蛋白質(zhì)分離技術全

關于蛋白質(zhì)分離技術全一、引言蛋白質(zhì)（酶）存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，擔負著生物催化、物質(zhì)運輸、運動、防御、調(diào)控及記憶、識別等多種生理功能。第2頁,共146頁，星期六，2024年，5月（一）分離純化的意義①從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。③醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要第3頁,共146頁，星期六，2024年，5月（二）分離純化的要求1、純度：主要取決于研究的目的和應用上的要求。如作為研究一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)與功能的關系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標準蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達到一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。第4頁,共146頁，星期六，2024年，5月（三）分離純化的一般程序生物大分子的分離純化一般可分為以下幾個階段：①材料的選擇和預處理②破碎細胞及提?。ㄓ袝r還需要進行細胞器的分離）③分離純化：包括粗分級分離和細分級分離其中前兩個階段為生物大分子分離純化的前處理。選擇材料破碎細胞提取分離純化分析及鑒定第5頁,共146頁，星期六，2024年，5月二、蛋白質(zhì)（酶）

分離純化的前處理（一）材料的選擇與預處理選擇材料主要根據(jù)實驗目的而定。工業(yè)生產(chǎn)上注意選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡單、成本低的動植物組織或微生物做原料?？蒲羞x材則無需考慮上述問題，只要能達到實驗目的即可。實驗材料選定后，常常需要進行預處理，如動物材料需要除去一些與實驗無關的結(jié)締組織、脂肪組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。若不立即進行實驗或加工，應冷凍保存。第6頁,共146頁，星期六，2024年，5月（二）細胞的破碎分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應選擇適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進行組織細胞的破碎。組織細胞的破碎方法很多，不同的實驗規(guī)模，不同的實驗材料和實驗要求，使用的破碎方法和條件也不同。第7頁,共146頁，星期六，2024年，5月1.機械法：1)研磨：將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。2)組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通常可先用家用食品加工機將組織打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎。第8頁,共146頁，星期六，2024年，5月2.物理法：1)反復凍融法：將待破碎的細胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復凍融多次，由于細胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。2)超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些。3)壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa

的高壓下使細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。4)冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此法。在90℃左右維持數(shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎。第9頁,共146頁，星期六，2024年，5月3.化學與生物化學方法：1)自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當?shù)臏囟认拢毎Y(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。2)溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內(nèi)含物。3)酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細胞壁分解。4)有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。第10頁,共146頁，星期六，2024年，5月（三）細胞器的分離細胞器包括細胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細胞還有葉綠體。如果要分離制備分布在這些細胞器中的生物大分子，為了防止其他細胞組分中的物質(zhì)對制備物的干擾或污染，還需先將細胞器分離出來，然后在某一細胞器中分離某一物質(zhì)。細胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后的細胞在適當?shù)慕橘|(zhì)中進行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，即可獲得所需組分。第11頁,共146頁，星期六，2024年，5月（四）提取組織細胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶及細胞內(nèi)含物被釋放出來，必須立即將其置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備物的分解破壞，這就是提取。第12頁,共146頁，星期六，2024年，5月1.影響提取的因素目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大?。挥晒滔鄶U散到液相的難易；溶劑的pH值和提取時間等。通常：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑；溫度升高，溶解度加大；遠離等電點的pH值，溶解度增加。提取時所選擇的條件應有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。第13頁,共146頁，星期六，2024年，5月2.水溶液提取蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。用水溶液提取生物大分子應注意的幾個主要影響因素是：

1)鹽濃度（即離子強度）：離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時大大增加，稱為“鹽溶”現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力，增加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性。第14頁,共146頁，星期六，2024年，5月2)pH值：蛋白質(zhì)、酶的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關。過酸、過堿均應盡量避免，一般控制在pH=6～8范圍內(nèi)，提取溶劑的pH應在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點的兩側(cè)。3)溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時一般在0℃～5℃的低溫操作。4)防止蛋白酶的降解作用：加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的pH、離子強度或極性等方法使相應的水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質(zhì)、酶的降解作用。第15頁,共146頁，星期六，2024年，5月5)攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質(zhì)的變性失活。因為一般蛋白質(zhì)都含有相當數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或二硫蘇糖醇以防止巰基氧化。第16頁,共146頁，星期六，2024年，5月3.有機溶劑提取一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機溶劑提取。常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親脂性。有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機溶液提取常常可以防止水解酶的破壞，并兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。例如，胰島素。第17頁,共146頁，星期六，2024年，5月4.膜蛋白的提取膜蛋白的種類繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但卻賦予細胞膜非常重要的生物學功能。

