蛋白表達及純化

關(guān)于蛋白表達及純化Part1:蛋白表達、純化第2頁,共52頁，星期六，2024年，5月蛋白表達流程目的基因cDNA表達宿主載體設(shè)計引物連接轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)表達蛋白純化鑒定保存第3頁,共52頁，星期六，2024年，5月

gene第4頁,共52頁，星期六，2024年，5月Cell-freeBacterialYeastInsectMammalianHost第5頁,共52頁，星期六，2024年，5月ExpressionSystemCharacteristicsCharacteristicsE.coliYeastInsectMammaliandoublingtimerapid(30min)rapid(90min)slow(18-24hrs)slow(24hrs)costofgrowthmediumlowlowhighhighexpressionlevelhighlow–highlow–highlow–moderateproteinfoldingrefoldingmayberequiredrefoldingmayberequiredproperfoldingproperfoldingN-linkedglycos.nohighmannosesimple,nosialicacidcomplexO-linkedglycos.noyesyesyesphosphorylationnoyesyesyesacetylationnoyesyesyesacylationnoyesyesyesg-carboxylationnononoyesprojectcostlowlowmiddlehigh第6頁,共52頁，星期六，2024年，5月一：大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序,共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統(tǒng)成熟繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素(endotoxin)第7頁,共52頁，星期六，2024年，5月Vector第8頁,共52頁，星期六，2024年，5月二大腸桿菌表達載體的基本組成一個良好的大腸桿菌表達載體：復(fù)制起點(ori)多克隆位點。篩選標(biāo)記（抗菌素抗性基因、Tag、篩選標(biāo)記）控制和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄與翻譯的必不可少的原件外源基因在原核寄主細胞中表達,它的編碼結(jié)構(gòu)必須是連續(xù)的,不間斷的,處于寄主啟動子有效控制下。第9頁,共52頁，星期六，2024年，5月可使外源基因高水平表達的最佳啟動子必須具備以下幾個條件1)強啟動子，外源基因的蛋白質(zhì)的表達量占細胞總蛋白的10%-30%以上2)應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平3)應(yīng)該是誘導(dǎo)型的,能通過簡單的方式,使用廉價的誘導(dǎo)物得以誘導(dǎo)。常用的大腸桿菌表達載體啟動子：

λ噬菌體的PL啟動子大腸桿菌乳糖操縱子lac啟動子色氨酸操縱子trp啟動子

pBR322質(zhì)粒的beta－內(nèi)酰胺酶啟動子啟動子第10頁,共52頁，星期六，2024年，5月終止子a:如果在克隆基因編碼區(qū)的3

末端之后，接上一個有效的轉(zhuǎn)錄終止子，便能夠阻止轉(zhuǎn)錄通讀過位于下游另一個啟動子b:如果在啟動子的上游部位放置一個有效的轉(zhuǎn)錄終止子,那么由該啟動子驅(qū)動的克隆基因的轉(zhuǎn)錄便會被限制在最低本底水平。c:轉(zhuǎn)錄終止子還能增強mRNA分子的穩(wěn)定性,大大提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平。d:在構(gòu)建大腸桿菌表達載體時，通常是添加全部終止密碼子,阻止核糖體跳躍(skipping)現(xiàn)象。e:大腸桿菌格外偏愛使用終止密碼子UAA,當(dāng)其后連上一個U而形成四聯(lián)核苷酸的情況下,轉(zhuǎn)譯終止效率便會得到進一步加強第11頁,共52頁，星期六，2024年，5月轉(zhuǎn)譯起始序列a:mRNA的5

