CCl4慢性肝損致無白蛋白受體鼠對(duì)移植骨髓細(xì)胞肝細(xì)胞增殖的影響

1/1CCl4慢性肝損致無白蛋白受體鼠對(duì)移植骨髓細(xì)胞肝細(xì)胞增殖的影響CCl4慢性肝損致無白蛋白受體鼠對(duì)移植骨髓細(xì)胞肝細(xì)胞增殖的影響慢性肝損致無白蛋白受體鼠對(duì)移植骨髓細(xì)胞肝細(xì)胞增殖的影響CCl4慢性肝損致無白蛋白受體鼠對(duì)移植骨髓細(xì)胞肝細(xì)胞增殖的影響作者：

夏焱，姜波健，俞繼衛(wèi)，張彪，李鋒作者單位：

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院普外科，上海201900上海市衛(wèi)生局基金資助項(xiàng)目（2008143）【摘要】目的觀察和研究F344來源的骨髓細(xì)胞（bonemarrowcells，BMCs）能否駐存于-全身照射的先天性無白蛋白大鼠的骨髓，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為產(chǎn)白蛋白肝細(xì)胞，移植后給予四氯化碳（carbontetracholoride，CCl4）后對(duì)這些細(xì)胞增殖的影響。

方法雄性F344大鼠為供體，而雄性F344alb（先天性無白蛋白大鼠）為受體，分為4組：

組Ⅰ（n＝10）為正常對(duì)照組，不接受肝損處理，無全身射線照射和陰莖靜脈骨髓細(xì)胞移植；組Ⅱ（n＝10）為肝損無移植組，只接受肝損處理，無全身射線照射和陰莖靜脈骨髓細(xì)胞移植；組Ⅲ（n＝10）為正常移植組，全身射線照射后陰莖靜脈移植骨髓細(xì)胞1107；組Ⅳ（n=10）為肝損移植組，接受CCl4注射肝損，全身射線照射后陰莖靜脈骨髓細(xì)胞移植1107BMCs，其中，-照射劑量為7.5Gy，F(xiàn)344大鼠的BMCs經(jīng)受體的陰莖靜脈注入。

移植后四周，CCl4腹腔內(nèi)注射鑄成大鼠慢性肝損模型，細(xì)胞移植12周后，處死大鼠。

肝臟切片用抗白蛋白抗體行白蛋白免疫染色，檢測(cè)從受體骨髓細(xì)胞和肝臟切片中呈多于6個(gè)白蛋白陽性簇狀分布的肝細(xì)胞群中提取的DNA和血清中白蛋白的水平。

結(jié)果①盡管組Ⅰ肝臟切片可發(fā)現(xiàn)少量散在的1個(gè)或2個(gè)白蛋白陽性肝細(xì)胞，但是白蛋白陽性肝細(xì)胞呈多于6個(gè)的簇狀分布僅發(fā)現(xiàn)于射線全身照射后接受BMCs移植的肝切片中（組Ⅲ和組Ⅳ），而且組Ⅳ中呈多于6個(gè)的簇狀分布的肝細(xì)胞數(shù)明顯多于組Ⅲ，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

②從F344alb受體（組Ⅲ和組Ⅳ）骨髓細(xì)胞及肝臟切片中微切的呈多于6個(gè)白蛋白陽性簇狀分布的肝細(xì)胞群中提取的DNA中可檢測(cè)到正常的白蛋白基因序列。

③組Ⅳ較組Ⅲ血清中白蛋白水平顯著升高。

結(jié)論①F344來源的骨髓細(xì)胞移植入全身射線照射的F344alb受體，可駐存于F344alb受體的骨髓內(nèi)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為產(chǎn)白蛋白的肝細(xì)胞。