根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大類型：外周膜蛋白和內(nèi)在膜蛋白。

(1)外周膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。

(2)內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般講只有用去垢劑(detergent)使膜溶解后才可分離出來。

第18頁,共146頁，星期六，2024年，5月膜蛋白即內(nèi)在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來。膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣?，一般常用的有膽酸鹽，Triton-100，Tween-80,SDS等表面活性劑。

第19頁,共146頁，星期六，2024年，5月分離膜蛋白的方法（原則性）

1）

先分離膜，然后提取；如選用冷熱交替法、反復凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細胞破碎，然后通過剃度離心得到含有膜蛋白的粗組分。

2）用特殊的去污劑選擇性的分離。在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來。第20頁,共146頁，星期六，2024年，5月第21頁,共146頁，星期六，2024年，5月三、分離與純化從細胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進一步分離純化，這一階段可分為粗分級分離和細分級分離兩步進行。蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。第22頁,共146頁，星期六，2024年，5月常用的蛋白質(zhì)分離純化技術溶解度鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀分子大小透析、超過濾密度梯度離心、凝膠過濾帶電特性電泳、離子交換層析吸附特性吸附層析對配體分子的親和性依據(jù)性質(zhì)方法用于粗分用于細分親和層析、金屬螯合層析分配層析第23頁,共146頁，星期六，2024年，5月（一）粗分級分離主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開。優(yōu)點：簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)。缺點：分辨率低，產(chǎn)品雜質(zhì)多。第24頁,共146頁，星期六，2024年，5月1.鹽析（中性鹽沉淀）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離。鹽析法應用最廣的還是在蛋白質(zhì)領域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點是：①成本低，不需要特別昂貴的設備。②操作簡單、安全。③對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。第25頁,共146頁，星期六，2024年，5月⑴鹽析的基本原理蛋白質(zhì)溶液為親水溶膠體系，其穩(wěn)定因素：水化膜和電荷。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，同時又中和了電荷，破壞了親水溶膠，蛋白質(zhì)分子即聚集而形成沉淀。第26頁,共146頁，星期六，2024年，5月溶解度鹽濃度Salting-outSalting-in第27頁,共146頁，星期六，2024年，5月++++++++++++++++等點電時的蛋白質(zhì)（親水膠體）帶負電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）脫水脫水脫水帶負電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陽離子堿酸酸蛋白質(zhì)聚集沉淀帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）堿++水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）水化膜第28頁,共146頁，星期六，2024年，5月⑵中性鹽的選擇常用的中性鹽中最重要的是(NH4)2SO4，因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點：1)溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進行。由下表可以看到，硫銨在0℃時的溶解度，遠遠高于其它鹽類：第29頁,共146頁，星期六，2024年，5月幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）

0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3

103

Na2SO4

4.918.943.342.2

NaH2PO41.67.893.8

101硫銨在0℃時的溶解度，遠遠高于其它鹽類第30頁,共146頁，星期六，2024年，5月2)分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了四倍。3)不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L濃度的(NH4)2SO4保存可達數(shù)年之久。4)價格便宜，廢液不污染環(huán)境。第31頁,共146頁，星期六，2024年，5月（3）分段鹽析不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出飽和度：在給定條件下以可能達到的最大濃度的百分數(shù)表示的鹽濃度。第32頁,共146頁，星期六，2024年，5月第33頁,共146頁，星期六，2024年，5月（4）鹽析的影響因素1)蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.5％～3.0％，相當于25mg/mL～30mg/mL。2)pH值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近。3)溫度的影響：對于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升高而增加的。一般情況下，可在室溫下進行。但對于某些對溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。

第34頁,共146頁，星期六，2024年，5月2.有機溶劑沉淀法⑴基本原理

有機溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：①降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。②由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時，從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。第35頁,共146頁，星期六，2024年，5月（2）有機溶劑沉淀法的優(yōu)點①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。②沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應用。其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。第36頁,共146頁，星期六，2024年，5月（3）有機溶劑的選擇和濃度的計算

用于生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。為了獲得沉淀而不著重于進行分離，可用溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉淀。第37頁,共146頁，星期六，2024年，5月（4）有機溶劑沉淀的影響因素

1)溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應，因此必須預冷，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。

2)樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更大的有機溶劑進行沉淀。高濃度樣品，可以節(jié)省有機溶劑，減少變性的危險，但雜蛋白的共沉淀作用大。通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜。