末端之獨特的結(jié)構(gòu)特征,是決定mRNA轉(zhuǎn)譯起始效率的主要因素。b:在構(gòu)建外源基因的高效表達載體時,需認真選擇有效的轉(zhuǎn)錄起始序列。c:未鑒定出通用有效的轉(zhuǎn)譯起始序列的保守結(jié)構(gòu)(KOZAKSEQUENCE)第12頁,共52頁，星期六，2024年，5月篩選標(biāo)記:其編碼產(chǎn)物可被快速測定的功能單元。追蹤某些特定的DNA結(jié)構(gòu)(重組質(zhì)粒)是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細胞同任何一種目的啟動子連接,其表達活性可作為檢測啟動子功能的依據(jù)。β－半乳糖苷酶基因lacZ熒光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因(cat)四環(huán)素抗性基因(tetr)Tag-第13頁,共52頁，星期六，2024年，5月第14頁,共52頁，星期六，2024年，5月目的基因保護堿基內(nèi)切酶1內(nèi)切酶2保護堿基第15頁,共52頁，星期六，2024年，5月Xgene引物的設(shè)計：設(shè)計一對特異性引物。上游、下游引物引入酶切位點oligo6RNA提?。篢RNzol（附件）RT-PCR：附件1：DNAmarker；2：X基因擴增產(chǎn)物圖1.1X基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物第16頁,共52頁，星期六，2024年，5月GenecloningYourdestinationvectorR1R2YourlinearizedvectorX基因R1R2+1.雙酶切目的基因和載體及切膠回收：附件目的基因保護堿基內(nèi)切酶1內(nèi)切酶2保護堿基2.連接轉(zhuǎn)化：附件3.雙酶切鑒定：附件4.測序：附件1：DNAmarker;2：重組質(zhì)粒pET28-X雙酶切;3：空質(zhì)粒pET28a雙酶切圖1.3重組質(zhì)粒pET28-X雙酶切鑒定圖1.4X基因發(fā)生點突變(AGU→AGC)，但為同義突變（Ser）第17頁,共52頁，星期六，2024年，5月Proteinexpression