②F344來源的骨髓細(xì)胞移植入全身射線照射的F344alb受體，4周后CCl4腹腔內(nèi)注射鑄成大鼠慢性肝損模型可明顯增加骨髓細(xì)胞的增殖。

③全身射線照射后移植F344供體骨髓細(xì)胞，之后CCl4腹腔內(nèi)注射鑄成大鼠慢性肝損模型的F344alb受體的外周血中白蛋白水平可明顯提高。

【關(guān)鍵詞】骨髓細(xì)胞；移植；肝細(xì)胞；先天性無白蛋白；白蛋白；基因；-全身照射；四氯化碳；大鼠EffectofanalbuminemicrecipientratsresultedfromchronichepaticdamagecausedbyCCl4ontheproliferationofhepatocytederivedfrombonemarrowcellstransplantedintotheanalbuminemicratsXIAYan，JIANGBojian，YUJiwei，etal.DeptofGeneralSurgery，NO.3People’sHospital，SchoolofMedicine，ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai201900AbstractObjectiveToobserveandinvestigatewhetherBMCsderivedfromF344canharborinthebonemarrowcells(BMCs)congenicNagase’sanalbuminemicrats(F344alb)recipientswhohadundergone-irradiationandcanfurtherraisealbumin-producinghepatocytesintheliver.MethodsSixweeksoldmaleFischer344rats(F344)wereusedasdonors，andsixweeksoldmaleF344albasrecipients.AllF344albweredividedinto4groups：

groupⅠ(n=10)wasuntreated；groupⅡ(n=10)wastreatedwithCCl4butno-irradiationandtransplantation；groupⅢ(n=10)wastransplantedwith1107BMCsafter-irradiation，butwithoutCCl4treatment；groupⅣ(n=10)wastransplantedwith1107BMCsafter-irradiation，withCCl4treatment.TheBMCspreparedfromthedonorswereinfusedviathepenialveinsofrecipientsimmediatelyafterwholebody-irradiation(7.5Gy)andCCl4treatment：

4weeksafterBMCstransplantation，CCl4wereinjectedintoperitonealcavitytwiceaweekfor4weeks.Animalsweresacrificedinthe12thweeksaftertransplantation.Slicesoftheliverwerestainedbyalbuminimmunostainingwithanti-ratalbuminantibody.DNAextractedfromBMCsanddissectedalb+clustersconsistingofmorethan6alb+hepatocytesaswellasserumalbuminlevelsofrecipientswereexamined.Results①Althoughsingleordoublecellsofalbuminpositive(alb+)hepatocyteswereseenintheliversofuntreatedF344alb(groupⅠ)，clustersconsistingofmorethan6alb+hepatocyteswereonlydetectedintheliversofrecipientsthatreceivedtransplantationofBMCsafter-irradiationwithorwithoutCCl4liverdamage(groupⅢandⅣ).②ThenormalgenesequenceofalbuminwasdetectedinBMCsofF344albrecipientsanddissectedalb+clustersconsistingofmorethan6alb+hepatocytesinF344albtransplantedwithBMCsafter-irradiation(groupⅢandⅣ).③SerumalbuminlevelsofF344albrecipientsingroupⅢandⅣweresignificantlyincreased.Conclusion①ThesefindingsindicatethatBMCscanharborinBMCsoftheF344albrecipients-irradiatedandfurthermorecanraisealbumin-producinghepatocytesintheliver.②AfterBMCstransplantation，liverdamagebyCCl4canindeedpromotetheproliferationoftheBMCsinliver.Keywordsbonemarrowcells；transplantation；hepatocytes；analbuminemic；albumin；gene；-wholebodyirradiation；carbontetracholoride；rats肝臟疾病是危害人類健康的一類重要疾病。

目前，干細(xì)胞移植的研究是熱點(diǎn)，也為肝病的治療帶來了新的希望。

本研究應(yīng)用骨髓細(xì)胞移植技術(shù)，通過移植后的肝損模型，期望發(fā)現(xiàn)并證實(shí)移植后的骨髓細(xì)胞增殖條件，為骨髓細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法1.1動(dòng)物處理雄性F344大鼠購自日本橫濱（Yokohama，Japan），而F344alb則由日本旭川醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)室培育。

6到7周齡的雄性F344大鼠作為供體，同時(shí)6到7周齡的雄性F344alb大鼠作為受體。

分為4組：

組Ⅰ（n＝10）為正常對(duì)照組，不接受肝損處理，無全身射線照射和陰莖靜脈骨髓細(xì)胞移植；組Ⅱ（n＝10）為肝損無移植組，只接受肝損處理，無全身射線照射和陰莖靜脈骨髓細(xì)胞移植；組Ⅲ（n＝10）為正常移植組，全身射線照射后陰莖靜脈移植骨髓細(xì)胞1107；組Ⅳ（n=10）為肝損移植組，接受CCl4注射肝損，全身射線照射和陰莖靜脈骨髓細(xì)胞移植1107BMCs，其中，-照射劑量為7.5Gy，F(xiàn)344大鼠的BMCs經(jīng)受體的陰莖靜脈注入。