第38頁,共146頁，星期六，2024年，5月3)pH值：選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，通常是選在等電點附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。4)離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過5％為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的２倍體積為宜，少量的中性鹽對蛋白質(zhì)變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。

沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進行下一步的分離，則應盡可能抽干沉淀，減少其中有機溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑，以免影響樣品的生物活性。第39頁,共146頁，星期六，2024年，5月3.等電點沉淀法利用具有不同等電點的兩性電解質(zhì)，在達到電中性時溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實現(xiàn)分離的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進行初步的沉淀分離。由于許多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，此法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。第40頁,共146頁，星期六，2024年，5月pH和離子強度對β-乳球蛋白溶解度的影響第41頁,共146頁，星期六，2024年，5月4.選擇性變性沉淀法這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純。

⑴

熱變性

利用生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。

⑵

表面活性劑和有機溶劑變性使那些對表面活性劑和有機溶劑敏感性強的雜蛋白變性沉淀。通常在冰浴或冷室中進行。

⑶

選擇性酸堿變性

利用對pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀。通常是在分離純化流程中附帶進行的分離純化步驟。第42頁,共146頁，星期六，2024年，5月5.有機聚合物沉淀法有機聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑，最早應用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。其中應用最多的是“聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)】(PolyethyleneGlycol簡寫為PEG)，它的親水性強，溶干水和許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的PEG。

本方法的優(yōu)點是：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當多的生物大分子。③沉淀后有機聚合物容易去除。第43頁,共146頁，星期六，2024年，5月6.透析自ThomasGraham1861年發(fā)明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學實驗室最簡便最常用的分離純化技術之一。在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技術。透析只需要使用專用的半透膜即可完成。第44頁,共146頁，星期六，2024年，5月保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。截留分子量MwCO通常為1萬左右。用1％BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％AgNO3

檢查NaCl、KCl等。第45頁,共146頁，星期六，2024年，5月7.超濾超過濾即超濾，自20年代問世后，直至60年代以來發(fā)展迅速，很快由實驗室規(guī)模的分離手段發(fā)展成重要的工業(yè)單元操作技術。超濾現(xiàn)已成為一種重要的生化實驗技術，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。超濾是一種加壓膜分離技術，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。第46頁,共146頁，星期六，2024年，5月加壓的蛋白質(zhì)溶液濃縮的蛋白質(zhì)溶液含小分子的溶液第47頁,共146頁，星期六，2024年，5月超濾根據(jù)所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。

微孔過濾所用的操作壓通常小于4×104Pa，膜的平均孔徑為500?！?4微米（1微米＝104埃），用于分離較大的微粒、細菌和污染物等。超濾所用操作壓為4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔徑為10—100埃，用于分離大分子溶質(zhì)。反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔徑最小，一般為10埃以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。第48頁,共146頁，星期六，2024年，5月（二）精分級分離一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析和金屬螯合層析等。常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳等。另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。第49頁,共146頁，星期六，2024年，5月第十節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化一、引言二、蛋白質(zhì)（酶）分離純化的前處理三、蛋白質(zhì)（酶）分離與純化四、層析技術五、電泳技術六、離心技術第50頁,共146頁，星期六，2024年，5月四、層析技術層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography)。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。1944年出現(xiàn)紙層析。以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。第51頁,共146頁，星期六，2024年，5月（一）層析的分類按層析的分離機理分類排阻層析(exclusionchromatography)離子交換層析(ionexchangechromatography)吸附層析(absorptionchromatography)分配層析(partitionchromatography)親和層析(affinitychromatography)金屬螯合層析(metalchelatingchromatography)疏水層析(hydrophobicchromatography)反向?qū)游?reversephasechromatography)聚焦層析(focusingchromatography)灌注層析(perfusionchromatography)第52頁,共146頁，星期六，2024年，5月（二）排阻層析（凝膠層析）凡是利用生物大分子的相對分子質(zhì)量差異進行層析分離的方法，均稱之為排阻層析。用于層析的分離介質(zhì)稱為排阻層析介質(zhì)。凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質(zhì)。目前已成為生物化學、分子生物學和生物制藥的研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質(zhì)。第53頁,共146頁，星期六，2024年，5月1、凝膠層析的特點及應用特點：設備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復性好、特別是不改變樣品生物學活性等優(yōu)點。用途：蛋白質(zhì)(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。第54頁,共146頁，星期六，2024年，5月2、凝膠層析的原理凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。概念（排阻層析，分子篩層析）：當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行分離的技術。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。第55頁,共146頁，星期六，2024年，5月第56頁,共146頁，星期六，2024年，5月第57頁,共146頁，星期六，2024年，5月3.凝膠的種類和性質(zhì)(1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex)1)SephadexGG后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。G反應凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。2）SephadeXLH—20，是SephadexG—25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。(2)瓊脂糖凝膠（Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。(3)聚丙烯酰胺一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。商品名為生物膠—P（Bio-GelP).(4)聚丙乙烯凝膠（Styrogel)大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。第58頁,共146頁，星期六，2024年，5月葡聚糖凝膠(Sephadex)的物理特性第59頁,共146頁，星期六，2024年，5月4.層析柱的重要參數(shù)

⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt表示。

⑵外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。第60頁,共146頁，星期六，2024年，5月⑶內(nèi)水體積：因為凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。不包括固體支持物的體積（Vg）。

⑷峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液的體積，常用Ve表示。當使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。當樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當樣品很大時，洗脫體積計算可以從應用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。

第61頁,共146頁，星期六，2024年，5月洗脫體積第62頁,共146頁，星期六，2024年，5月5.凝膠過濾在試驗室中的應用1）生物大分子物質(zhì)的分離純化2）分子量的測定3）分級分離4）溶液濃縮5）平衡常數(shù)的測定6）細胞及顆粒的分離第63頁,共146頁，星期六，2024年，5月6.分子量的測定蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關:LogM=k1-k2Ve（Ve為洗脫體積）先測得幾種標準蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測V測第64頁,共146頁，星期六，2024年，5月（三）離子交換層析根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種離子的親和力不同而達到分離的目的。離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團。含有酸性可解離基團的稱為陽離子交換樹脂，可解離出H+；含有堿性可解離基團的稱為陰離子交換樹脂，可解離出OH-。第65頁,共146頁，星期六，2024年，5月1.離子交換層析的原理

生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等多價電解質(zhì)有不同的分子大小及電荷排列方式。當在一定pH下凈電荷為負的蛋白質(zhì)分子可通過靜電鍵結(jié)合到帶正電荷的陰離子交換劑上；當在一定pH下凈電荷為正的蛋白質(zhì)分子可通過靜電鍵結(jié)合到帶負電荷的陽離子交換劑上；大分子依其與離子交換劑親和力的不同，而在以不同牢度被吸附于離子交換劑，通過改變離子強度或(和)pH使大分子再從離子交換劑上先后被洗脫下來。第66頁,共146頁，星期六，2024年，5月第67頁,共146頁，星期六，2024年，5月2.離子交換層析的應用1)水處理離子交換層析是一種簡單而有效的雜質(zhì)及各種離子的方法，聚丙乙烯樹脂廣泛的應用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面。2)分離純化小分子物質(zhì)離子交換層析廣泛應用于無機離子、有機酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。例如對氨基酸的分析使用強酸性陽離子聚苯乙烯樹脂，將氨基酸混合液在pH值為2～3上柱。這時氨基酸都結(jié)合在樹脂上，再逐步提高洗脫液的離子強度和pH值，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，可以進行分離鑒定。全自動氨基酸分析儀就是采用這種原理制成。第68頁,共146頁，星期六，2024年，5月3)分離純化生物大分子物質(zhì)離子交換層析是依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)的不同來進行分離純化的，是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。由于生物樣品的復雜性，一般很難只經(jīng)過一次離子交換層析就達到高純度，往往要與其它分離方法結(jié)合使用。使用離子交換層析分離樣品要充分利用其按帶電性質(zhì)來分離的特性，只要選擇合適的條件，通過離子交換層析可以得到較滿意的分離效果。第69頁,共146頁，星期六，2024年，5月（四）吸附層析

(absorptionchromatography)吸附作用是指某些物質(zhì)能夠從溶液中將溶質(zhì)濃集在其表面的現(xiàn)象。利用吸附層析介質(zhì)表面的活性分子或活性基團，對流動相中不同溶質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，利用其對不同溶質(zhì)吸附能力的強弱而進行分離的一種方法，稱之為吸附層析。固定相為固體，流動相為液體。第70頁,共146頁，星期六，2024年，5月物質(zhì)之所以能在固體表面停留，這是因為固體表面的分子和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不同。在固體內(nèi)部，分子之間互相作用的力是對稱的，其力場互相抵消。而處于固體表明的分子所收的力是不對稱的，向內(nèi)的一面受到固體內(nèi)部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質(zhì)分子在運動中遇到固體表面時受到這種剩余力的影響，就會被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動態(tài)平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產(chǎn)生平衡和不平衡、吸附與解吸的動態(tài)平衡過程。第71頁,共146頁，星期六，2024年，5月實驗中常用的固體吸附劑有氧化鋁、硅酸鎂、磷酸鈣、氫氧化鈣、活性鈣、蔗糖、纖維素和淀粉。常用的洗脫液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水與有機溶劑形成的各種混合物。吸附層析通常用于分離脂類、類固醇類、類胡羅卜素、葉綠素以及它們的前體等非極性和極性不強的有機物。