檢測該重組質(zhì)粒在BL21中是否能被誘導(dǎo)表達，并確定在不同IPTG濃度和時間蛋白誘導(dǎo)效率的差異。挑單克隆菌落于7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液的50ml培養(yǎng)管中，37C振蕩培養(yǎng)過夜（8-16h）。37C，1mMIPTG終濃度誘導(dǎo)蛋白。取700ul過夜搖菌加入7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液的50ml離心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接種，37C培養(yǎng)時，細菌生長至OD600＝0.4-0.6約需2h）時加入終濃度為1mM的IPTG。誘導(dǎo)前在37C培養(yǎng)的菌液中取1ml未誘導(dǎo)的對照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1mlOD600為0.4的菌加40ulbuffer)加入2×上樣緩沖液，混勻，-20℃保存或直接上樣。根據(jù)蛋白分子量大小配置相應(yīng)濃度的SDS膠。（50KD蛋白10％或12％）誘導(dǎo)3-4h后收集菌液，取1ml樣品，測OD600，10000rpm，1min離心去上清后加入相應(yīng)體積的2×上樣緩沖液，vortex。將收集的菌液在水中煮5min，上樣10μl，120V電壓走濃縮膠，加電壓至150V進入分離膠電泳，直到染料剛好走到膠底。取下膠，考馬斯亮藍染色至少30min（染液若是新配的，染20min就夠了），脫色液脫色。若急需看到結(jié)果，可以將膠在500ml蒸餾水中煮沸兩次即可看到條帶。第18頁,共52頁，星期六，2024年，5月IPTGinductionEvenintheabsenceofIPTG,thereissomeexpressionofT7RNApolymerasefromthelacUV5promoter.Thedegreeoftoxicitywillvaryfromproteintoprotein.pETsystemmanual,Novagen,11thEdition第19頁,共52頁，星期六，2024年，5月1：蛋白marker；2~9：分別用IPTG誘導(dǎo)表達0、1、2、3、4、6、8、12h。圖1.6X蛋白表達條件：誘導(dǎo)時間優(yōu)化1：0mmol/L；2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L；4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L；6：1.5mmol/L；7：2.5mmol/L；8：3.5mmol/L；9：5.0mmol/L。圖1.5X蛋白表達條件：IPTG濃度優(yōu)化X蛋白在大腸桿菌中表達條件優(yōu)化第20頁,共52頁，星期六，2024年，5月ProteinPurificationCharacterizefunction,activity,structureUseinassaysRaiseantibodiesmanyotherreasons...第21頁,共52頁，星期六，2024年，5月GuidelinesforproteinpurificationDefineobjectivesDefinepropertiesoftargetproteinandcriticalcontaminantsMinimizethenumberofstepsUseadifferenttechniqueateachstepDevelopanalyticalassaysAdaptedfrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第22頁,共52頁，星期六，2024年，5月BasicschemeofproteinpurificationFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第23頁,共52頁，星期六，2024年，5月Proteinpreparation,extraction,clarificationCellgrowth,proteinover-expressionCelllysisRemovalofcelldebrisFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第24頁,共52頁，星期六，2024年，5月Proteinisolation,concentration,andstabilizationReversibleprecipitationwithsaltororganicmoleculesFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第25頁,共52頁，星期六，2024年，5月FractionalprecipitationofproteinsAddPrecipitant,CentrifugationChromatographyPrecipitatecontaminantsPrecipitateproteinofinterestDiscardsupernatant,ResuspendproteinDiscardpelletAddPrecipitant,Centrifugation,Discardsupernatant,Resuspendprotein第26頁,共52頁，星期六，2024年，5月IntermediatePurificationLiquidchromatography(lowerresolution,lowercost)From:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第27頁,共52頁，星期六，2024年，5月AnintroductiontoliquidchromatographyProteinsolutionappliedtoacolumnColumn=solidporousmatrix(stationaryphase)+liquid(mobilephase)ProteinsseparatedbasedondifferinginteractionswithstationaryandmobilephasesMobilephaseconditionscanbeadjustedtoincreaseordecreaseaffinityofproteinforstationaryphase(gradient)第28頁,共52頁，星期六，2024年，5月SizeexclusionchromatographyBiggerProteinsSmallerProteins第29頁,共52頁，星期六，2024年，5月AffinityChromatography第30頁,共52頁，星期六，2024年，5月AffinityChromatographyMostcommonly-usedchromatographytechniqueCanbeusedonproteinwithnaturalligandsOfteninvolvescovalentattachmentofaffinitytagtoproteinBecauseofuniquetag,providesrapid,specificcleanupinonechromatographystep*Canallowforautomationofproteinpurification第31頁,共52頁，星期六，2024年，5月PopularSmallAffinityTagsTagMatrixElutingAgentResiduesSequenceNotesHisNi2+-NTA,Talon,CobaltimidazoleorlowpH5-15HHHHHnativeordenaturing;inexpensiveresinFLAGanti-FLAGantibodylowpHorEDTA/EGTA8DYKDDDDKhighspecificity;harshelutioncond.StrepIImodifiedstreptavidindesthiobiotin8WSHPQFEKexpensiveresinS-peptideS-proteinenzymaticcleavage15KETAAAKFERHMDSdetectionpossible;expensiveresin第32頁,共52頁，星期六，2024年，5月PopularLargeAffinityTagsTagMatrixElutingAgentSizeNotesMBPamylosemaltose40kDasolubility+secretionenhancer;inexpensiveresinGSTglutathionereducedglutathione26kDainexpensiveresincellulose-bindingdomainscellulosewaterorGd?HCl4-20kDasecretionenhancercalmodulin-bindingpeptidecalmodulinEDTA/EGTA4kDadetectionpossible;expensiveresinHis-patchthioredoxinNi2+-NTA,Talonimidazole11.7kDasolubility+S-Senhancer第33頁,共52頁，星期六，2024年，5月鎳柱親和層析詳細步驟：附件第34頁,共52頁，星期六，2024年，5月1：空質(zhì)粒未誘導(dǎo)；2：空質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)；3：細菌裂解液上清（可溶部分）；4：細菌裂解液沉淀（不可溶部分）；(B)切膠回收1：蛋白marker；2：重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)；3：重組質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)；4：空白孔；5：純化重組蛋白；