移植后四周，四氯化碳（carbontetracholoride，CCl4）腹腔內(nèi)注射鑄成大鼠慢性肝損模型，細(xì)胞移植12周后，處死大鼠。

肝臟切片用抗白蛋白抗體行白蛋白免疫染色，檢測(cè)從受體骨髓細(xì)胞和肝臟切片中呈多于6個(gè)白蛋白陽性簇狀分布的肝細(xì)胞群中提取的DNA和血清中白蛋白的水平。

1.2供體骨髓細(xì)胞的制備取出供體的股骨，用18號(hào)注射針頭以含有4%胎牛血清的DMEM液（Dulbecco’smodifiedEaglemedium，Gibco-BRL，Grand-Island，NY）沖洗骨髓腔，經(jīng)離心后用Histopache提取骨髓細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)片計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，錐蟲藍(lán)染色測(cè)活率85%以上。

1.3白蛋白的免疫染色肝臟用PLP（periodate-lysine-paraformaldehydesolution）經(jīng)門靜脈灌流[1]，組織切片后浸泡于PLP中過夜，經(jīng)梯度的酒精處理再石蠟包埋。

組織切成3?滋m的薄片，經(jīng)下述處理：

脫蠟，浸泡于3%H2O25min，與1/800稀釋的兔抗大鼠抗體（Cappel，Malvern，PA）孵育，再與辣根過氧化酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG多聚物（Dako，CA）孵育，經(jīng)PBS（phosphate-bufferedsaline）漂洗后用DAB底物（Dako）顯色，再用蘇木精復(fù)染。

白蛋白染色陽性的肝細(xì)胞分成4種：

單個(gè)細(xì)胞陽性，兩個(gè)細(xì)胞陽性，3~5個(gè)細(xì)胞陽性，6個(gè)細(xì)胞陽性。

顯微鏡下白蛋白染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，用ScionImage軟件計(jì)算出每平方厘米白蛋白染色陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4PCR檢測(cè)白蛋白的基因序列從F344alb大鼠骨髓細(xì)胞中提取DNA，PCR條件：

38個(gè)循環(huán)，94℃30s，58℃30s和72℃1min。

引物序列，5-GAAGGCGATCCTCCTGCCTGC-3(forward)及5-CCACCGTGAGTGTTCCTAGC-3(reverse)，引物的設(shè)計(jì)是為了擴(kuò)增F344alb白蛋白基因中內(nèi)含子7個(gè)堿基對(duì)的缺失[1]。

PCR產(chǎn)物在10%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，溴化乙錠染色，然后在紫外線下照相。

1.5微切在白蛋白免疫染色切片上用激光捕獲微切系統(tǒng)（Olympus，Tokyo，Japan）取到白蛋白染色陽性細(xì)胞群，與蛋白K液（500?滋g/ml）37℃溫育2h，再95℃溫育30min，然后兩次PCR，條件：

38個(gè)循環(huán)，94℃for30s，58℃30s和72℃1min。

引物序列，5-GAAGGCGATCCTCCTGCCTGC-3(forward)及5-CCACCGTGAGTGTTCCTAGC-3(reverse)。

1.6Westernblotting大鼠處死時(shí)采血，分離血清并儲(chǔ)存于-80℃冷凍箱中。

100?滋g的血清樣品在蛋白處理液中煮沸5min后在13%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜(HybondECL，Amersham)上，薄膜在5%無脂奶PBS與0.2%Tween20混合液中4℃孵育過夜，室溫下與1/5000稀釋的兔抗大鼠白蛋白抗體孵育1h，二抗為辣根過氧化酶偶聯(lián)的驢抗兔抗體(Dako，CA)，1/8000稀釋。

最后用ECL(Amersham)系統(tǒng)檢測(cè)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用單因素方差分析（OnewayANOVA）來檢驗(yàn)各組間差異，數(shù)據(jù)以xs表示，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)ａ=0.05。