第72頁,共146頁，星期六，2024年，5月（五）分配層析

(partitionchromatography)分配層析是利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同而達到分離目的的層析技術，相當于一種連續(xù)性的溶劑抽提方法。

在分配層析中，固定相是極性溶劑（例如水、稀硫酸、甲醇等）。此類溶劑能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反應性弱的惰性物質(zhì)如淀粉、纖維素粉，濾紙等)緊密結(jié)合，使呈不流動狀態(tài)；流動相則是非極性的有機溶劑。

第73頁,共146頁，星期六，2024年，5月分配系數(shù)(α)是指在一定溫度和壓力條件下達到平衡，物質(zhì)在固定相和流動相兩部分的濃度比值。

分配系數(shù)（α）＝物質(zhì)在固定相中的濃度物質(zhì)在流動相中的濃度第74頁,共146頁，星期六，2024年，5月在層析過程中，當有機溶劑流動相流經(jīng)樣品點時，樣品中的溶質(zhì)便按其分配系數(shù)部分地轉(zhuǎn)入流動相向前移動。當經(jīng)過前方固定相時，流動相中的溶質(zhì)就會進行分配，一部分進入固定相。通過這樣不斷進行的流動和再分配，溶質(zhì)沿著流動方向不斷前進。各種溶質(zhì)由于分配系數(shù)不同，向前移動的速度也各不相同。分配系數(shù)較大的物質(zhì)，由于分配在固定相多些，分配在流動相少些，溶質(zhì)移動較慢；而分配系數(shù)較小的物質(zhì)，流動速度較快。從而將分配系數(shù)不同的物質(zhì)分離開來。第75頁,共146頁，星期六，2024年，5月第76頁,共146頁，星期六，2024年，5月（六）親和層析

(AffinityChromatography)

許多物質(zhì)都具有和某化合物發(fā)生特異性可逆結(jié)合的特性。例如：酶與輔酶或酶與底物（產(chǎn)物或競爭性抑制劑等），抗原與抗體，凝集素與受體，維生素與結(jié)合蛋白，凝集素與多糖（或糖蛋白、細胞表面受體），核酸與互補鏈（或組蛋白、核酸多聚酶、結(jié)合蛋白）以及細胞與細胞表面特異蛋白（或凝集素）等。

第77頁,共146頁，星期六，2024年，5月1.親和層析的原理親和層析法就是利用化學方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當待提純的生物大分子通過此層析柱時，此生物大分子便與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則被沖洗出去。然后再用適當方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來，從而達到分離提純的目的。第78頁,共146頁，星期六，2024年，5月配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配體復合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)游離配體第79頁,共146頁，星期六，2024年，5月第80頁,共146頁，星期六，2024年，5月2.親和層析的特點純化效率極高：親和層析由于配體與待分離物質(zhì)進行特異性結(jié)合，所以分離提純的效率極高，提純度可達幾千倍。第81頁,共146頁，星期六，2024年，5月3.親和層析的應用1）抗原和抗體

利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進行分離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結(jié)合于親和層析基質(zhì)上，就可以從血清中分離其對應的抗體?？乖?、抗體間親和力一般比較強，其解離常數(shù)為10–8-10–12M，所以洗脫時是比較困難的，通常需要較強烈的洗脫條件。第82頁,共146頁，星期六，2024年，5月2)激素和受體蛋白

激素的受體蛋白屬于膜蛋白，利用去污劑溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性質(zhì)，難于用通常的層析技術分離。但去污劑溶解通常不影響受體蛋白與其對應激素的結(jié)合。所以利用激素和受體蛋白間的高親和力（10-6－10–12M）而進行親和層析是分離受體蛋白的重要方法。目前已經(jīng)用親和層析方法純化出了大量的受體蛋白，如乙酰膽堿、腎上腺素、生長激素、嗎啡、胰島素等等多種激素的受體。第83頁,共146頁，星期六，2024年，5月3)凝集素和糖蛋白

凝集素是一類具有多種特性的糖蛋白，幾乎都是從植物中提取。它們能識別特殊的糖，因此可以用于分離多糖、各種糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的細胞。用凝集素作為配體的親和層析是分離糖蛋白的主要方法。