(C)Ni柱親和層析：1-8為依次的蛋白過柱洗脫液圖1.7X蛋白的可溶性分析(A)和純化(B、C)蛋白純化結(jié)果1.親和層析柱2.切膠回收（附件）可溶性蛋白or包涵體純化第35頁,共52頁，星期六，2024年，5月PolishingstepsFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionACLiquidchromatography(higherresolution,highercost)第36頁,共52頁，星期六，2024年，5月BasicschemeofproteinpurificationLiquidchromatography(higherresolution,highercost)Liquidchromatography(lowerresolution,lowercost)ReversibleprecipitationwithsaltororganicmoleculesCellgrowth,proteinover-expressionCelllysisRemovalofcelldebrisFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第37頁,共52頁，星期六，2024年，5月TagRemovalNH2–proteintaglinkerDDDDKproteaseconsiderations:effectonstructureeffectonfunctionflexibilityprotein1°sequenceCurrentstrategiesfortheuseofaffinitytagsandtagremovalforthepurificationofrecombinantproteinsProteinExpressionandPurification

Volume48,Issue1,July2006,Pages1-13第38頁,共52頁，星期六，2024年，5月ProteindetectionmethodsSDSVisualconfirmationWesternblotUVSpectrophotometryAbsorbance@280nmDuemostlytoTrp[Protein]calculatedwithBeer’sLawColorimetricTechniquesColorchangeproportionalto[protein]Bradford,Lowry,BCAJ.S.C.OlsonandJohnMarkwell.

CurrentProtocolsinProteinScience(2007)3.4.1-3.4.291：未加IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒；2：IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒；3：空白孔；4：純化后的重組蛋白圖1.8重組蛋白的Westernblot分析26kDa1243Anti-6×Hisantibody第39頁,共52頁，星期六，2024年，5月FinalstepsinpurificationCheckpuritybydetectionmethodsConcentrateyourproteinPrecipitationCentriconsSmallcolumnwithhighbindingcapacityChooseastoragebufferandstorageconditionsConsiderintendeduseofproteinStabilizingadditivesFlashfreezeproteinandstoreat-80oCConfirmidentityofpurifiedproteinMassspectrometrysequencingAnalyticalassays第40頁,共52頁，星期六，2024年，5月Helpfulreferencesandguides附件：Protein_Expression_Protocol_3th.docpETsystemmanual,Novagen,11thEditionAmershamBiosciences“Proteinpurificationhandbook.”18-1132-29,EditionAC.GotofollowingURLanddownloadpdfofProteinPurificationHandbook:AffinityPurification:Arnau,J.,Lauritzen,C.,Petersen,G.E.,Pedersen,J.Prot.Expr.Purif.48(2006)1-13.J.S.C.OlsonandJohnMarkwell.CurrentProtocolsinProteinScience(2007)3.4.1-3.4.29第41頁,共52頁，星期六，2024年，5月Part2：抗體制備、應(yīng)用

第42頁,共52頁，星期六，2024年，5月單抗制備多抗制備：附件抗體鑒定效價特異性第43頁,共52頁，星期六，2024年，5月PrincipleofMcAbProduction第44頁,共52頁，星期六，2024年，5月抗原經(jīng)FCA或FIA充分乳化后免疫家兔。首次免疫佐劑用FCA，第二、三次用FIA。家兔脊柱兩旁選5點皮下注射，每點注攝0.2ml，間隔后2周選不同點注射，每次免疫的抗原量約

350μg/兔。第三次免疫后10天，耳動脈取血檢測抗體效價。雙相瓊脂擴散實驗效價至少達到1:16；ELISA效價達到105即可放血。最后一次取血采用頸動脈放血。新西蘭兔（附件）第45頁,共52頁，星期六，2024年，5月圖1.9兔多克隆抗體效價測定-瓊脂糖凝膠免疫擴散試驗