雄黃對肝癌細(xì)胞株QGY-7703增殖和凋亡的影響

雄黃對肝癌細(xì)胞株QGY-7703增殖和凋亡的影響摘要]目的研究中藥雄黃主要成分As2S2對人肝癌細(xì)胞株QGY-7703增值和凋亡的影響及其可能機(jī)制。方法2024年9月—2024年4月，分析不同濃度的As2S2處理QGY-7703細(xì)胞后，MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測PCNA的表達(dá)情況。結(jié)果較低濃度（7.5mg/L）的As2S2對QGY-7703細(xì)胞的生長無影響；15~120mg/L的As2S2可抑制細(xì)胞的生長，具有時間依賴性和濃度依賴性（P

關(guān)鍵詞 雄黃；肝細(xì)胞癌；凋亡

[中圖分類號]R736[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1674-074２（２０１5）01（b）－０012-02

雄黃的主要成分為As2S2，具有解毒殺蟲、燥濕祛痰、截瘧的功效[1]，常用來治療癰腫療瘡、蛇蟲咬傷、蟲積腹痛、驚癇和瘧疾等疾病。近年來，As2O3在白血病的治療中療效顯著，已被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的研究和臨床治療。作為毒性更小的含砷化合物，雄黃及其復(fù)方制劑在白血病治療中也取得了可喜的成績[2]，其抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制的研究也越來越深入[3]。但有關(guān)雄黃對實(shí)體瘤的報道較少。自2024年9月—2024年4月，該實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞株QGY-7703細(xì)胞為研究對象，探討雄黃的主要成分As2S2對肝癌細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

As2S2（純度98％）購自美國Sigma公司，配制方法參照文獻(xiàn)4，RPMI1640袋裝培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，小牛血清購自杭州四季青生物公司，DMSO及MTT購自美國Amresco公司，AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國Beckman公司，鼠抗人PCNA單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。人肝癌細(xì)胞株QGY-7703由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株QGY-7703常規(guī)復(fù)蘇后用含10%新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液中分別含有青霉素、鏈霉素各100U/mL。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法觀察As2S2對肝癌細(xì)胞株增殖的影響

將QGY-7703細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3.0×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)（200μL/孔），同時設(shè)實(shí)驗(yàn)組（不同濃度的As2S2處理）、對照組（不加藥物的細(xì)胞）和空白組（調(diào)零），每組設(shè)5個復(fù)孔。次日細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組棄去培養(yǎng)液加不同濃度的As2S2，培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入MTT液20μL（5g/L），于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸去上清液，每孔加入DMSO150μL，震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm波長處測定其吸光度（A）值，按公式計算：細(xì)胞增殖抑制率＝(1－實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。

1.4流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察As2S2對肝癌細(xì)胞株凋亡的影響

胰蛋白酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，以1.0×105個/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)（2.5mL/孔）。次日細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度As2S2的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)48h、72h后，棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組分別加入AnnexinV(FITC標(biāo)記)5μL、PI2.5μL，避光冰上孵育10min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測PCNA的表達(dá)

胰蛋白酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，以4×104個/mL的密度接種于預(yù)置玻片（經(jīng)多聚賴氨酸處理）的6孔培養(yǎng)板內(nèi)（2.5mL/孔），置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。次日細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組棄去培養(yǎng)液，每孔重新加入含不同濃度As2S2的培養(yǎng)基2.5mL，使As2S2終濃度分別為15mg/L、30mg/L。培養(yǎng)48h后，取出玻片按SABC法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，按試劑盒說明書操作，PBS代替一抗作陰性對照。

1.6統(tǒng)計方法

采用spss13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用單向方差分析(One-wayANOVA)，各實(shí)驗(yàn)組與對照組間比較用LSD法。

2結(jié)果

2.1As2S2對QGY-7703細(xì)胞增殖的影響

7.5mg/LAs2S2對QGY-7703細(xì)胞生長無影響（P>0.05）。15~120mg/L的As2S2可抑制細(xì)胞的生長，且在此范圍內(nèi)抑制率隨著濃度增加而增加，具有時間依賴性和濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P