2結(jié)果如圖1所示，盡管對(duì)照組（組Ⅰ）肝臟切片可發(fā)現(xiàn)少量散在的1個(gè)或2個(gè)白蛋白陽性肝細(xì)胞，但是白蛋白陽性肝細(xì)胞呈多于6個(gè)的簇狀分布僅發(fā)現(xiàn)于射線全身照射后接受BMCs移植的肝切片中（組Ⅲ和組Ⅳ），而且組Ⅳ中呈多于6個(gè)的簇狀分布的肝細(xì)胞數(shù)明顯多于組Ⅲ，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1），說明先天性無白蛋白大鼠射線全身照射后接受BMCs移植后腹腔注射CCl4制成慢性肝損模型與無慢性肝損相比，確能增加供體骨髓細(xì)胞來源轉(zhuǎn)化成白蛋白染色陽性的肝細(xì)胞。

用PCR擴(kuò)增含7bp缺失的白蛋白基因序列，發(fā)現(xiàn)：

F344alb的骨髓細(xì)胞提取的DNA僅出現(xiàn)60bp的條帶，而F344則出現(xiàn)67bp的條帶，在射線全身放射后即進(jìn)行BMCs移植的F344alb大鼠骨髓細(xì)胞DNAPCR結(jié)果均發(fā)現(xiàn)了67bp的條帶，由此證實(shí)了供體來源的細(xì)胞在受體骨髓內(nèi)的駐存，見圖2。

在白蛋白免疫染色切片上用激光捕獲微切系統(tǒng)取到白蛋白染色陽性細(xì)胞群，經(jīng)與蛋白K液溫育后，兩次PCR后電泳結(jié)果顯示：

這些呈簇狀分布的白蛋白染色陽性細(xì)胞群的DNA經(jīng)擴(kuò)增后顯示了67bp的條帶，說明這些細(xì)胞是供體來源，見圖3。

Westernblotting印跡分析(見圖4)：

在對(duì)照組F344alb和無骨髓細(xì)胞移植而僅有慢性肝損的F344alb可發(fā)現(xiàn)極少量的白蛋白(組Ⅰ和組Ⅱ)。

而在BMCs移植的F344alb(組Ⅲ)和BMCs移植后給予慢性肝損的F344alb(組Ⅳ)中可發(fā)現(xiàn)白蛋白水平的顯著提高，其中組Ⅳ白蛋白水平顯著升高。

3討論許多研究已經(jīng)顯示大鼠或小鼠照射后移植骨髓細(xì)胞后可重建骨髓功能[2]。

Theise等[2]將正常雄性小鼠骨髓移植到正常雌性小鼠體內(nèi)，應(yīng)用熒光原位雜交方法檢查小鼠肝臟細(xì)胞Y染色體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌性小鼠肝臟的部分肝細(xì)胞表達(dá)Y染色體，提示骨髓干細(xì)胞在正常肝臟環(huán)境中能分化為肝細(xì)胞。

Petersen等[3]將雄性大鼠骨髓細(xì)胞移植到肝損傷且肝細(xì)胞增殖被抑制模型的雌性大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)該模型雌性大鼠肝臟中部分細(xì)胞表達(dá)Y染色體，且Y染色體陽性細(xì)胞亦表達(dá)成熟肝細(xì)胞，提示骨髓干細(xì)胞在肝損傷且肝細(xì)胞增殖被抑制的肝臟中能分化為肝細(xì)胞。

Lagasse等[4]將正常小鼠骨髓干細(xì)胞移植到延胡索酰己酰乙酸羥化酶基因缺陷小鼠中，觀察模型小鼠的生長狀況及其肝臟生化功能恢復(fù)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞中的HSC在體內(nèi)轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞，使小鼠產(chǎn)生供體來源造血和肝細(xì)胞的再生，使受體小鼠肝臟的生化功能得以恢復(fù)。

但到目前為止，鮮有用F344-F344alb這種特殊的動(dòng)物模型來觀察骨髓細(xì)胞首先是否能駐存于受體的骨髓中，然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成產(chǎn)白蛋白的肝細(xì)胞，而且轉(zhuǎn)化后的肝細(xì)胞如何實(shí)現(xiàn)增殖是大家關(guān)切的熱點(diǎn)問題。

所以本實(shí)驗(yàn)中使用了這種無白蛋白的特殊動(dòng)物模型，不僅能通過正常白蛋白mRNA和蛋白的檢測(cè)來識(shí)別供體來源的肝細(xì)胞，而且不需用免疫抑制劑使本實(shí)驗(yàn)簡單易行。

首先，我們?cè)贔344alb射線全身照射后移植了F344的骨髓細(xì)胞后成功地獲得了骨髓的重建，在F344alb中缺乏正常的白蛋白基因可在重建后的F344alb骨髓中檢測(cè)到。