伴刀豆球蛋白A能結(jié)合含α-D-吡喃甘露糖苷或α-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。

麥胚凝集素可以特異的與N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神經(jīng)氨酸結(jié)合，可以用于血型糖蛋白A、紅細胞膜凝集素受體等的分離。洗脫時只需用相應的單糖或類似物，就可以將待分離的糖蛋白洗脫下來。第84頁,共146頁，星期六，2024年，5月4）多核苷酸和核酸

利用poly-U作為配體可以用于分離mRNA以及各種poly-U結(jié)合蛋白。poly-A可以用于分離RNA聚合酶以及其它poly-A結(jié)合蛋白。以DNA作為配體可以用于分離各種DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多種酶類。5）輔酶

核苷酸及其許多衍生物、各種維生素等是多種酶的輔酶或輔助因子，利用它們與對應酶的親和力可以對多種酶類進行分離純化。例如固定的各種腺嘌呤核苷酸輔酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等應用很廣泛，可以用于分離各種激酶和脫氫酶。第85頁,共146頁，星期六，2024年，5月6）分離病毒、細胞

利用配體與病毒、細胞表面受體的相互作用，親和層析也可以用于病毒和細胞的分離。利用凝集素、抗原、抗體等作為配體都可以用于細胞的分離。例如各種凝集素可以用于分離紅細胞以及各種淋巴細胞，胰島素可以用于分離脂肪細胞等。第86頁,共146頁，星期六，2024年，5月（七）金屬螯合層析

(metalchelatingchromatography)利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。第87頁,共146頁，星期六，2024年，5月金屬螯合層析技術在現(xiàn)代基因工程中常用于表達蛋白的分離NH2NH2NiHisHisHisHisprotein▁▁▁▂▃▄▅▆▇▇▆▅▄▃▂▁▁▁▁▂▃▄▅▆▇▇▆▅▄▃▂▁第88頁,共146頁，星期六，2024年，5月（八）高效液相色譜（HPLC）高效液相色譜法是以液體作為流動相，用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術。高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補了氣相色譜法的不足。目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。第89頁,共146頁，星期六，2024年，5月1.高效液相色譜法的特點特點：高壓、高效、高速高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。第90頁,共146頁，星期六，2024年，5月2.液相色譜儀、主要部件及流程第91頁,共146頁，星期六，2024年，5月第92頁,共146頁，星期六，2024年，5月主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。第93頁,共146頁，星期六，2024年，5月(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第94頁,共146頁，星期六，2024年，5月(3)進樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：第95頁,共146頁，星期六，2024年，5月(4)高效分離柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。第96頁,共146頁，星期六，2024年，5月(5)高效液相色譜檢測器紫外光度檢測器（UV）：最小檢測量10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。最常用的檢測器。第97頁,共146頁，星期六，2024年，5月光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。第98頁,共146頁，星期六，2024年，5月3.影響分離的因素影響分離的主要因素有:

固定相及分離柱；流動相的流量、性質(zhì)和極性;

第99頁,共146頁，星期六，2024年，5月1）固定相及分離柱選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。選擇短柱、細內(nèi)徑提高分析速度；研制高效柱填料是一活躍領域。第100頁,共146頁，星期六，2024年，5月2）流動相及流動相的極性（1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。第101頁,共146頁，星期六，2024年，5月流動相組成流動相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑:

己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。第102頁,共146頁，星期六，2024年，5月4.高效液相色譜法的主要分離類型1）吸附色譜（液-固吸附色譜）以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2）分配色譜（液-液分配色譜）早期通過在擔體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學鍵合固定相，即用化學反應的方法通過化學鍵將固定液結(jié)合在擔體表面。第103頁,共146頁，星期六，2024年，5月3）離子交換色譜固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。4）凝膠色譜（空間排阻色譜）以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；第104頁,共146頁，星期六，2024年，5月五、電泳技術電泳的概念：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。電泳現(xiàn)象早在十九世紀初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國物理學家Re?ss進行了世界上第一次電泳實驗）。但電泳技術的廣泛應用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進行紙電泳以后，特別是近幾十年以來，電泳技術發(fā)展很快，各種類型的電泳技術相繼誕生，在生物化學、醫(yī)學、免疫學等領域得到了廣泛應用。第105頁,共146頁，星期六，2024年，5月電泳技術發(fā)展簡史

1809年俄國物理學家Рейсе首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負兩個電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層變混濁，即帶負電荷的粘土顆粒向正極移動，這就是電泳現(xiàn)象。

1909年Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測定了轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點。

