h后，熒光顯微鏡下觀察成骨細胞形態(tài)，可見成骨細胞正常貼壁生長，細胞呈多邊形，四周有多個突起，熒光物質(zhì)均勻分布于成骨細胞胞漿中，見圖1。

2.2細胞活性檢測結(jié)果

100mmol/L酒精作用24h，陽性對照組和HO-1轉(zhuǎn)染組的相對細胞活性為（40.33±9.18）%和（67.35±6.90）%。與陰性對照組相比，酒精作用后陽性對照組和HO-1轉(zhuǎn)染組細胞活性均明顯降低（P

2.3細胞中ROS、SOD和MDA檢測結(jié)果

酒精作用成骨細胞24h，細胞中ROS、SOD和MDA的含量變化見表1。100mmol/L酒精作用于成骨細胞后，ROS和MDA含量均較陰性對照組明顯升高（P當酒精作用于轉(zhuǎn)染HO-1成骨細胞后，雖然ROS、SOD和MDA變化與陽性對照組相似（與陰性對照組相比），但與陽性對照組相比，ROS和MDA升高量明顯降低，SOD活力明顯升高（P

2.4細胞中BMP-2和TGF-1含量檢測結(jié)果

與陰性對照組相比，陽性對照組和HO-1轉(zhuǎn)染組酒精作用24h，細胞中BMP-2和TGF-β1水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P

3討論

雖然適量的飲酒對骨代謝是有益處的[8]，但長期過量飲酒則能引起機體骨質(zhì)丟失，且研究證實飲酒已成為骨質(zhì)疏松和股骨頭壞死的重要危險因素[2]。酒精對骨代謝的機制主要包括：（1）酒精能夠抑制成骨細胞的活性和增殖，同時還能抑制其前體細胞形成[9];（2）酒精能誘導骨髓基質(zhì)細胞分化為脂肪細胞，減少成骨細胞的分化[10]，即酒精致骨髓基質(zhì)細胞成脂分化學說;（3）酒精能干擾體內(nèi)其他激素的活性，如PTH、糖皮質(zhì)激素等。

HO是廣泛存在于動植物體內(nèi)的微粒體酶系統(tǒng)，參與多種生理病理過程，包括三種同工酶HO-1、HO-2和HO-3。HO-1為誘導性，能被氧化應激和炎性反應因子等激活，具有非常強的抗氧化損傷、抗炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)能力[1]。有研究發(fā)現(xiàn)HO-1不僅能夠誘導骨髓基質(zhì)細胞分化為成骨細胞[11]，而且HO-1能夠通過抑制巨噬細胞集落刺激因子受體c-fms而抑制破骨細胞前體細胞分化為破骨細胞，從而減少骨吸收[12]。本實驗中，筆者利用基因轉(zhuǎn)染技術將HO-1轉(zhuǎn)染到人成骨細胞中，使細胞中HO-1特異性高表達，從而觀察其對酒精損傷作用的耐受性，研究特異轉(zhuǎn)染HO-1是否能夠?qū)凭T導的成骨細胞損傷有抑制作用。本次研究中MTT結(jié)果顯示，與陰性對照組細胞相比，雖然HO-1轉(zhuǎn)染組細胞活性也明顯降低，其細胞活性卻明顯高于陽性對照組細胞活性。由此可見，當人成骨細胞轉(zhuǎn)染HO-1后，細胞抵抗酒精損傷的能力明顯增強。據(jù)此筆者推測，HO-1特異性高表達后能夠有效抑制酒精對成骨細胞的損傷作用，對成骨細胞起到保護作用。

成骨細胞能夠分泌骨形成蛋白（BMP）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），在骨的形成和修復中起重要作用[13]。其中TGF-β1與骨的代謝關系最密切，調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖并誘導其向成骨細胞分化。BMP-2具有較強的誘導成骨細胞分化能力，也能夠誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化，是公認的高效的成骨誘導因子[14]。有研究發(fā)現(xiàn)骨折4周后，骨痂中BMP-2和TGF-β的表達量均已明顯降低，進而延緩骨折的修復和愈合，由此可見骨折后，BMP-2和TGF-β表達過低是導致骨質(zhì)疏松骨折愈合緩慢的可能原因之一[15]。本次實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HO-1組成骨細胞中的BMP-2和TGF-β1表達量明顯高于陽性對照組。這一結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染HO-1不僅可以增強酒精作用后成骨細胞的活性，同時還能使成骨細胞中BMP-2和TGF-β1增加。筆者推測轉(zhuǎn)染HO-1可以加速酒精誘導的骨質(zhì)疏松和骨折的愈合，但還有待進一步的實驗證明。

氧化應激是機體內(nèi)氧化與抗氧化作用的失衡，能夠?qū)C體造成脂質(zhì)過氧化、DNA氧化損傷等危害。ROS是引起機體發(fā)生氧化應激的重要氧化物質(zhì)，MDA則是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，而SOD則是機體重要的抗氧化酶。這些物質(zhì)的變化能夠直接反映機體氧化平衡狀態(tài)。已有的研究表明大量的酒精能夠使機體氧化水平升高，而抗氧能力下降，當抑制體內(nèi)氧化物質(zhì)形成時，則能改善酒精引起的骨損傷作用[3]。HO具有較強的抗氧化作用，因而當機體內(nèi)發(fā)生氧化應激反應時

，HO系統(tǒng)被激活而發(fā)揮抗氧化作用，減少氧化應激反應對機體的損傷。本次研究結(jié)果顯示，當酒精作用于成骨細胞后，陽性對照組成骨細胞中的ROS和MDA含量明顯高于陰性對照組，本次實驗結(jié)果證實酒精能夠誘導成骨細胞發(fā)生氧化應激反應，與以往的研究相一致[5]。但本次實驗中HO-1轉(zhuǎn)染組成骨細胞中ROS和MDA含量明顯低于陽性對照組，而SOD含量則明顯高于陽性對照組，由此可見轉(zhuǎn)染HO-1能夠明顯地抑制酒精誘導的成骨細胞氧化應激反應，對成骨細胞起到保護作用。

總之，本次實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染HO-1能夠增強酒精作用后成骨細胞的活性，對成骨細胞有保護作用。其保護作用機制可能與HO-1抑制酒精誘導的成骨細胞氧化應激反應有關。另外HO-1轉(zhuǎn)染后成骨細胞BMP-2和TGF-β1的分泌的量明顯增加，增強間充質(zhì)細胞成骨分化，進而提高機體對酒精造成的骨損傷的修復能力。

參考文獻

[1]AraujoJA，ZhangM，YinF.Hemeoxygenase-1