2.2流式細(xì)胞儀檢測As2S2對QGY-7703細(xì)胞凋亡的影響

如表1所示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率呈不同程度上升，與此同時，活細(xì)胞數(shù)隨雄黃濃度增高而急劇下降。As2S2在15~30mg/L范圍內(nèi)，細(xì)胞凋亡率隨濃度增加而增加，而繼發(fā)性壞死細(xì)胞比例也在增加。60mg/L組出現(xiàn)細(xì)胞凋亡率較低濃度組減低，表現(xiàn)為繼發(fā)性壞死細(xì)胞增多。

2.3免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測As2S2對QGY-7703細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響

PCNA蛋白陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞核。凡細(xì)胞核內(nèi)見有均勻一致分布的棕黃色顆粒，胞漿不著色者即為陽性細(xì)胞。As2S2處理組可明顯降低PCNA蛋白的陽性表達(dá)(見表2)。與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P3討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，預(yù)后差。以化療為主的綜合治療對于不能手術(shù)切除的肝癌仍是目前主要的治療手段。但由于傳統(tǒng)化療藥物存在副作用大、敏感性低、易產(chǎn)生多藥耐藥性等缺點(diǎn)而效果不佳，因此尋求新的有效的化療藥物對于肝癌的治療有重要意義。

近年來，雄黃在臨床上已成功用于白血病的治療，并開始應(yīng)用于抗其它血液系統(tǒng)惡性腫瘤及實(shí)體瘤的研究。龐琦等[5]建立膠質(zhì)瘤動物模型，雄黃局部注射治療腫瘤，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)雄黃對肺腺癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞都有抑制增值并誘導(dǎo)凋亡的作用[6-10]。目前研究認(rèn)為雄黃抗腫瘤作用的機(jī)制可能為：①誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；②抑制腫瘤細(xì)胞增殖；③促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化；④抗腫瘤血管生成[3]。

張晨[11]報道，雄黃對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402有明顯細(xì)胞毒作用，不僅可抑制肝癌細(xì)胞的生長增殖，并且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)組中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的兩種蛋白Ap02.7和Fas均有表達(dá)增加的趨勢。黃姣娥等[12]報道雄黃對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的抗腫瘤作用機(jī)制與升高細(xì)胞內(nèi)鈣、降低細(xì)胞線粒體膜電位并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

該實(shí)驗(yàn)通過MTT法也觀察到相似的結(jié)果，在15~120mg/L濃度范圍內(nèi)，As2S2能抑制QGY-7703細(xì)胞的生長，抑制作用隨著藥物濃度的提高、作用時間的延長而增強(qiáng)，呈時效和量效關(guān)系。該研究免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)的QGY-7703細(xì)胞，PCNA陽性表達(dá)率較高，經(jīng)As2S2作用48h后，PCNA的表達(dá)明顯下降，其降低程度與藥物濃度呈明顯的正相關(guān)。據(jù)此推測，As2S2抑制細(xì)胞增殖的可能機(jī)制之一是抑制了參與DNA合成的PCNA，從而導(dǎo)致DNA合成受阻，進(jìn)而抑制了細(xì)胞增殖。

該研究中，QGY-7703細(xì)胞的自發(fā)凋亡率較低，可部分解釋肝癌對放療敏感性較差這一現(xiàn)象。As2S2以15mg/L、30mg/L、60mg/L三個濃度分別作用于QGY-7703細(xì)胞48h、72h。與對照組比較，試驗(yàn)組QGY-7703細(xì)胞的凋亡率不同程度增加，但并非呈時間依賴性和濃度依賴性。隨著藥物濃度的提高和作用時間的延長，細(xì)胞凋亡率反而降低，表現(xiàn)為以繼發(fā)性壞死細(xì)胞為主。表明As2S2在一定的濃度范圍內(nèi)具有誘導(dǎo)QGY-7703細(xì)胞凋亡的作用，但隨著作用時間增加和濃度的提高則表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死。

該實(shí)驗(yàn)僅是雄黃對肝癌細(xì)胞作用的初步研究，因其未設(shè)陽性對照組，僅以一株肝癌細(xì)胞為研究對象，且尚未進(jìn)行動物體內(nèi)的抑瘤實(shí)驗(yàn)，有待今后增加對肝癌細(xì)胞系的研究，并對其機(jī)制作進(jìn)一步深入探討。

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