第106頁,共146頁，星期六，2024年，5月1937年瑞典Uppsala大學的Tiselius對電泳儀器作了改進，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術方面作出的開拓性貢獻而獲得了1948年的諾貝爾化學獎。

1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對氨基酸的分離進行過研究。1950年Durrum用紙電泳進行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。第107頁,共146頁，星期六，2024年，5月

1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時代。30多年來，聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是生物化學和分子生物學中對蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術，是檢驗生化物質(zhì)的最高純度：即“電泳純”（一維電泳一條帶或二維電泳一個點）的標準分析鑒定方法，至今仍被人們稱為是對生物大分子進行分析鑒定的最后、最準確的手段，即“LastCheck”。80年代發(fā)展起來的新的毛細管電泳技術，是化學和生化分析鑒定技術的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視和應用。第108頁,共146頁，星期六，2024年，5月（一）電泳的分類原則上按電泳的原理來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。其裝置復雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術上的差異，又可分為不同的類型。第109頁,共146頁，星期六，2024年，5月按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。第110頁,共146頁，星期六，2024年，5月③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)第111頁,共146頁，星期六，2024年，5月（二）電泳的基本原理電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運動，不同的物質(zhì)在一定的電場強度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動速度不同進而達到分離目的。第112頁,共146頁，星期六，2024年，5月若將帶凈電荷Q的粒子放入電場，則該粒子所受到的電荷引力為：

F引=EQ（1）在溶液中,運動粒子與溶液之間存在阻力F阻

F阻=6πrηV

當F引=F阻時

EQ=6πrηV

V=

由上式可以看出,粒子的移動速度(泳動速度V)與電場強度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度(η)成反比。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過程中受到更大的阻力，即粒子的泳動速度與粒子形狀有關。EQ6πrη（2）（3）（4）第113頁,共146頁，星期六，2024年，5月由（4）可知，帶電粒子的泳動速度受電場強度影響，使得同一種帶電粒子在不同電場里泳動速度不同。在一次電泳中，蛋白質(zhì)處在同一電場中，為了便于比較，常用遷移率m（或稱泳動度，指帶電粒子在單位電場強度下的泳動速度）代替泳動速度表示粒子的泳動情況。

m=V/E=Q/6πrη

（5）

由上式可以看出，在同一電場中，遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量、粒子大小及溶液粘度有關，而與電場強度無關。EQ6πrη（4）V=第114頁,共146頁，星期六，2024年，5月以上討論的是在溶液中進行的自由界面電泳的情況，在用支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電滲（是指在電場中，液體對于固體支持物的相對移動）的影響。電泳時應避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。最后要考慮選用離子強度適宜的溶液。離子強度影響粒子的電動電勢，溶液的離子強度越高，由于溶液中的離子會分擔大部分電流，則粒子的電動電勢越小，泳動速度越慢，反之越快。

總之，電泳受粒子本身大小、形狀、所帶電量、溶液粘度、溫度、pH、電滲及離子強度多種因素的影響。第115頁,共146頁，星期六，2024年，5月（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好，有彈性，透明，化學性質(zhì)穩(wěn)定，對pH和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑作用下合成的。

聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。第116頁,共146頁，星期六，2024年，5月CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,

N’-甲叉雙丙烯酰胺CH2=CH

C=ONHCH2NHC=O

CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH

C=ONHCH2NHC=O

CH2-CHCH2ˉ

CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m第117頁,共146頁，星期六，2024年，5月1.聚丙烯酰胺凝膠的制備聚丙烯酰胺凝膠聚合為自由基聚合，其催化體系有兩種：1.化學聚合化學聚合的催化劑（引發(fā)劑）通常采用過硫酸銨（ammoniumpersulfate，Ap），此外還需要加速劑TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可促使過硫酸銨形成自由基：S2O82-2?SO4-這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。第118頁,共146頁，星期六，2024年，5月2.光聚合光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應。TEMED的存在，可以加速聚合。上述聚合反應受許多因素的影響：

（1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長的增加。在進行化學聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。

（2）低溫、低pH都會減慢聚合反應速度。

（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應。第119頁,共146頁，星期六，2024年，5月2.

凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關系凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）的計算公式分別為：Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%C=Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%T=凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，孔徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。當凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為5%時，凝膠具有最小孔徑，超過5%或低于5%時凝膠孔徑都要增大。第120頁,共146頁，星期六，2024年，5月在濃度為7.5%

的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5%

凝膠稱為標準膠。對于一個未知樣品，常用7.5%的標準膠或4%-10%

的凝膠梯度來測試，而后選出適宜的凝膠濃度。用于研究大分子核酸的凝膠多為2.4%的大孔凝膠，此時凝膠太軟，不易操作，可加入0.5%瓊脂糖，或在3%凝膠中加入20%蔗糖以增加機械強度而又不影響凝膠孔徑大小。第121頁,共146頁，星期六，2024年，5月3.不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：

1）凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠（2~3％），下層為小孔徑的分離膠（5~15％）。

2）緩沖液離子組成的不連續(xù)性。主要是陰離子不同（Gly-,Cl-）。

3）凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.8的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

4）在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應，即樣品的濃縮效應，凝膠的分子篩效應和電荷效應，由于這三種物理效應，使樣品分離效果好，分辨率高。第122頁,共146頁，星期六，2024年，5月Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=8.3Tris-HClpH=6.8T=3%Tris-HClpH=8.9T=7.5%第123頁,共146頁，星期六，2024年，5月第124頁,共146頁，星期六，2024年，5月4.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)各組分的電泳遷移率的不同。這種差異就蛋白質(zhì)分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關。當電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）時，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質(zhì)的分子量。

第125頁,共146頁，星期六，2024年，5月SDS的作用原理

這種陰離子去污劑能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)分子部、分子之間以及與其它物質(zhì)分子之間的非共價鍵,使蛋白質(zhì)變性而改變原有的空間構(gòu)象。

當SDS的總量為蛋白量的3～10倍且SDS單位濃度大于1mol./L時，這兩者的結(jié)合是定量的，大約每克蛋白質(zhì)可結(jié)合1.4克SDS。

蛋白質(zhì)分子一經(jīng)結(jié)合了一定量的SDS陰離子，所帶負電荷的量遠遠超過了它原有電荷量，從而消除了不同種類蛋白質(zhì)間電荷符號的差異。且由于分子量越大的蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS越多，所帶負電荷也越多，這就使各蛋白質(zhì)-SDS復合物的電荷密度趨于一致。第126頁,共146頁，星期六，2024年，5月不同蛋白質(zhì)的SDS復合物形狀也相似，均是長橢球狀。

在電泳過程中，遷移率僅取決于蛋白質(zhì)-SDS復合物的大小，也可以說是取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，而與蛋白質(zhì)原來所帶電荷量無關。

m=V/E=Q/6πrη

令：Q/η=C則：m=V/E=C/6πr在SDS-電泳中，蛋白質(zhì)的泳動度與其大小成反比第127頁,共146頁，星期六，2024年，5月測定蛋白質(zhì)分子量當?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在17,000～165,000之間時，蛋白質(zhì)-SDS復合物的電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)呈線性關系：lgMW=lgK－bm

MW為蛋白質(zhì)的分子量，m為相對遷移率，K為常數(shù)，b為斜率

將已知分子量的標準蛋白質(zhì)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率對分子量的對數(shù)作圖，即可得到一條標準曲線。只要測得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，就能根據(jù)標準曲線求得其分子量。第128頁,共146頁，星期六，2024年，5月第129頁,共146頁，星期六，2024年，5月5.聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳(IsoelectricFocusing，IEF)聚丙烯酰胺凝膠中加入一種合成的兩性電解質(zhì)載體，在電場的作用下會自發(fā)形成一個連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)樣品在電泳中被分離，運動到等電點膠層時就失去所帶電荷而穩(wěn)定停留在該處，樣品中不同蛋白質(zhì)組分等電點不同，因而在等電聚焦電泳中得到有效分離。在等電聚焦電泳中，利用各蛋白質(zhì)組分等電點的差異，并不利用凝膠的分子篩作用。它的分辨力高，可分離等電點相差0.01~0.02pH單位的蛋白質(zhì)。第130頁,共146頁，星期六，2024年，5月載體兩性電解質(zhì)商品有ampholine(LKB公司)、Pharmlyte(Pharmacia)、Serralyte(Serva)以及國產(chǎn)的Ampholine(上海生化所東風廠生產(chǎn))。Ampholine是具有多等電點的多氨基多羧基酸類化合物。CH2=CHCOOHCH2-CH2NHCH2-CH2NHCH2-CH2NHRNHR()nCH2-CH2NHCH2-CH2NHCH2-CH2NRNHR()nCH2CH2COOHCH2CH2COOH隨機加成多胺同系物丙烯酸加成度不同的混合物，分子量大小不同，胺基和羧基的比例不同。第131頁,共146頁，星期六，2024年，5月載體兩性電解質(zhì)及對應的電極緩沖