蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定

關(guān)于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定主要內(nèi)容(1)了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。(2)學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法。第2頁,共20頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)的解離性質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：第3頁,共20頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的pH達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動(dòng)，也不向陽極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。不同蛋白質(zhì)各有其特異的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。第4頁,共20頁，星期六，2024年，5月最常用的方法是：①測其溶解度最低時(shí)的溶液pH值。②等電聚焦電泳測其凈電荷為零時(shí)的PH③濁度、分光光度法④基于蛋白質(zhì)與離子交換的作用第5頁,共20頁，星期六，2024年，5月一、測定溶解度最低時(shí)的溶液PH實(shí)驗(yàn)原理：借觀察在不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點(diǎn)。用醋酸與酷酸鈉(醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中)配制成各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。第6頁,共20頁，星期六，2024年，5月器材：水浴鍋、溫度計(jì)、200毫升錐形瓶、100毫升容量瓶、吸管、試管、試管架、乳缽試劑：(1)0.4％酪蛋白醋酸鈉溶液

(2)1.00摩爾／升醋酸溶液

(3)0.10摩爾／升醋酸溶液

(4)0.01摩爾／升醋酸溶液

實(shí)驗(yàn)器材與試劑：第7頁,共20頁，星期六，2024年，5月實(shí)驗(yàn)步驟：(1)取同樣規(guī)格的試營4支，按下表顛序分別精確地加入各試劑，然后混勻。試管號(hào)

蒸餾水（ml）0.01M醋酸（ml）0.1M醋酸（ml）1M醋酸（ml）18.40.6——28.7—0.3—38.0—1.0—47.4——1.6第8頁,共20頁，星期六，2024年，5月(2)向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1毫升，加一管，搖句一管。此時(shí)1、2、3、4管的pH值依次為5.9、5.3、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。第9頁,共20頁，星期六，2024年，5月二、等電聚焦電泳原理：1）有一類兩性電解質(zhì)：它具有依次遞變而又相差不大的等電點(diǎn)，在電場下形成遞變而又連續(xù)的pH梯度，故在電泳介質(zhì)中加入這種物質(zhì)則能造成介質(zhì)pH由酸到堿逐步變化。第10頁,共20頁，星期六，2024年，5月2)各種蛋白質(zhì)pI不同3）兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持介質(zhì)，并在凝膠中加入兩性電解質(zhì)載體，在電場作用下，蛋白質(zhì)在此pH梯度的凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時(shí)，就不再泳動(dòng)，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。第11頁,共20頁，星期六，2024年，5月三、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器1）兩性電解質(zhì)2）30％丙烯酰胺溶液3）TEMED4）10％過硫酸銨溶液5）負(fù)極緩沖液：0.1MNaOH正極緩沖液：0.1M磷酸或硫酸固定液：10％（W/V）三氯乙酸染色液脫色液蛋白質(zhì)等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)電泳儀圓盤電泳槽第12頁,共20頁，星期六，2024年，5月圖聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)第13頁,共20頁，星期六，2024年，5月四、操作方法1.凝膠柱的制備（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中（2）配膠表10mL7.5%凝膠的配制試劑名稱 體積(mL) 凝膠貯液 2.5 兩性電解質(zhì)載體 0.5 蒸餾水 6.7510%過硫酸銨 0.0510%TEMED 0.1 蛋白質(zhì)混合樣品 0.1 混勻后置真空干燥器中抽氣10min

第14頁,共20頁，星期六，2024年，5月（3）將配好的凝膠溶液用細(xì)長頭滴管加到預(yù)先準(zhǔn)備好的玻管中，至離上端1cm處，再用注射器緩緩加水3-5mm高。（4）待凝膠聚合2.電泳

將裝有膠的玻管固定到電泳槽上槽的洞中（安裝時(shí)要保證凝膠管垂直且橡膠塞孔密封不漏）在上槽中裝入0.1mol/L氫氧化鈉溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸緩沖液。連接到電泳儀，接通電源，調(diào)電壓至160V，聚焦過夜，至電流降為0，則可關(guān)閉電源。第15頁,共20頁，星期六，2024年，5月3．剝膠

電泳結(jié)束后，取下凝膠管，用蒸餾水洗凈兩端電極液，在凝膠條的正極端作上標(biāo)記。用灌滿水的注射器長針頭插入凝膠與玻管管壁之間，邊壓水邊慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)玻管，推針前進(jìn)，同時(shí)注入水，靠水流壓力和潤滑力將玻璃管內(nèi)壁與凝膠分開，凝膠條即可流出。4.固定染色

取出凝膠條放在一塊潔凈的玻板上，用尺量出固定前的凝膠條長度。放入帶蓋試管中加入固定液。固定20min2后，倒掉固定液后用脫色液漂洗2次，再染色1h，用蒸餾水漂洗數(shù)次后用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，量出蛋白帶距正極端的距離。第16頁,共20頁，星期六，2024年，5月5.蛋白質(zhì)條帶聚焦位置的計(jì)算求出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正極端的實(shí)際長度為：蛋白區(qū)帶中心距凝膠條正極端的距離

固定染色前凝膠條長度固定染色后凝膠條長度

第17頁,共20頁，星期六，2024年，5月三、濁度、分光光度法

溶液的pH值與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相同時(shí)，靜電荷為0，當(dāng)溶液pH值大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。反之，溶液的pH值小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則氨