PCR結(jié)果顯示：

除了檢測(cè)到正常的67bp外還檢測(cè)到了異常的60bp的條帶，就證實(shí)了F344alb射線全身放射后移植了F344大鼠的骨髓細(xì)胞后重建骨髓的嵌和狀態(tài)。

其次，我們?cè)贐MCs移植后可檢測(cè)到白蛋白染色陽性的簇狀肝細(xì)胞。

這些細(xì)胞被認(rèn)為來源于供體骨髓細(xì)胞基于以下理由：

①這些細(xì)胞經(jīng)微切后，提取DNA后經(jīng)兩次PCR擴(kuò)增后顯示67bp的條帶，對(duì)這些細(xì)胞的來源提供了最有力、直接的證據(jù)。

而67bp的條帶下方有一條淡淡的60bp的條帶，這可能是微切時(shí)混有少量F344alb非供體來源的肝細(xì)胞。

②骨髓細(xì)胞移植后白蛋白染色陽性的細(xì)胞數(shù)大幅增加。

③出現(xiàn)簇狀白蛋白染色陽性肝細(xì)胞群。

④血清中白蛋白水平明顯增加，顯而易見，F(xiàn)344來源的骨髓細(xì)胞移植后能在無白蛋白大鼠的肝臟中增加白蛋白染色陽性的肝細(xì)胞數(shù)，更重要的是，本實(shí)驗(yàn)顯示：

F344來源的骨髓細(xì)胞移植后在腹腔注射CCl4造成慢性肝損，確能增加供體骨髓細(xì)胞來源轉(zhuǎn)化成白蛋白染色陽性的肝細(xì)胞，此結(jié)果由免疫組化染色和Westernblotting清晰顯示，此結(jié)果對(duì)干細(xì)胞治療有重要的指導(dǎo)意義，我們下一步研究將闡明此現(xiàn)象的分子水平的機(jī)制，弄清參與其中的激素和因子，及通過何種機(jī)制發(fā)揮作用。

在干細(xì)胞治療中我們可否用類似的激素和因子促進(jìn)有治療作用的干細(xì)胞的增殖，從而大幅提升治療作用。

最近的研究[5]報(bào)道骨髓細(xì)胞移植后所產(chǎn)生的肝細(xì)胞，其機(jī)制可能是骨髓細(xì)胞與成熟的肝細(xì)胞的融合。

然而Jang等[6]的研究顯示造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞并沒有融合。

他們將造血干細(xì)胞與受損的肝細(xì)胞用一個(gè)屏障使之隔離進(jìn)行體外培養(yǎng)，染色體分析及組織特異的基因和蛋白分析結(jié)果顯示造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞并沒有融合，而且微環(huán)境的變化是促成造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞的關(guān)鍵。

同樣，Ishikawa等[7]和Newsome等[8]報(bào)道人類的臍索細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞時(shí)亦沒有發(fā)生融合。

這些不一致的結(jié)果可能是：

首先，融合可能是在特定的動(dòng)物模型（如FAH缺乏的小鼠）中遺傳發(fā)生改變的結(jié)果，而且許多供體的細(xì)胞并沒有融合，提示可能是先發(fā)生了轉(zhuǎn)化，然后再融合；其次，肝損害可能是在造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞中起重要的作用。

即使細(xì)胞融合是所有這一切的原因（目前還有爭議，尚未統(tǒng)一），它也可因?yàn)檫z傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移而有望成為基因治療的一種手段[9]。

總之，在這個(gè)領(lǐng)域還有很多問題有待闡明，有待進(jìn)一步去深入研究。

在我們實(shí)驗(yàn)中同樣不能確定這種轉(zhuǎn)化是否是BMCs和肝細(xì)胞融合的結(jié)果[10-13]，盡管如此，通過我們的研究可以闡明：

移植的BMCs能恢復(fù)無白蛋白大鼠的生理功能。

總之，我們的研究顯示F344大鼠的BMCs首先能駐存于射線全身照射過的F344alb的骨髓，并能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生白蛋白的肝細(xì)胞，而且骨髓細(xì)胞移植后再腹腔注射CCl4造成慢性肝損，確能增加供體骨髓細(xì)胞來源轉(zhuǎn)化成白蛋白染色陽性的肝細(xì)胞，BMCs或許能成為臨床治療肝臟疾病的重要干細(xì)胞來源。

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