植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告葉綠體色素的提取、分離、理化性質(zhì)和葉綠素含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱(chēng)： 植物生理學(xué)及實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)類(lèi)型：探索、綜合或驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱(chēng)：葉綠體色素的提取、分離、理化性質(zhì)和葉綠素含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笳莆罩参镏腥~綠體色素的提取分離和性質(zhì)鑒定、定量分析的原理和方法實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理以青菜為材料，提取和分離葉綠體色素并進(jìn)行理化性質(zhì)測(cè)定和葉綠素含量分析。原理如下：葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素均不溶于水而溶于有機(jī)溶劑.常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。皂化反應(yīng)。葉綠素是二羧酸酯，與強(qiáng)堿反應(yīng)，形成綠色的可溶性葉綠素鹽，就可與有機(jī)溶劑中的類(lèi)胡蘿卜素分開(kāi)。取代反應(yīng)。在酸性或加溫條件下，葉綠素卟啉環(huán)中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去鎂葉綠素和綠色的銅代葉綠素。

H+取代Mg2+,Cu2+(Zn2+)取代H+。葉綠素受光激發(fā)，可發(fā)出紅色熒光，反射光下可見(jiàn)紅色熒光。透射光下呈綠色，反射光下呈紅色。光譜分析。葉綠素吸收紅光和蘭紫光，紅光區(qū)可用于定量分析，其中645和663用于定量葉綠素a,b及總量，而652可直接用于總量分析。三、主要儀器設(shè)備天平（萬(wàn)分之一）、可掃描分光光度計(jì)（UV-1240）、離心機(jī)研具、各種容（量）器、酒精燈等四、操作方法與實(shí)驗(yàn)步驟定性分析稱(chēng)取鮮葉3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成勻漿取勻漿過(guò)濾，并倒入三角瓶中，同時(shí)觀察熒光現(xiàn)象。取三角瓶中約1ml溶液于小試管。加KOH數(shù)片劇烈搖均，加石油醚1ml和H2O1ml分層后觀察。取代反應(yīng)：加醋酸約1ml，取1/2加醋酸銅粉加熱。觀察顏色變化。葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的吸收光譜測(cè)定：取皂化反應(yīng)的上層黃色石油醚溶液→稀釋?zhuān)?70nmOD0.5-1）取下層綠色溶液（留1/3），反復(fù)用石油醚粹取,直到無(wú)類(lèi)胡蘿卜素,離心得葉綠素(鹽)→稀釋?zhuān)?63nmOD0.5-1）兩者在400-700nm處掃描光譜，分別測(cè)定類(lèi)胡蘿卜素和葉綠素的吸收峰葉綠素定量分析：鮮葉0.1g，加1.9mlH2O，磨成勻漿，取2份0.2ml加95%酒精4.8ml,搖勻，8000轉(zhuǎn)離心5min,上清液在645，652，663測(cè)定OD，計(jì)算Chla,Chlb和Chl總量的值。五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理1、定性分析：觀察熒光現(xiàn)象，透射光為綠色，反射光為紅褐色光。皂化反應(yīng)(3ml)：上層呈黃色，為類(lèi)胡蘿卜素，吸收藍(lán)紫光。下層呈綠色，為葉綠素，吸收紅光和藍(lán)紫光。圖表SEQ圖表\*ARABIC1圖表SEQ圖表\*ARABIC2圖表SEQ圖表\*ARABIC3圖表SEQ圖表\*ARABIC1圖表SEQ圖表\*ARABIC2圖表SEQ圖表\*ARABIC3圖表SEQ圖表\*ARABIC4圖一在411nm以及432nm波長(zhǎng)處吸收光譜出現(xiàn)峰值，都位于藍(lán)紫光的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，根據(jù)類(lèi)胡蘿卜素吸收藍(lán)紫光的特性，可以推測(cè)圖二是類(lèi)胡蘿卜素的吸收光譜。圖二在424nm左右及644nm左右波長(zhǎng)處吸收光譜出現(xiàn)峰值，兩者分別位于藍(lán)紫光和紅光的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，根據(jù)葉綠素吸收藍(lán)紫光和紅光的特性，可以推測(cè)圖一是葉綠素的吸收光譜。3、葉綠素定量分析：將數(shù)值代入式子，計(jì)算得：波長(zhǎng)/nm645652663OD第一組0.0870.1160.205第二組0.0810.1150.206第三組0.0880.1210.207平均0.0850.1170.206Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69OD645=12.7*0.206-2.69*0.087=2.38mg/LCb(mg/L)=22.9OD645-4.68OD663=22.9*0.085-4.68*0.206=0.982mg/LCT(mg/L)=Ca+Cb=3.36mg/LChla含量(mg/g.FW)=（Ca(mg/L)/1000）*2/0.1*5/0.2=1.19mg/g.FWChlb含量(mg/g.FW)=（Cb(mg/L)/1000）*2/0.1*5/0.2=0.491mg/g.FWChl總含量(mg/g.FW)=（CT(mg/L)/1000）*2/0.1*5/0.2=1.68mg/g.FW六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1、定性實(shí)驗(yàn)中，各組實(shí)驗(yàn)觀測(cè)是顏色變化基本相同，區(qū)別只是顏色的深淺，與研磨時(shí)加入的葉片量、研磨的程度等因素有關(guān)。2、從定量實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的計(jì)算結(jié)果來(lái)看，實(shí)驗(yàn)所用的葉片，葉綠素a的含量大約是葉綠素b的三倍左右。根據(jù)觀察比較其他小組的數(shù)據(jù)，“三倍”大致相同。3、鄰組所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與我們的數(shù)據(jù)有一定差距，分析可能是因?yàn)檠心サ某浞殖潭炔煌退∪~片位置不同，導(dǎo)致葉綠素含量有所區(qū)別。七、討論、心得1、為什么葉綠素吸收紅光和蘭紫光？葉綠素有基態(tài)（G），第一單線激發(fā)態(tài)（E1）和第二單線激發(fā)態(tài)（E2）及第三線態(tài)（E3），光子吸收必須遵守普朗克定律。被吸收光子能量必須等于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的能量差。藍(lán)紫光能量大，可使葉綠素分子中的電子躍遷到E2，而紅光能量小，只能使其躍遷到E1，故葉綠素只能吸收藍(lán)紫光和紅光。2、為什么可用皂化后的葉綠素鹽來(lái)測(cè)定葉綠素的吸收光譜？因?yàn)橛捎谌~綠素皂化反應(yīng)后的葉綠素鹽并不影響葉綠素分子的骨架結(jié)構(gòu)，葉綠素對(duì)光的吸收規(guī)律與葉綠素鹽對(duì)光的吸收規(guī)律幾乎是相同的，而且皂化反應(yīng)可以從葉綠體色素中只篩選出葉綠素，排除了其他色素的干擾，所以可用皂化后的葉綠素鹽來(lái)測(cè)定葉綠素的吸收光譜。3、如要區(qū)分葉綠素a和b的吸收光譜，可用什么方法。 原理：葉綠素a在645nm和663nm處均有吸收，在645nm處吸光系數(shù)較小，，在663nm處較大；葉綠素b在645nm和663nm處亦都有吸收，但在645nm處吸光系數(shù)較大，在663nm